专利名称：一种抗Ⅲ型前胶原氨基末端肽单克隆抗体及其用途的制作方法
技术领域：
本发明涉 及一种抗III型前胶原氨基末端肽单克隆抗体及其用途，属于生物技术 领域。
背景技术：
III型前胶原氨基末端肽(简写为PIIINP)是III型前胶原分泌到细胞外后被蛋白酶 切下的N端肽，前胶原转化为胶原时，被分解下来的前胶原肽可在体内存在一定时间， 血清中的III型前胶原氨基末端肽可作为判定肝纤维化的指标。III型前胶原氨基末端肽与 肝纤维化形成的活动程度密切相关。其升高程度与炎症、坏死和肝纤维化程度有关。与 体内沉积的胶原无关。而是反映肝纤维化发生和发展的动态过程。III型前胶原氨基末端 肽持续升高的慢性活动性肝炎，提示病情可能会恶化并向肝硬变形成发展，而III型前胶 原氨基末端肽降至正常可预示病情缓解，因此，测定血清中III型前胶原氨基末端肽含量 在辅助诊断肝纤维化中具有重要价值。肝纤维化是指肝细胞发生坏死及炎症刺激时，由于细胞外基质的形成和降解的 平衡失调，导致肝脏内纤维结缔组织异常增生的病理过程。临床上对肝纤维化的诊断方 法主要有肝组织病理学诊断、影像学检查及血清学诊断。血清学诊断是研究最广泛的肝 纤维化诊断方法，其最常用的肝纤维化指标有透明质酸、层粘蛋白、III型前胶原氨基末 端肽、IV型胶原等。这些血清学指标的高低与肝纤维化严重程度密切相关，因而可用于 诊断肝纤维化。血清化验的优点是取材方便、容易复查，如果能定期检查(如每半年或 一年)则可以根据这些指标是升高或降低的总趋势来了解肝脏纤维化的发展变化情况， 也能大致了解抗纤维化的治疗的临床效果。除了对肝纤维化进行辅助诊断，有文献报道将血浆III型前胶原氨基末端肽 (PIIINP)作为心肌纤维化的指标，用来评估在急性心肌梗死(AMI)、高血压时心肌纤维 化的情况。闻心培等报道的肺部疾病PIIINP值均增高，反映肺内胶原合成代谢处于活跃 阶段，大量胶原(包括I、II、III型胶原)沉积脏器而致脏器纤维化。基于双抗体夹心法原理的固相酶联免疫法(ELISA)是检测抗原最常用的方法， 在临床检验中，此法适用于检验各种蛋白质等大分子抗原，例如HBsAg、HBeAg, AFP、hCG等。只要获得针对受检抗原的异性抗体，就可用于包被固相载体和制备酶 结合物而建立此法。如应用单克隆抗体，一般选择两个针对抗原上不同决定簇的单抗， 分别用于包被固相载体和制备酶结合物。这种双位点夹心法具有很高的特异性，而且可 以将受检标本和酶标抗体一起保温反应，作一步检测。在一步法测定中，当标本中受检 抗原的含量很高时，过量抗原分别和固相抗体及酶标抗体结合，而不再形成"夹心复合 物"。类同于沉淀反应中抗原过剩的后带现象，此时反应后显色的吸光值(位于抗原过 剩带上)与标准曲线(位于抗体过剩带上)某一抗原浓度的吸光值相同，如按常法测读， 所得结果将低于实际的含量，这种现象被称为钩状效应(hook effect)，因为标准曲线到达 高峰后呈钩状弯落。钩状效应严重时，反应甚至可不显色而出现假阴性结果。但用高亲和力的单克隆抗体制备此类试剂可削弱钩状效应。

发明内容
