专利名称：鱼类淋巴囊肿病毒检测试纸及其制备方法
技术领域：
本发明涉及一种鱼类淋巴囊肿病毒检测试纸及其制备方法，其属于免疫学和病毒 学交叉技术领域。
背景技术：
淋巴囊肿病毒(Lymphocystis disease virus, LCDV)，隶属虹彩病毒科 (Iridoviridae)，淋巴囊肿病毒属(Lymphocystivirus)，可引起世界各地的34科140种以 上的淡水、半咸水和海水鱼类发生淋巴囊肿病。1997年鱼类淋巴囊肿病在我国山东牙鲆养 殖场首次大规模暴发，随后在河北、广东、浙江等地均发生过，其感染率可高达80%，死亡率 可达30%，给水产养殖业带来巨大的经济损失。患病鱼的表皮、鳍、鳃和尾部等处出现大小 不一的囊肿物，一旦淋巴囊肿细胞破裂，病毒粒子释放出来，可引起全身性感染，还易形成 开放式溃疡面，导致寄生虫、细菌等其他病原体的继发性感染。与其他的病毒病一样，鱼类 淋巴囊肿病缺乏有效的治疗药物。因此，养殖生产中急需IXDV的快速检测技术，以期达到 早发现早预防的目的。目前国内外检测鱼类IXDV的方法大致包括组织病理及透射电镜观察、细胞培养 法、免疫荧光技术、斑点免疫印迹技术、PCR法及核酸杂交法等。这些方法操作较复杂且耗 时较长，对技术人员要求较高，需要一定的实验仪器设备，不适用在基层养殖场进行实时检 测，因此研制一种简便快速现场检测鱼类LCDV的方法势在必行。

发明内容
针对上述问题，本发明的目的是提供一种鱼类淋巴囊肿病毒检测试纸。本发明提供的鱼类淋巴囊肿病毒检测试纸，包括载体板、样品垫、结合垫、硝酸纤 维素膜检测层和吸水垫，所述样品垫和吸水垫位于载体板的两端，硝酸纤维素膜检测层位 于载体板的中部，其特征在于样品垫与硝酸纤维素膜检测层交界处设有载有金标单抗A的 结合垫，结合垫一端边缘重叠在样品垫之下，另一端边缘重叠在硝酸纤维素膜检测层之上； 硝酸纤维素膜检测层上设有检测线和质控线，检测线靠近样品垫包被有单抗B，质控线靠近 吸水垫包被有羊抗小鼠IgG。本发明的另一个目的是提供一种鱼类淋巴囊肿病毒检测试纸的制备方法。本发明提供的鱼类淋巴囊肿病毒检测试纸的制备方法如下(1)单抗A和单抗B 的制备复苏并培养保藏号为CCTCC-C200419和CCTCC-C200420的杂交瘤细胞株，腹腔注射 BALB/c小鼠，采集腹水，辛酸_硫酸铵法提纯获得单抗A和单抗B。(2)结合垫的制备①胶体金的制备采用微波炉_柠檬酸三钠还原法制得颗粒大 小为20 30nm的胶体金。②金标单抗A的制备将单抗A按合适的比例加入上述①步制成的胶体金中，再加 入牛血清白蛋白，离心纯化后用金标保存液悬起，即为金标单抗A液体。③载有金标单抗A的结合垫的制备将上述②步制成的金标单抗A液体喷涂到玻
3璃纤维上，冷冻干燥。(3)硝酸纤维素膜检测层的制备将调整好浓度的单抗B和羊抗小鼠IgG喷涂于硝 酸纤维素膜检测层上，分别作为检测线和质控线，晾干后封闭液中浸泡。(4)鱼类淋巴囊肿病毒检测试纸的制作在载体板上顺次贴上硝酸纤维素膜检测 层、吸水垫、结合垫和样品垫，再用切条机切成3mm宽的试纸，即成本发明试纸。