专利名称：一种稳定同位素¹⁵N标记三肽产品的检测方法
技术领域：
本发明涉及稳定同位素产品的检测方法，尤其涉及一种稳定同位素15N标记 三肽产品的检测方法。
背景技术：
20种氨基酸构成了机体内最重要的一类生物大分子多肽和蛋白质， 一般将50 或50个以下氨基酸残基组成的化合物列入多肽，更长的序列称为蛋白质。目前多 肽和蛋白质都被广泛地作为药物用于疾病的治疗。
随着后基因组计划的到来，蛋白质组研究成为生命科学的最前沿。在用核磁 共振(NMR)研究蛋白质结构以及定量蛋白质组学方面，稳定性同位素(2H、 13C、 15N)标记的多肽和蛋白质，如3肽fMLF (U-13C， U-15N) 、 8肽GFL (U-13C， U-15N)和62AA的蛋白质SH3 Domain (U-15N)等都大有用武之地，使其成为蛋 白质组学领域不可或缺的重要工具。同时，对于多肽和蛋白质类药物的代谢研究也 可以采用稳定性同位素标记的方法跟踪药物在体内的吸收、分布和转化，进行药代 动力学的机理研究。
正因如此，近年来国内外对于稳定性同位素标记的多肽产品需求量也大大增 加。我们采用Fmoc (9-芴甲氧羰基)-固相肽合成法建立了合成各种"N标记多肽 的试验平台，能合成和纯化按照客户需要的序列定制标记多肽产品。要确保提供质 量稳定的产品，标记多肽的纯度及被标记的多肽组分氨基酸的"N丰度的测定至关 重要。
随着科学技术发展的日新月异，各种新的测试技术及检测仪器不断涌现，对 于多肽，无论是在其结构测定还是测序方面均取得了巨大的进展。目前，高效液相 色谱(HPLC)、毛细管电泳(CE)、质谱(MS)及其联用技术已成为了多肽测 定的主要手段，并正得到越来越广泛的应用。
常用的多肽纯度测定是采用高效液相(HPLC)法，采用的标准品已经用可信度高的方法标定，然后在HPLC上用外标法检测每批产品的纯度，可制作标准曲 线或单点校正。包括反相、离子交换和疏水性相互作用在内的HPLC技术都可用 于检测多肽的纯度。对胰岛素的鉴别和含量测定，中国药典2000版和美国药典23 版均采用了 HPLC检测方法。另外谷胱甘肽、胸腺肽、降血压肽等多肽也采用HPLC 方法检测纯度。但与HPLC联用的紫外或荧光检测器无法分辨性质相近的组分间 的细小差别，可能会造成结果的偏差。同时，HPLC法采用的标准品和样品浓度一 般配制为lmg/ml，这种方法对于价格昂贵，客户需求以毫克计的稳定同位素标记 多肽的检测用量过大，成本过高。
高效毛细管电泳(HPCE)法也可开始运用于多肽产物的纯度分析，与HPLC相 比，HPCE分离效率更高、上样量更少，是一种灵敏的蛋白质多肽纯度检测方法。 胰岛素、生长抑制素等多肽药物已有用HPCE进行纯度分析的报道。HPCE较差 的检测限是该分析方法在纯度分析应用上的一个限制。
质谱(MS)用于多肽和蛋白分析已逐渐普及开来，如电喷雾(ESI)和基质 辅助激光解吸电离(MALDI)。它们都是采用软电离技术，解决了生物大分子难 挥发、不易气化的问题。电喷雾质谱(ESI)是运用最多的软电离技术，它利用位 于一根毛细管和质谱仪进口间的电势差生成离子，在电场的作用下产生以喷雾形式 存在的带电液滴，当使用干燥气或加热时，溶剂蒸发，液体体积縮小，最终生成去 溶剂化离子。电喷雾电离的特征之一是可生成高度带电的离子而不发生碎裂，这样 可将质荷比降低到各种不同类型的质量分析仪都能检测的程度。通过检测带电状 态，可计算离子的真实分子量。ESI的一大优势是可方便地与分离技术联用，例如 在使用ESI离子化前使用HPLC和毛细管电泳(CE)可方便地除去待测物中的杂 质。
目前，质谱多运用于多肽和蛋白的定性分析，如分子量测定和序列测定，因 为不同的物质电离程度不同，难以找到可靠的内标物，最理想的内标物是采用稳定 性同位素标记的同序列多肽，而这些多肽价格昂贵、不易得，因此，质谱用于多肽 和蛋白的准确定量受到局限。
如上所述，对于以相应的氨基酸为原料，通过Fmoc固相肽合成法制备的稳定 性同位素"N标记三肽，其产品主要技术指标有两项产品的纯度和"N丰度值。 目前，分析药物用普通多肽，国内大多采用高效液相色谱(HPLC)法，但该方法