本发明的目的是提供一种高亲和力的抗III型前胶原氨基末端肽单克隆抗体及其 在双抗体夹心固相酶联免疫法制备的检测试剂盒中的应用，以克服此类试剂容易产生的 钩状效应，提高对III型前胶原氨基末端肽的检测灵敏度和准确性。本发明所提供的抗III型前胶原氨基末端肽单克隆抗体，其特征在于其轻链的 氨基酸残基序列如SEQ ID Nal所示，其重链的氨基酸残基序列如SEQ IDNo.2所示。所述的抗III型前胶原氨基末端肽单克隆抗体，是由保藏号为CCTCC NO.C201058的杂交瘤细胞株4E5F4A11分泌产生。所述的杂交瘤细胞株是以III型前胶原氨基末端肽为免疫源，小鼠为免疫对象， 通过免疫注射小鼠，取免疫小鼠脾脏制备悬液，并使之与骨髓瘤细胞进行细胞融合获得。所述的抗III型前胶原氨基末端肽单克隆抗体，属于IgG亚型。所述的抗III型前胶原氨基末端肽单克隆抗体的腹水效价为1 106。本发明的抗III型前胶原氨基末端肽单克隆抗体可以与III型前胶原氨基末端肽高 度特异性结合，可通过本领域技术人员所公知的的方法，制备成III型前胶原氨基末端肽 的各种检测试剂盒。尤其是，应用本发明的抗III型前胶原氨基末端肽单克隆抗体和双抗 体夹心固相酶联免疫法制备的III型前胶原氨基末端肽的检测试剂盒，不仅可以定量检测 人血清中III型前胶原氨基末端肽的含量，使检测灵敏度能达到0.974ng/ml，检测准确性 在0.9至1.1之间，剂量-反应曲线的线性在0.998以上，批内不精密度小于10%，批间 不精密度小于15%，而且与对比检测试剂配对T检验P值>0.05，与对比检测试剂相关 性 r(Pearson Correlation) > 0.90、P (Sig. (2-tailed)) < 0.01，具有较高的诊断一致性，可 用于临床上对肝纤维化的辅助诊断。


图1为5’ RACE产物电泳图，其中1号为轻链结果，2号为重链结果，M为 DNA Marker。
具体实施例方式下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本 发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领 域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要 求书所限定的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件、实验室手册中 所述的条件或按照制造厂商所建议的条件。实施例1 抗III型前胶原氨基末端肽单克隆抗体的制备一、动物免疫取雌性6 8周龄的BALB/c小鼠，首次免疫用浓度为5mg/ml的III型前胶原氨基末端肽纯品，经腹腔和四肢腋下注射，总量lml。每隔2周以同样的方法加强免疫 1次，共免疫3次，末次免疫后的第4天，从经三次免疫后小鼠眼球采血，离心分离血 清，用ELISA法选出效价高的小鼠准备融合。二、杂交瘤细胞系的制备 完成免疫过程的小鼠准备取脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞SP2/0融合，在融合前一 天制备饲养细胞。融合时无菌下取小鼠脾细胞，与SP2/0细胞以10 1混合，以50% PEG介导融合，离心后重悬于HAT选择性培养基中，接种于含有饲养细胞的96孔微孔板 中，置37°C、5%C02培养箱培养，融合后第3d、第5d、第7d用HAT培养液半量换液， 两周后换用HT培养液。观察杂交瘤细胞的生长情况，等克隆长至孔底面积的1/3 1/2，取培养上清 液，用ELISA法进行抗体检测，筛选阳性克隆。以有限稀释法对阳性孔的杂交瘤细胞 进行克隆化培养，直到克隆化细胞抗体阳性率为100%，选出高分泌特异性细胞株(即 ELISA效价在1 IO6以上的阳性克隆)，此时可将阳性克隆细胞进一步扩大培养。将杂 交瘤细胞经体外连续传代3个月以上和反复冻存、复苏，定期收集上清，用筛选抗体的 方法测定上清中的抗体，直至细胞系能稳定分泌单克隆抗体。