本发明采用双抗体夹心免疫层析原理，即若检测样品中含有IXDV，金标单抗A与 LCDV结合，形成金标单抗A-LCDV复合物，当该复合物层析至硝酸纤维素膜检测层的检测 线时，预先包被在此处的单抗B识别复合物中IXDV，形成金标单抗A-LCDV-单抗B的夹心 结构，单抗A上标记的胶体金颗粒在此处固定并累积显现肉眼可见的红色，未与IXDV反应 的游离金标单抗A继续前行，到达预先包被在质控线上的羊抗小鼠IgG处时，抗体类型为 IgG的金标单抗A与其结合，形成金标单抗A-羊抗小鼠IgG复合物，在质控线处也出现由 胶体金颗粒固定并累积显现肉眼可见的红色，其结果是检测线和质控线处均显现红色，表 示IXDV阳性；若检测样品中不含IXDV，检测线处不显现红色，只在质控线处显现红色，表示 LCDV阴性；若质控线处不显现红色，说明试纸失效，检测结果无效。本发明具有以下优点(1)检测快速，5 IOmin可出现肉眼可见结果；(2)操作简 便，不需要专业人员；(3)检测成本低，无需专业仪器设备，适合现场检测；(4)灵敏度高，特 异性强，具可重复性；(5)储存方便，稳定性好，室温下有效期6个月，4°C下有效期12个月。


图1是本发明的结构示意图。图2是本发明检测结果示意图。图3是本发明检测结果实物图。其中，1、载体板；2、样品垫；3、结合垫；4、硝酸纤维素膜检测层；5、吸水垫；6、检测 线；7、质控线。
具体实施例方式下面结合附图并通过具体实施例来进一步说明本发明。本发明所用仪器及试剂倒置显微镜(购自OLYMPUS公司)；高速冷冻离心机 (SIGMA公司)；喷膜仪(购自BIODOT公司)；氯金酸(购自中国上海试剂一厂，分析纯)；梓 檬酸三钠(购自中国上海试剂一厂，分析纯)；RPMI 1640 (购自HYCL0NE公司)；羊抗小鼠 IgG(购自SIGMA公司)；牛血清白蛋白(购自SIGMA公司)；Tween-20 (购自SIGMA公司)； 硝酸纤维素膜(购自WHATMAN公司)。实施例1.鱼类淋巴囊肿病毒检测试纸的制备。(1)单抗A和单抗B的制备复苏并培养保藏号为CCTCC-C200419和CCTCC-C200420 的杂交瘤细胞株，腹腔注射液体石蜡于8 10周龄健康BALB/c小鼠，每只0. 5mL, 7天后腹 腔注射培养至对数期的杂交瘤细胞，每只1 X IO6个细胞。10 15天后收集腹水，3000rpm, 4°C离心lOmin，去除沉淀取上清液，上清液经辛酸-硫酸铵法提纯获得单抗A和单抗B。(2)胶体金标记单抗A的制备①胶体金的制备取0. 01 %氯金酸溶液IOOmL,放入微 波炉中，高档火沸腾2min，迅速一次性加入一定量的柠檬酸三钠溶液，放入微波炉中，中低档火继续加热3min，冷却至室温补足失水，制成颗粒大小为20 30nm的胶体金。用 0. lmol/L碳酸钾溶液调节pH值为8. 2，4°C保存。②目测法确定胶体金与单抗A的最佳标记量取7只试管各加入ImL胶体金，再分 别加入0、5、10、15、20、25、3(^8的待标记单抗4，震荡混合20min，室温静置IOmin0接着向 每管加入100 L 10%氯化钠溶液，震荡混合lOmin，室温静置2h以上观察结果。未加单 抗或者单抗量不足的试管，胶体金不稳定形成由红色变成蓝紫色的聚沉现象，加入单抗的 量到达或超过最低稳定量的试管，胶体金颜色保持红色不变。使胶体金保持红色的最小单 抗量即为标记胶体金所需要的最小单抗量，在此基础上加上20%的单抗量即为标记胶体金 的单抗实际使用量。③金标单抗A的制备取胶体金按合适的比例加入单抗A，缓慢搅动30min后，再向 其中加入牛血清白蛋白(BSA)至终浓度为1%，继续搅拌20min。将上述溶液经3000rpm， 4°C离心20min，去除沉淀取上清液，再将上清液经13500rpm，4°C离心30min，弃去上清液得 沉淀，沉淀用金标抗体洗涤液(含BSA的0. 