一般进样量较大，不适合做价格昂贵的"N标记多肽的分析，且不能满足同位素丰
度分析的要求；同时，"N标记三肽中存在部分"N标记的情况，无法像一般全"N 标记多肽产品一样直接利用质谱准确测定其15N丰度值。

发明内容
本发明的目的就是为了克服上述现有技术存在的缺陷而提供一种操作简单、标 样价廉易得、结果准确可靠的稳定同位素"N标记三肽产品的检测方法。 本发明的目的可以通过以下技术方案来实现
一种稳定同位素"N标记三肽产品的检测方法，其特征在于，该方法以"N标 记三肽产品组分之一的氨基酸为检测对象，以该产品组分氨基酸之一的普通氨基酸 为外标物，采用高效液相色谱-质谱联用技术进行稳定同位素15N标记三肽产品的 纯度检测，同时实现该产品的组分氨基酸的"N丰度检测。
所述的稳定同位素"N标记三肽产品是用Fmoc-固相肽合成法合成的"N标记 三肽产品。
所述的稳定同位素15N标记三肽产品和外标物以同样方法水解处理后采用高 效液相色谱-质谱联用技术进行检测。
所述的外标物的纯度>98% (m/m)。
所述的高效液相色谱-质谱联用技术中高效液相色谱仪为分离设备，质谱仪为 检测设备， 一次进样完成稳定同位素15N标记三肽产品的纯度和同位素丰度的检
所述的质谱为电喷雾质谱。
同一蛋白或多肽物质，以稳定性同位素标记后电离情况不会改变，因此可用稳 定性同位素标记的多肽和蛋白作内标物来检测未标记的同一多肽或蛋白。利用这一 思路，进行反向操作，也可以用普通多肽作为内标检测我们生产的稳定同位素标记 多肽的纯度。本发明对于稳定性同位素标记三肽，选用其组分之一的氨基酸作为检 测标准，避免了同序列普通三肽需要定制且保藏要求较高等不便，在将选定的普通 氨基酸和"N标记三肽样品进行同样的水解处理后，用外标法检测"N标记三肽样 品的纯度，并同时实现其组分氨基酸的15N同位素丰度的检测。
本发明采用液相色谱-电喷雾质谱联用仪，以液相色谱为进样分离器，电喷雾
质谱为检测器， 一次进样完成稳定性同位素"N标记多肽的纯度和丰度的测定，样 品浓度为2ug/mL 6ug/mL，同时本发明采用与稳定性同位素15N标记三肽组分之 一的普通氨基酸作为外标，实现稳定性同位素"N标记三肽的纯度测定。
与现有技术相比，本发明不仅具有参考标准样品价廉易得、易于保存、样品处 理方法简便易行的优点，而且保证了检测结果的准确度和精密度，是本领域中迫切 需要的一种简单易行、准确可靠的检测稳定性同位素"N标记多肽产品纯度和15N 丰度的分析方法。
具体实施例方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步说明。
本发明采用的分析方法是将15N标记三肽产品进行水解后做高效液相色谱-质 谱(HPLC-MS)联用，这样既可以通过HPLC实现对产品水解得到的相应氨基酸 的分离，利用电喷雾MS实现对各水解15N标记氨基酸的15N丰度值实现了测定； 与此同时，可以选用待测三肽组分氨基酸之一的普通氨基酸适量进行与标记三肽同 样的水解处理后作为外标，实现对"N标记三肽的纯度测定。本发明具体如下
1. 样品水解
称量(0.5 1.0) mg"N标记三肽，精确到0.01mg，将称好的样品置于水 解管中，再将水解管置于干燥反应瓶中，真空干燥备用，向反应瓶中加入600pL 含1%苯酚的6mol/L盐酸溶液，用氮气置换瓶内空气15s，并在氮气保护状态 下拧紧反应瓶螺丝盖，将反应瓶置于(150±5) t:的恒温干燥箱内水解2 3小 时，取出冷却至室温，将水解管外壁的盐酸擦去，放入另一干燥反应瓶中真空 千燥1小时。同时称取适量的氨基酸对照品，采用同样的方法处理备用。
2. 样品检测条件 (1)色谱条件
色谱柱C18 (150mmx4.6mm， 5|im)
柱温室温 进样量5pL 检测波长PDA全波段 流速0.3ml/min 流动相甲醇-水溶液(1: 1) 洗脱条件等度洗脱 (2)质谱条件
离子化模式大气压电喷雾离子源(ESI) 喷雾电压2800 V 雾化气压力20psi 辅助气压力10psi 离子传输毛细管温度270 °C 扫描模式SIM