三、单克隆抗体的制备和纯化选用成年BALB/c小鼠，腹腔注射0.5ml液体石蜡，1 2周后收集生长状态 良好的单克隆杂交瘤细胞株4E5F4A1该细胞株已在设置于中国武汉大学内的中国典 型培养物保藏中心(CCTCC)保藏，保藏日期为2010年7月1日，保藏号为CCTCC NO.C201058，每只腹腔注射lml。接种2周左右的小鼠腹部可见明显膨大，以颈椎脱 臼法处死后打开腹腔，取出腹水。离心后吸取上清，用硫酸铵沉淀后，再用DEAE离子 交换柱纯化，用PH5.6，20mM的醋酸盐缓冲液洗脱，收集洗脱液。再用亲和层析纯化法 (蛋白A-Sepharose4B柱)继续纯化，上样条件样品和蛋白A_Sepharose4B柱用PH8.2， 1.0M的Tris缓冲液平衡后再上样。洗脱条件用PH3.0，50mM的甘氨酸缓冲液洗脱， 收集洗脱液，制得特异的单克隆抗体。四、单克隆抗体的腹水效价及鉴定取小鼠腹水抗体，用筛选抗体的方法测定效价为1 106，亚型鉴定为IgG型。实施例2 单克隆抗体的特异性鉴定材料透明质酸、层粘蛋白、I型胶原、III型胶原、IV型胶原。方法采用ELISA法检测，以III型前胶原氨基末端肽为阳性对照。结果显示透明质酸、层粘蛋白、I型胶原、III型胶原、IV型胶原均为阴性。说明本发明的抗III型前胶原氨基末端肽单克隆抗体对III型前胶原氨基末端肽 具有高度特异性。虽然邓修惠等通过常规单抗杂交瘤细胞技术也获得了抗III型前胶原氨 基末端肽单克隆抗体，但所述抗体与I型胶原、III型胶原有交叉反应，特异性不高。实施例3 单克隆抗体的可变区序列的克隆与测序采用5，RACE (Rapid Amplification of cDNA Ends，快速扩增 cDNA 末端)技术，
从分泌抗III型前胶原氨基末端肽单克隆抗体的杂交瘤细胞株4E5F4A11中克隆功能性抗 体的可变区序列。其步骤可简述为由一个反义的基因特异性引物(GSPl)来合成cDNA 第一链，cDNA第一链纯化后，利用末端脱氧核苷酸转移酶(Terminal deoxynucleotidytransferase, TdT)在cDNA的3’末端加上一个合成的同聚核苷酸锚定序列。利用第 二个巢式基因特异性引物(GSP2)和一个与同聚核苷酸尾巴可以退火的锚定引物来扩增 cDNA。具体实验过程如下材料-由杂交瘤细胞株4E5F4A11分泌产生的抗III型前胶原氨基末端肽单克隆抗体-大肠杆菌ToplO菌株-pGEM-T Easy 克隆载体引物设计 根据免疫球蛋白基因的特点，设计两套分别对应Ig和Kappa恒定区的基因特异 性引物GSP1、GSP2,引物序列如下pRace-H-GSPl GTCCACCKYGGTSYTGCTGGCYGGGTGpRace-H-GSP2 GCACACYRCTGGACAGGGATCCAGAGTTCCpRace-K-GSPl ACTTGACATTGATGTCTTTGpRace-K-GSP2 CACGACTGAGGCACCTCCAGATG克隆过程A、第一链合成以总RNA为模板，以GSPl为引物，在反转录酶的作用下合成cDNA第一链。 具体步骤如下1)在一个0.5ml的微量离心管中加入以下组分GSPl2.5ml总 RNA1 5 μ g补充经DEPC处理的水至总体积为15.5 μ 1，混勻。2)70°C变性lOmin，冰浴Imin，短暂离心后依次加入以下组分IO^PCRbuffer 2.5 μ 125mM MgCl2 2.5 μ 1IOmM dNTP mix 1.0 μ 10.IM DTT 2.5 μ 1。