01mol/L pH 7. 4PBS)洗涤，再次离心，吸去 上清液得到的沉淀即为金标单抗A。将沉淀悬浮于金标抗体保存液(含蔗糖，1%BSA， 0. 1% Tween-20 和 0. 02%叠氮钠的 0. 01mol/L pH 7. 4PBS)中，4°C保存。(3)结合垫3的制备将金标单抗A液体均勻喷涂到玻璃纤维上，冷冻干燥。(4)硝酸纤维素膜检测层4的制备用0. 01mol/L pH 7. 4PBS调整单抗B的浓度 为lmg/mL，用喷膜仪将其喷涂于硝酸纤维素膜检测层上，作为检测线6。同样，调整羊抗小 鼠IgG的浓度为500 ？ g/mL,将其喷涂于硝酸纤维素膜检测层上，作为质控线7，两线相 距5mm，质控线7靠近吸水垫5，检测线6靠近样品垫2。将包被好的硝酸纤维素膜检测层 干燥后，于 37°C封闭液(含 2% BSA 的 0. 01mol/L pH 7. 4PBS)中浸泡 lh，PBST(含 0. 05% Tween-20 的 0. 01mol/L pH 7. 4PBS)漂洗，干燥。(5)本发明的鱼类淋巴囊肿病毒检测试纸的制作①鱼类淋巴囊肿病毒检测试纸板 的组装戴上手套，在载体板1的一侧顺次粘贴上硝酸纤维素膜检测层4、结合垫3、样品垫2 和吸水垫5，组装成试纸板。在试纸板的吸水垫5表面贴上彩色不干胶纸，样品垫2和结合 垫3表面贴上带有MAX线标签的不干胶纸。其中硝酸纤维素膜检测层4的上边缘重叠在吸 水垫5下边缘之下，硝酸纤维素膜检测层4下边缘重叠在结合垫3上边缘之下，样品垫2的 上边缘重叠在结合垫3下边缘之上。(见图1)②鱼类淋巴囊肿病毒检测试纸的制作将贴有 不干胶纸的试纸板放入切条机槽内切割成3mm宽的试纸，将切好的试纸放入装有干燥剂的 铝箔袋内封口，即成本发明试纸。实施例2.鱼类淋巴囊肿病毒检测试纸的使用方法(1)检测样品的制备取待检鱼 类组织(表皮、鳃、鳍、胃、肠等)，按1 10 (W/V)与TNE缓冲液混合，加入适量石英砂用研 钵研磨，7000 SOOOrpm冰浴勻浆，取上清液作为检测样品。(2)鱼类淋巴囊肿病毒检测试纸的使用手持试纸的吸水垫5 —端将样品垫4 一端 浸入检测样品中，液面不要超过标志线“MAX”，平放试纸，5 IOmin内观察结果。(3)结果判断①阳性结果硝酸纤维素膜检测层4质控线6和检测线7均出现红 色，表示有IXDV感染。②阴性结果硝酸纤维素膜检测层4只质控线6出现红色，表示无LCDV感染。③无效结果硝酸纤维素膜检测层4质控线6无红线出现，表示操作有问题或试纸
5失效(见图2)。实施例3.鱼类淋巴囊肿病毒检测试纸灵敏度的测定(1)免疫层析法测试灵敏度 试验用试纸检测梯度稀释的鱼类LCDV提纯液。结果可以检测到的最低病毒量为1 μ g/mL。(2)免疫金银染色法增强灵敏度试验免疫层析法检测完毕后，将待加强的试纸用 洗涤液(含 0. 5%氯化钠，0. 5%Tween-20 的 0. 05mol/L pH 8. 2Tris_ 盐酸)洗涤 2 3min， 再于0.05mol/L pH 3. 8的柠檬酸盐缓冲液中平衡5min。放入银显影液中避光显色10 20min，蒸馏水洗涤。移入定影液(20%硫代硫酸钠，15%亚硫酸钠)中lmin，蒸馏水洗涤， 自然干燥。结果免疫金银染色可以将试纸的灵敏度提高至0. 01 μ g/mL。表1最低病毒量的测定结果