扫描宽度m/z= (M， M+l、 M+2)
将水解处理得到的"N标记三肽试样用1: 1的甲醇/水溶液溶解，抽滤试
液，以自动进样方式进行液相色谱和质谱联用检测其纯度与"N丰度值。 3. 15N标记三肽纯度和15N丰度值的测定
利用LC-MS测定多肽水解物中某个氨基酸(相应信号最强)的含量，从 而得出自制多肽样品的纯度。由于"N和"N对分子在质谱电离室中离子化程 度的影响几乎相同，所以试验利用非标记氨基酸做标样，绘制标准曲线，实现 对三肽的定量分析。
此测定中液相色谱作为进样器并起到分离各不同氨基酸组分的作用，在质 谱的总离子流图中的各个氨基酸峰最高处选取1 2点得到相应质谱图，取各 氨基酸及其相应同位素峰的平均值作为计算相应氨基酸的15N同位素丰度值的 依据。
本发明样品消耗量较小，外标样品价廉易得，便于保存，适用于批合成量在 毫克级的"N标记三肽的分析测定。 实施例1
一种稳定性同位素"N标记三肽MLF (蛋氨酸-亮氨酸-苯丙氨酸)的检测 方法，该方法具体如下
先将样品进行水解处理称量约0.5mg15N标记三肽(MLF-15N2)，精确 到0.01mg，将称好的样品置于水解管中，再将水解管置于干燥反应瓶中，真空 干燥备用，向反应瓶中加入600pL含P/。苯酚的6mol/L盐酸溶液，用氮气置换
瓶内空气15s，并在氮气保护状态下拧紧反应瓶螺丝盖，将反应瓶置于(150土5) "C的恒温干燥箱内水解2 3小时，取出冷却至室温，将水解管外壁的盐酸擦 去，放入另一干燥反应瓶中真空干燥1小时。同时称取适量的苯丙氨酸样品(纯 度>98%)，采用同样的方法处理备用。 标准曲线的绘制和三肽样品的检测
准确称取已经水解处理的苯丙氨酸样品5.51mg (精确至O.Olmg)，置于 50mL容量瓶中，加甲醇-水溶液(1: 1)溶解并稀释至刻度，摇匀，精密量取 该溶液0.2mL、 0.3mL、 0.4mL、 0.6mL分别置于10mL容量瓶中，加甲醇-水溶 液(1: 1)溶解并稀释至刻度，摇匀，将其编号并确定样品序列待测。
称取已经水解处理的稳定性同位素标记三肽样品约0.4mg (精确至 O.Olmg)，置于50mL容量瓶中，加甲醇-水溶液(1: 1)溶解并稀释至刻度， 摇匀，精密量取该溶液4.1mL置于10mL容量瓶中，加甲醇-水溶液(l: l)溶 解并稀释至刻度，摇匀，将此样品编入苯丙氨酸校准样品序列，由高效液相色 谱仪自动控制进样分离，由电喷雾质谱进行检测。
色谱条件和质谱条件如上述"2.样品检测条件"所述。
记录质谱总离子流的强度，以浓度为横坐标，离子流强度的峰面积为纵坐 标，绘制标准曲线。重复3次进样，按外标法计算"N标记苯丙氨酸的含量实 现"N标记三肽含量的表征分别为99.5%， 98.9%， 100.3%。其含量测定结果 为99.5%。
在"N标记三肽的质谱总离子流图的各个氨基酸的峰中心位置获取相应的 质谱图，由质核比为M、 M+l、 M+2的峰强度积分数据代入公式(1)计算可 得苯丙氨酸酸的15N同位素丰度为96.41atomy。"N，亮氨酸的15N同位素丰度为 97.47atom%15N，蛋氨酸未被标记。
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E —被测"N标记三肽氨基酸组分的同位素丰度，单位为a"/。 15N;
1[M] —未被"N标记的氨基酸分子离子峰相对强度； 1[M+i] — "N标记氨基酸分子离子峰的相对强度；
1[M+21—"N标记氨基酸中天然丰度"C的贡献的分子离子峰相对强度和；
n—被测氨基酸中所含有的碳原子数；
O.Oll—自然界碳元素中"C同位素的百分含量。
实施例2
一种稳定性同位素"N标记三肽AFG (丙氨酸-苯丙氨酸-谷氨酸)的检测 方法，该方法具体如下
