专利名称：甲型h1n1流感病毒总抗体检测试纸的制作方法
技术领域：
本实用新型是涉及生物应用技术领域，特别是涉及一种以胶体金免疫层析法快速 检测甲型Hmi流感病毒总抗体检测试纸。
背景技术：
甲型Hmi流感病毒是一种新型的流感病毒，2009年在世界范围内大流行，严重 危害人类的健康。其“Ha”指的是血球凝集素(Hemagglutinin)、“Na”指的是神经氨酸酶 (Neuraminidase)，甲型流感病毒H有1 15型，有1 9型。Hmi是甲型流感病毒的一 种，也是危害最大的病毒之一。在历史上曾造成数次大流行。目前对甲型Hmi流感检测的主要方法是PCR基因扩增诊断方法，鼻咽试纸抗原诊 断方法等。在抗体检测方面，有ELISA等检测方法，但用胶体金类免疫层析技术对甲型Hmi 总抗体进行检测尚未有相关报道。对Hmi总抗体检测主要有已下作用ι 对Hmi流感进 行辅助诊断。根据“甲型Hmi流感诊疗方案”第三版，甲型Hmi流感病原学检测方法之一 为动态检测双份血清甲型Hmi流感病毒特异性抗体水平呈4倍或4倍以上升高，是感染 HlNl流感病毒的指标。2 对是否已感染Hmi进行鉴别，隐性感染或感染过该病毒的人体 内抗Hmi病毒总抗体将长期存在。3 对免疫接种的效果进行评价，从数据上看，目前Hmi 接种的有效率约为90%，尚有10%的人需要筛选出来重新接种或用其它方式进行该病的 预防。考虑到感染和接种的人群巨大，运用一种快速、简便、有效的抗体检测方法非常必要。免疫层析胶体金技术是新型的诊断技术，在抗体检测方面已得到较为广泛运用， 基本原理如下利用胶体金标记一种抗原或抗体，在试剂的NC膜上包被相应的配对抗原或 抗体，检测时当样品中含相应的特异性抗体或抗原时，胶体金标记颗粒和样品中配体相结 合形成复合物，然后在NC膜上层析，再被包被抗原或抗体捕获，形成肉眼可见的检测T线， 通过检测线的有无实现对结果的判定。具有操作简便、反应快速、敏感性高、特异性强、适合 现场检测和经济实用等优点。
发明内容本实用新型的目的是提供一种甲型Hmi流感病毒总抗体检测试纸，采用双抗原 夹心法制备，具有操作简便、反应快速、敏感性高、特异性强、适合现场检测和经济实用等优
点O本实用新型提供一种甲型Hmi流感病毒总抗体检测试纸，其特征在于塑料支撑 板7 —端连接上样垫1，上样垫1的一端紧密压接含有标记Hmi特异性的血球凝集素Ha或 HlNl特异性的血球凝集素Ha和神经氨酸酶Na抗原的胶体金垫2，胶体金垫2 —端紧密压 接硝酸纤维素NC膜3，硝酸纤维素NC膜3包被有相互分离的检测T线5和质控C线6，T线 为包被在NC膜上的的Hmi特异性的血球凝集素Ha或Hmi特异性的血球凝集素Ha和神 经氨酸酶Na抗原，C线为包被在NC膜上的抗Hmi抗体，硝酸纤维素NC膜3的另一端连接 吸样垫4形成试纸。[0007]所述的甲型Hmi流感病毒总抗体检测试纸，其特征在于所述的抗原为Hmi特异 性的血球凝集素(Ha)和神经氨酸酶(Na)抗原，抗原可以从Hmi病毒中纯化提取或利用基 因工程重组表达。所述的甲型Hmi流感病毒总抗体检测试纸，其特征在于所述的上样垫1为玻璃纤 维膜或无纺布，吸样垫由吸水滤纸构成4。所述的甲型Hmi流感病毒总抗体检测试纸，其特征在于，所述的抗原的包被方法 为以0. OlM PH 7. 2磷酸盐缓冲液(PBS)将Hmi特异性的血球凝集素(Ha)和(或)神经 氨酸酶(Na)抗原配制成0. 5-2mg/ml的溶液，用喷膜仪在NC膜下部以lul/cm的参数进行 划线，包被T线，同时在NC膜上部包被抗Hmi抗体作为C线，划线后将NC膜在干燥间，温 度20-25°C，湿度小于30%，干燥2-5小时。上述的甲型Hmi流感病毒总抗体检测试纸，其特征在于，所述的抗原标记胶体金 颗粒的方法为以氯金酸-柠檬酸三钠还原法制备直径为30-50nm的胶体金溶液，制备完 成后取IOOml胶体金液放在烧杯内，用0. 2M K2CO3调至pH8. 0，按IOOml胶体金溶液加入 0. 