++表示较强阳性；+表示阳性；-表示检测线无色为阴性。实施例4.鱼类淋巴囊肿病毒检测试纸的特异性、重复性和稳定性测试(1)特异性 试验选择3组样品，第1组样品鱼类LCDV粗提液。第2组样品患淋巴囊肿病鱼类的组织 勻浆上清液。第3组样品正常鱼类的组织勻浆上清液。用试纸检测以上3组样品并与PCR 法比较。检测结果一致第1、2组样品为阳性，第3组样品为阴性。(见图3)(2)重复性试 验用不同批次的试纸检测以上3组样品，每个批次试纸重复检测5次，结果无明显差异。(3)稳定性试验将试纸放入室温与4°C下，每15天用试纸检测以上3组样品一次。 结果室温下保存时有效期为6个月，4°C下保存时有效期为12个月。本领域的普通技术人员都会理解，在本发明的保护范围内，对于上述实施例进行 修改，添加和替换都是可能的，其都没有超出本发明的保护范围。
权利要求
一种鱼类淋巴囊肿病毒检测试纸，包括载体板、样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜检测层和吸水垫，所述样品垫和吸水垫位于载体板的两端，硝酸纤维素膜检测层位于载体板的中部，其特征在于样品垫与硝酸纤维素膜检测层交界处设有载有金标单抗A的结合垫，结合垫一端边缘重叠在样品垫之下，另一端边缘重叠在硝酸纤维素膜检测层之上；硝酸纤维素膜检测层上设有检测线和质控线，检测线靠近样品垫包被有单抗B，质控线靠近吸水垫包被有羊抗小鼠IgG。
2.一种如权利要求1所述鱼类淋巴囊肿病毒检测试纸的制备方法，其特征在于它包括 如下步骤(1)单抗A和单抗B的制备复苏并培养保藏号为CCTCC-C200419和CCTCC-C200420的杂交瘤细胞株，腹腔注射 BALB/c小鼠，采集腹水，辛酸-硫酸铵法提纯获得单抗A和单抗B ；(2)结合垫的制备①胶体金的制备采用微波炉-柠檬酸三钠还原法制得颗粒大小为20 30nm的胶体②金标单抗A的制备将单抗A按合适的比例加入上述①步制成的胶体金中，再加入牛 血清白蛋白，离心纯化后用金标保存液悬起，即为金标单抗A液体；③载有金标单抗A的结合垫的制备将上述②步制成的金标单抗A液体喷涂到玻璃纤 维上，冷冻干燥；(3)硝酸纤维素膜检测层的制备将调整好浓度的单抗B和羊抗小鼠IgG喷涂于硝酸纤维素膜检测层上，分别作为检测 线和质控线，晾干后封闭液中浸泡；(4)鱼类淋巴囊肿病毒检测试纸的制作在载体板上顺次贴上硝酸纤维素膜检测层、吸水垫、结合垫和样品垫，再用切条机切成 3mm宽的试纸，即成本发明试纸。
全文摘要
本发明公开了一种鱼类淋巴囊肿病毒检测试纸，包括载体板、样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜(NC膜)检测层和吸水垫，所述样品垫和吸水垫位于载体板的两端，硝酸纤维素膜检测层位于载体板的中部，其特征在于样品垫与硝酸纤维素膜检测层交界处设有载有金标单抗A的结合垫，该层一端边缘重叠在样品垫之下，另一端边缘重叠在硝酸纤维素膜检测层之上；硝酸纤维素膜检测层上设有检测线和质控线，检测线靠近样品垫包被有单抗B，质控线靠近吸水垫包被有羊抗小鼠IgG。本发明具有操作简便、快速，无需专业人员及仪器设备，结果灵敏、准确，可常温下运输、保存等优点。
文档编号G01N33/577GK101893632SQ20101023908
公开日2010年11月24日 申请日期2010年7月29日 优先权日2010年7月29日
发明者宋佳蕾, 战文斌, 绳秀珍, 邢婧 申请人:中国海洋大学