先将样品进行水解处理称量约0.5mg15N标记三肽(AFG-15N2)，精确 到0.01mg，将称好的样品置于水解管中，再将水解管置于干燥反应瓶中，真空 干燥备用，向反应瓶中加入600pL含1%苯酚的6mol/L盐酸溶液，用氮气置换 瓶内空气15s，并在氮气保护状态下拧紧反应瓶螺丝盖，将反应瓶置于(150±5) "C的恒温干燥箱内水解2 3小时，取出冷却至室温，将水解管外壁的盐酸擦 去，放入另一干燥反应瓶中真空干燥1小时。同时称取适量的苯丙氨酸校准样 品(纯度>98%)，采用同样的方法处理备用。
标准曲线的绘制和三肽样品的检测
准确称取己经水解处理的苯丙氨酸校准样品5.1mg (精确至0.01mg)，置 于50mL容量瓶中，加甲醇-水溶液(1: 1)溶解并稀释至刻度，摇匀，精密量 取该溶液0.2mL、 0.3mL、 0.4mL、 0.6mL分别置于10mL容量瓶中，加甲醇-水溶液(1: 1)溶解并稀释至刻度，摇匀，将其编号并确定样品序列待测。
称取已经水解处理的稳定性同位素标记三肽AFG (丙氨酸-苯丙氨酸-谷氨 酸)样品约0.4mg (精确至0.00001g)，置于10mL容量瓶中，加甲醇-水溶液 (1: l)溶解并稀释至刻度，摇匀，精密量取该溶液lmL置于10mL容量瓶中， 加甲醇-水溶液(1: 1)溶解并稀释至刻度，摇匀，将此样品编入苯丙氨酸校准 样品序列，由高效液相色谱仪自动控制进样分离，由电喷雾质谱进行检测。
色谱条件和质谱条件如上述"2.样品检测条件"所述。
记录质谱总离子流的强度，以浓度为横坐标，离子流强度的峰面积为纵坐 标，绘制标准曲线。重复3次进样，按外标法计算"N标记苯丙氨酸的含量实 现15N标记三肽AFG含量的表征分别为99.8%， 100.5%， 101%。其含量测 定结果为100.4%。
在"N标记三肽的质谱总离子流图的各个氨基酸的峰中心位置获取相应的
质谱图，由质核比为M、 M+l、 M+2的峰强度积分数据代入公式(1)计算可 得苯丙氨酸酸的15N同位素丰度为96.50atomn/。"N，谷氨酸的15N同位素丰度为 97.10atom%15N，丙氨酸未被标记。
权利要求
1.一种稳定同位素15N标记三肽产品的检测方法，其特征在于，该方法以15N标记三肽产品组分之一的氨基酸为检测对象，以该产品组分氨基酸之一的普通氨基酸为外标物，采用高效液相色谱-质谱联用技术进行稳定同位素15N标记三肽产品的纯度检测，同时实现该产品的组分氨基酸的15N丰度检测。
2. 根据权利要求1所述的稳定同位素15N标记三肽产品的检测方法，其特征 在于，所述的稳定同位素15N标记三肽产品是用Fmoc-固相肽合成法合成的15N标 记三肽产品。
3. 根据权利要求1所述的稳定同位素15N标记三肽产品的检测方法，其特征 在于，所述的稳定同位素15N标记三肽产品和外标物以同样方法水解处理后采用高 效液相色谱-质谱联用技术进行检测。
4. 根据权利要求1所述的稳定同位素15N标记三肽产品的检测方法，其特征 在于，所述的外标物的纯度>98% (m/m)。
5. 根据权利要求1所述的稳定同位素15N标记三肽产品的检测方法，其特征 在于，所述的高效液相色谱-质谱联用技术中高效液相色谱仪为分离设备，质谱仪 为检测设备， 一次进样完成稳定同位素15N标记三肽产品的纯度和同位素丰度的检测.
6. 根据权利要求1所述的稳定同位素15N标记三肽产品的检测方法，其特征 在于，所述的质谱为电喷雾质谱。
全文摘要
本发明涉及一种稳定同位素¹⁵N标记三肽产品的检测方法，该方法以¹⁵N标记三肽产品组分之一的氨基酸为检测对象，以该产品组分氨基酸之一的普通氨基酸为外标物，采用高效液相色谱-质谱联用技术进行稳定同位素¹⁵N标记三肽产品的纯度检测，同时实现该产品的组分氨基酸的¹⁵N丰度检测。与现有技术相比，本发明不仅具有参考标准样品价廉易得、易于保存、样品处理方法简便易行的优点，而且保证了检测结果的准确度和精密度，是本领域中迫切需要的一种简单易行、准确可靠的检测稳定性同位素¹⁵N标记多肽产品纯度和¹⁵N丰度的分析方法。
文档编号G01N27/64GK101344520SQ200810041950
公开日2009年1月14日 申请日期2008年8月21日 优先权日2008年8月21日
发明者刘卫霞, 宋明鸣, 廖晓全, 亮 张, 李美华, 杜晓宁 申请人:上海化工研究院