5-2mg HlNl血球凝集素(Ha)和神经氨酸酶(Na)抗原，室温搅拌2小时，加入牛血清 白蛋白BSA，0. 1 %聚乙二醇PEG20000封闭20min，12000r/m离心30分钟，弃上清，用胶体金 工作液复溶至100ml，按Iml溶液铺22cm2的比例均勻地铺在玻璃纤维膜或无纺布上，再置 干燥间，温度20-25°C，湿度小于30%，干燥2-5小时，制成胶体金垫。上述的甲型Hmi流感病毒总抗体检测试纸，其特征在于所述的试纸的装配方法 为在干燥室内，温度20-25 °C，湿度小于30 %，取塑料支撑板板，将已包被的NC膜放置在 塑料支撑板的中部粘贴，在NC膜T线一侧搭接胶体金垫(搭胶体金垫的1/3)粘贴，在胶体 金垫另一侧搭接粘贴上样垫，搭胶体金垫的1/5 ；在NC膜C线一侧搭接吸样垫，搭吸样垫的 1/10 ；最后用裁剪机将贴好塑料板切成2-5mm宽的试纸条，切好的试纸条可以再装入塑料 卡内，形成检测卡。所述的甲型Hmi流感病毒总抗体检测试纸，其特征在于，检测方法为将被检血 清或血浆平衡至温室，将试纸条或试剂卡平放，在上样垫上加入50-100U1被检样品，样品 溶解胶体金并在NC膜上层析，然后用肉眼直接观察在20分钟内C、T线的出现情况，并判定 检测结果。本实用新型的有益效果是提供一种利用免疫层析胶体金技术检测甲型Hmi流 感病毒总抗体检测试纸。采用双抗原夹心法实现对总抗体的检测。采用胶体金标记甲型 HlNl流感病毒抗原，包被甲型Hmi流感病毒抗原实现对血液中抗甲型Hmi流感病毒总抗 体的检测。可同时检测IgG和IgM。具有操作简便、反应快速、敏感性高、特异性强、适合现 场检测和经济实用等优点。

图1甲型Hmi流感病毒总抗体检测试纸结构示意图。附图符号说明1 上样垫；2 胶体金垫；3 =NC膜；4 吸样垫5 检测(T)线；6 质控(C)线；7 塑 料支撑板
具体实施方式
实施例制备甲型Hmi流感病毒总抗体检测试纸ι主要材料1. 1特异性甲型Hmi流感病毒Ha抗原Sino Biological Inc.公司产品，为重组 抗原，用于胶体金标记和NC膜T线包被；抗Ha抗体，用Ha免疫山羊自制，用于NC膜包被； 氯金酸=Sigma公司产品；硝酸纤维素(NC)膜=Millipore公司产品；牛血清白蛋白(BSA)， 聚乙二醇PEG20000，水解酪蛋白=Sigma产品。其它常用试剂均为分析纯试剂。1. 2临床血清由公司在相关医院获得，其中在近期接种Hmi疫苗样本80份，未接 种疫苗样本120份。1. 3 甲型 HlNl 流感病毒 IgG ELISA 试剂盒，Sino Biological Inc.产品。2 方法2. 1甲型Hmi流感病毒Ha重组抗原的胶体金标记氯金酸-柠檬酸三钠还原法 制备直径为40nm的胶体金溶液，制备完成后取三份胶体金，分别用0. 2M K2CO3将溶液调 到pH7. O、pH8. O和pH9. O。然后将溶液置于磁力搅拌器上缓慢搅拌，按每IOOml溶液加入 0. 5mg、lmg、l. 5mg将重组抗原将蛋白缓慢滴加到胶体金溶液中，继续搅拌2小时，再滴加入 到终浓度为0. 1 %的PEG2000和1 %的BSA进行封闭20min,标记结束后以12000r/m离心， 弃上清，沉淀按原体积复溶至不同配比的胶体金工作液硼酸盐缓冲液，PH8. 0，含BSA、羊血 清，蔗糖和表面活性剂中。然后将标记胶体金溶液按Iml溶液铺22cm2的比例加样于无纺 布上，在温度20-25°C，相对湿度在< 30%的干燥间干燥2-4小时，制成胶体金垫。2. 2H1N1流感病毒Ha重组抗原的包被用0. OlM pH7. 2PBS将Hmi流感病毒Ha重 组抗原分别稀释成0. 5mg/ml、lmg/ml、2mg/ml，然后用喷膜仪在NC膜下部按lul/cm进行划 线包被，同时在NC膜上部包被抗Ha抗体，用于产品的质控，包被完成后将NC膜在在温度 20-25°C，相对湿度在< 30%的干燥间干燥2-5小时。2. 