3)混勻，短暂离心后置42°C lmin。4)在反应体系中加入1 μ 1 SuperScriptTMII RT (Invitrogen公司)，轻轻混勻后置 42°C 反应 50min。5)反转录结束后置70°C、15min以终止反应。6)离心10 20秒后置于37°C。7)加入1 μ 1 RNase mix,轻轻混勻后置于37°C反应30min。8)将反应管取出置冰上备用。B、DNA 纯化使用QIAGEN公司QIAquick PCR纯化试剂盒。1)加5倍体积于反转录体系的PB缓冲液于反转录反应管中，混勻。2)将QIAquick离心柱置于2ml收集管中，把样品加入离心柱，13000rpm离心60秒。3)弃去液体，将离心柱放回原来的收集管中，加入0.75ml PE缓冲液于QIAquick离心柱，13000rpm离心60秒。4)弃去液体，将QIAquick离心柱放回原来的收集管，13000rpm离心60秒。5)将QIAquick离心柱置于一干净的1.5ml离心管，在QIAquick膜中央加入30 μ 1 EB缓冲液，静置Imin后，13000rpm离心60秒。C、cDNA 加尾1)在一个0.5ml的微量离心管中一次加入以下组分DEPC 处理的水 6.5 μ 15*tailing buffer 5.0 μ 12mM dCTP2.5 μ 1纯化的cDNA 10.0 μ 1，混勻。2)将反应管置94°C维持3min后，冰浴lmin，短暂离心后置冰上。3)加入 1 μ 1 TdT,混勻后置 37°C反应 lOmin。4)将反应管置于65°C中作用30min终止反应，离心后置于冰上备用。D、PCR在一个0.2ml的PCR薄壁管中加入以下组分灭菌水31.5 μ 110*PCR Buffer 5.0 μ 125mM MgCl2 3.0 μ 1
IOmM dNTP mix 1.0 μ 1GSP2 (lOpmol/ μ 1) 2.0 μ 1ΑΑΡ (IOpmol/ μ 1) 2.0 μ 1dC-tailed cDNA 5.0 μ 1Tag 酶0.5 μ 1合计50.0 μ 1混勻后置PCR仪中进行反应。E、PCR产物电泳纯化PCR产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳鉴定，结果如图1所示其中1号为轻链结 果，在450bp处有一特异性条带；2号为重链结果，在470bp处有一特异性条带。F、使用Promega公司的pGEM-T Easy试剂盒，将PCR产物克隆到pGEM-TEasy 载体，转化大肠杆菌ToplO (Invitrogen公司)具体过程为1)轻链和重链PCR产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳，分别回收450bp和470bp的条 带，最终定容于20 μ 1体积的灭菌水中；2)在一个0.5ml的微量离心管中，加入以下组分2*连接缓冲液5 μ 1pGEM-T Easy50ng(l μ 1)PCR 产物25ng (3 μ 1)Τ4 连接酶1 μ 1 混勻后室温连接2小时或者4°C连接16小时以上。3)转化大肠杆菌感受态细胞，涂布于含有氨苄青霉素和IPTG、X-GAL的LB平板上，37 °C培养12小时左右。G、测定所克隆的PCR产物的碱基序列各选取至少5个质粒测定其所含的PCR产物的碱基序列。H、根据碱基序列与氨基酸编码序列的相应关系，分析PCR产物的阅读框架， 确定相应可变区的氨基酸序列，其轻链和重链的序列分别如SEQ ID No.l和SEQ ID No.2 所示。根据免疫球蛋白基因的特点验证其为抗体序列。实施例4 本发明的抗III型前胶原氨基末端肽单克隆抗体的应用采用本领域技术人员所公知的基于双抗体夹心法原理的固相酶联免疫技术，制作III型前胶原氨基末端肽检测试剂盒，在体外定量检测人血清中的III型前胶原氨基末端 肽的含量，用于临床上辅助诊断肝纤维化疾病。一、检测原理采用基于双抗体夹心法原理的固相酶联免疫方法(ELISA)。微孔内包被抗III型 前胶原氨基末端肽的单克隆抗体，将标准品或待测标本加入微孔中进行温育，在温育过 程中，标本中的III型前胶原氨基末端肽与单克隆抗体结合形成复合物。洗涤除掉未结合 的物质，再加入辣根过氧化物酶标记的抗III型前胶原氨基末端肽单克隆抗体进行温育， 则酶标记单克隆抗体与微孔内的复合物形成抗体-抗原-抗体复合物。洗涤除去未结合 的物质，加底物显色。颜色的强弱反映了结合的酶标抗体的量。它与标本中的III型前 胶原氨基末端肽的浓度成正比。终止反应后，用酶标仪在450nm读吸光度，其值与标本 中的III型前胶原氨基末端肽浓度成正比。根据所测定的标准品的吸光度绘制标准曲线， 待测标本中的III型前胶原氨基末端肽浓度值即可从标准曲线上获得。二、检测方法A、试剂配制1)配制洗涤液将浓缩洗涤液用蒸馏水或去离子水按1 20比例稀释，得到洗 涤液备用。2)准备标准品用标准品稀释液将标准品原液(200ng/ml)倍比稀释，得到浓度 为 100ng/ml，50ng/ml, 25ng/ml, 12.5ng/ml, 6.2ng/ml 的标准品。B、操作步骤1)根据实验用量，取出相应数量的板条，其余板条放回密封袋中，于2 8°C下 密封保存。2)在相应的微孔中分别加入已倍比稀释的III型前胶原氨基末端肽标准品或被测 血清标本100 μ 1 ；另取1孔加入100 μ 1标准品稀释液(则该孔III型前胶原氨基末端肽浓 度为Ong/ml)。37°C温箱中温育反应90分钟。3)弃去微孔中液体，用洗涤液洗涤4 5次，洗涤完毕后，将微孔板在吸水纸上 拍干。4)每孔加入酶标抗体100 μ 1，37°C温箱中反应45分钟。5)弃去微孔中液体，用洗涤液洗涤4 5次，洗涤完毕后，将微孔板在吸水纸上 拍干。6)每孔加底物液A，底物液B各1滴，避光37。C反应10分钟。7)每孔加终止液一滴终止反应，在终止反应后15分钟内于酶标仪450nm处测定各孔0.D值。C、标准曲线的绘制以450nm处的O.D. 值为纵座标，III型前胶原氨基末端肽的浓度为横座标，根据 标准品的浓度及相应的实际O.D.值制得标准曲线。D、结果计算根据被测血清标本在450nm处的实际O.D.值，在标准曲线上求得其相对应的III 型前胶原氨基末端肽浓度(ng/ml)。三、结果判定正常参考值范围3 12ng/ml。选取123例正常个体作为参考人群进行检测，采用百分位数法确定参考值范 围。以可信度95%为正常值范围，计算单测上限P95。四、临床应用结果为评价III型前胶原氨基末端肽检测试剂盒(酶联免疫法)在临床上应用于定量 测定人血清中III型前胶原氨基末端肽的含量的适用性与准确性，在上海瑞金医院，青海 省第四医院检验科两个地点对此试剂盒进行了临床研究。从临床中选出281例样本作为 研究对象，入选对象以慢性肝炎，肝硬化，脂肪肝病人为主，也包括部分无症状的就诊 患者。采用与德国Behringwercke AG公司的III型前胶原氨基末端肽定量检测试剂盒(放 射免疫法)作为参比的方法。比较检测结果，并进行统计分析，实验结果见表1所示。表1本发明的检测试剂盒的临床应用结果