3甲型Hmi流感病毒总抗体快速检测试纸的组装在干燥室内(温度20_25°C， 相对湿度< 30% )取塑料支撑板，将已包被的NC膜放置在塑料支撑板的中部粘贴，在NC膜 T线一侧搭接胶体金垫(搭胶体金垫的1/3)粘贴，在胶体金垫另一侧搭接粘贴上样垫(搭 胶体金垫的1/5)；在NC膜C线一侧搭接吸样垫(搭吸样垫的1/10)；然后用裁剪机将贴好 塑料板切成3mm或4mm宽的试纸条。切好的试纸条可以再装入塑料卡内，形成甲型Hmi流 感病毒总抗体检测试剂卡。2. 4检测方法将被检血清或血浆平衡至温室，将制备好的试纸条或试剂卡平放，在 上样垫上加入50-100U1被检样品，若样品中含抗甲型Hmi流感病毒总抗体，则和样品垫上 的标记甲型Hmi流感病毒抗原的胶体金结合，形成复合物，并扩散到NC膜上进一步层析， 当遇到包被在NC膜上T线处的Hmi流感病毒Ha重组抗原时，复合物则又和包被抗抗原结 合，被捕获在包被处，当被捕获的胶体金复合物达到一定数量时，则形成一条肉眼可见的T 线；若血清中不含特异性抗体，则不能形成免疫复合物，亦不能形成T线，C线作为试剂的质 控标准，阳性和阴性样品检测时均会出现。用肉眼直接观察在5、10、15、20、30和45分钟内 C、T线的出现情况，并判定检测结果。2. 5试纸工艺参数调试将浓度不同标记、包被的试剂进行组合配对，制备小样，利 用质控血清对试剂进行测试，发现最佳组合。[0028]2. 6临床血清检测用本试剂按检测方法对所有临床血清进行检测，同时用Sino Biological Inc.甲型Hmi ELISA抗体检测试剂进行对照检测。3结果3. 1试纸参数确定根据小样的检测结果，确定了试纸的最佳标记pH值为 8. O ；重组混合抗原的最佳标记量为lmg/100ml胶体金溶液；最佳的胶体金工作液为IOmM 硼酸酸盐缓冲液，PH8. 0，含0. 5% 85八、10%羊血清，2%蔗糖，0. 2% Tween 20 ；最佳HlNl流 感病毒Ha重组抗原包被浓度为lmg/ml。检测结果的最佳判定时间为5_20分钟。但以上参 数在制备不同批次产品时可能需要适当调整。3. 2临床血清检测以ELISA试剂为对照，80份近期接种甲型Hmi流感病毒疫苗人 员的样本中，检测出阳性70份，ELISA检测出阳性血清72份，灵敏度=70/72 = 97.2% ； 本试剂对120份未接种Hmi疫苗人员样本中检出阴性为110份，ELISA试剂的检测阴性为 112分，相对特异性为110/112 = 98. 2%。P > 0. 05。试剂性能和ELISA试剂相比无显著 性差异，适合临床检测需要。
权利要求一种甲型H1N1流感病毒总抗体检测试纸，其特征在于塑料支撑板(7)一端连接上样垫(1)，上样垫(1)的一端紧密压接含有标记H1N1特异性的血球凝集素Ha或H1N1特异性的血球凝集素Ha和神经氨酸酶Na抗原的胶体金垫(2)，胶体金垫(2)一端紧密压接硝酸纤维素(NC)膜(3)，硝酸纤维素(NC)膜(3)包被有相互分离的检测(T)线(5)和质控(C)线(6)，T线为包被在NC膜上的的H1N1特异性的血球凝集素Ha或H1N1特异性的血球凝集素Ha和神经氨酸酶Na抗原，C线为包被在NC膜上的抗H1N1抗体，硝酸纤维素(NC)膜(3)的另一端连接吸样垫(4)形成试纸。
2.根据权利要求1所述的甲型Hmi流感病毒总抗体检测试纸，其特征在于所述的上样 垫(1)为玻璃纤维膜或无纺布，吸样垫由吸水滤纸构成(4)。
专利摘要本实用新型是涉及生物应用技术领域，特别是涉及一种甲型H1N1流感病毒总抗体检测试纸，采用双抗原夹心法实现对总抗体的检测。采用胶体金标记甲型H1N1流感病毒抗原，包被甲型H1N1流感病毒抗原实现对血液中抗甲型H1N1流感病毒总抗体的检测。可同时检测IgG和IgM。具有操作简便、反应快速、敏感性高、特异性强、适合现场检测和经济实用等优点。
文档编号G01N33/569GK201637744SQ20102014209
公开日2010年11月17日 申请日期2010年3月26日 优先权日2010年3月26日
发明者李洲, 杨发青 申请人:天津中新科炬生物制药有限公司