项目上海瑞金医院试验结果青海省第四医院试验结果
分析灵敏度1.254ng/ml0.974ng/ml
准确性0.9至1.1之间0.9至1.1之间
剂量一反应曲线的线性__0998__0999_
批内不精密度__小于10%__小于10%
批间不精密度小于15%小于15%
与对比检测试剂
0.059>0.05
配对T检验P值
与对比检测试剂r (PearsonCorrelation) =0.954>0.90
相关性P(Sig. (2-tailed))=0.000<0.01
1-1-1 V由表1结果可说明应用本发明的抗III型前胶原氨基末端肽单克隆抗体和基于双抗体夹心法原理的 固相酶联免疫技术制备的III型前胶原氨基末端肽检测试剂盒，对III型前胶原氨基末端肽 检测具有较好的灵敏度，较高的准确性、批内不精密度和批间不精密度，且剂量-反应 曲线的线性也能较好的拟合。另外，统计分析结果也表明该方法与现有产品具有较好的诊断一致性， 可适用于在临床上对肝纤维化进行辅助诊断。
权利要求
1.一种抗III型前胶原氨基末端肽单克隆抗体，其特征在于其轻链的氨基酸残基序 列如SEQ ID No.l所示，其重链的氨基酸残基序列如SEQ ID No.2所示。
2.根据权利要求1所述的抗III型前胶原氨基末端肽单克隆抗体，其特征在于所述 的抗III型前胶原氨基末端肽单克隆抗体是由保藏号为CCTCC NO.C201058的杂交瘤细 胞株4E5F4A11分泌产生。
3.根据权利要求2所述的抗III型前胶原氨基末端肽单克隆抗体，其特征在于所述 的杂交瘤细胞株是以III型前胶原氨基末端肽为免疫源，小鼠为免疫对象，通过免疫注射 小鼠，取免疫小鼠脾脏制备悬液，并使之与骨髓瘤细胞进行细胞融合获得。
4.根据权利要求1所述的抗III型前胶原氨基末端肽单克隆抗体，其特征在于所述 的抗III型前胶原氨基末端肽单克隆抗体属于IgG亚型。
5.根据权利要求1所述的抗III型前胶原氨基末端肽单克隆抗体，其特征在于所述 的抗III型前胶原氨基末端肽单克隆抗体的腹水效价为1 106。
6.一种权利要求1所述的抗III型前胶原氨基末端肽单克隆抗体的应用，其特征在 于用于III型前胶原氨基末端肽检测试剂盒的制备。
7.根据权利要求6所述的抗III型前胶原氨基末端肽单克隆抗体的应用，其特征在 于用于双抗体夹心固相酶联免疫法制备的III型前胶原氨基末端肽检测试剂盒。
8.根据权利要求7所述的抗III型前胶原氨基末端肽单克隆抗体的应用，其特征在 于用于临床上对肝纤维化疾病的辅助诊断。
全文摘要
本发明公开了一种抗III型前胶原氨基末端肽单克隆抗体，所述抗体的轻链的氨基酸残基序列如SEQ ID No.1所示，其重链的氨基酸残基序列如SEQ IDNo.2所示。所述的抗体是由保藏号为CCTCC NO.C201058的杂交瘤细胞株4E5F4A11分泌产生。本发明的抗III型前胶原氨基末端肽单克隆抗体可应用于III型前胶原氨基末端肽的各种检测试剂盒的制备中。使用本发明的单克隆抗体和双抗体夹心固相酶联免疫法制备的III型前胶原氨基末端肽检测试剂盒，不仅可以定量检测人血清中III型前胶原氨基末端肽的含量，而且具有高灵敏度、准确性和较高的诊断一致性，可用于临床上对肝纤维化的辅助诊断。
文档编号G01N33/577GK102020715SQ20101051799
公开日2011年4月20日 申请日期2010年10月22日 优先权日2010年10月22日
发明者周季余, 黄桂民, 黄波 申请人:上海贝西生物科技有限公司