专利名称：一种人畜两用检测血吸虫抗体试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种对人畜两用血吸虫检测方面的设备，特别是一种人畜两用血吸虫抗体检测的试剂盒。
背景技术：
日本血吸虫病曾流行于我国南方12个省(市)、自治区，目前仍在108个县和57 个县级农场流行，受威胁的人、畜各有近1亿。20世纪80年代以来，血吸虫病防治策略由消灭媒介钉螺转向以化疗为主的综合性防治措施，由此血吸虫病的早期诊断工作愈显重要。 家畜是日本血吸虫的主要保虫宿主和感染者，其在血吸虫病的流行过程中起着重要的传播作用。在血吸虫病的防治工作中，控制家畜感染源尤为重要，因而除了查治病人外，还必须对流行区的家畜进行查治。目前日本血吸虫病的诊断方法主要是粪检法、间接血凝法(IHA) 和酶联免疫吸附试验(ELISA法)。粪检法费时费力，阳性检出率也较低，不适合在现场广泛使用。间接血凝法(IHA法)、酶联免疫吸附试验(ELISA法)需要仪器设备，操作时间较长，也不方便于现场使用。因此，寻找简便快速、准确灵敏，并具有考核疗效和防治效果以及监测疫情的日本血吸虫病的诊断方法，已成为当前迫切需要解决的问题。目前市场上有四川迈克生物科技股份有限公司生产的血吸虫循环抗原测定试剂盒(ELISA法)、无锡赛德科技开发有限公司生产的血吸虫抗体(IgG)检测试剂盒(胶体染料法)和安徽安吉医药科技有限公司生产的日本血吸虫抗体检测试剂盒(间接血凝法)，没有一个产品能同时检测人和多种家畜的血吸虫抗体的试剂盒。

发明内容
本发明的目的是针对当前市场上对血吸虫检测方面的不足之处，发明一种快速、 简便，灵敏度高、特异性好、结果稳定可靠并能长期保存实验结果，又能同时检测人和多种家畜血清中血吸虫抗体试剂盒。本发明的采用的技术方案如下一种人畜两用检测血吸虫抗体试剂盒，其特征在于包括a、试剂板由已包被了日本血吸虫虫卵可溶性抗原和金黄色葡萄球菌A蛋白的硝酸纤维素膜、不渗水海绵、吸水垫经渗水惰性胶水粘贴而成，再分切成固定宽度的板状，夕卜加聚苯乙烯塑料外壳制成；b、洗涤液是向缓冲液中加入保护剂、洗涤剂配置而成的无色或淡黄色液体；c、金标液由胶体金标记的SPA红色液体。本发明首次用SPA(金黄色葡萄球菌A蛋白)标记胶体金测定日本血吸虫抗体，解决了实验室中因SPA与牛、马、羊等动物IgG亲和力较差而无法应用于这类动物检测的难题，开发出可同时检测人和多种哺乳动物血清中存在的血吸虫抗体试剂盒。同时在标记SPA 胶体金溶液中加入稳定剂，避免了聚沉现象的产生，极大延长产品的有效期，比市面上其他标记SPA胶体金的产品有效期提高了 3倍，从而解决其在实际生产和临床检验中关键问题；在胶体金溶液烧制过程中，应用超声破碎原理，控制金溶液颗粒大小一致，实现了灵敏度和稳定性的优异结合，大幅度提高产品性能；开发出对照蛋白特殊处理技术，避免了大规模检测时因漏加血清导致的假阴性结果出现，规范了检测操作，提高了结果可信度；检测结果能长期保存，可作为以后实验的参照及查询依据。技术产品填补国内空白，达国际先进水平。本发明采用的是胶体金免疫渗滤斑点法原理，使用硝酸纤维素膜(NC膜)作为固相载体，将抗原点样于NC膜上，加入待测血清滤过NC膜，SPA-胶体金(红色)则作为显色齐U。如果待测血清中有血吸虫抗体，则会形成红色斑点；如果待测血清中不存在血吸虫抗体，则不会形成红色斑点。本发明具有操作简便、节省时间、灵敏度高、特异性好、结果稳定可靠并能长期保存实验结果，又能同时检测人和多种家畜血清中血吸虫抗体，是一种不需要其他仪器设备就可进行检测的试剂盒。
具体实施例方式下面根据具体实施方式
对本发明作进一步说明1、血吸虫抗原制备准确称取购买的虫卵IOOmg加水:3ml，超声波破碎3分钟，反复冻融5天；3000转 /min离心40min。经离心后的上清液，即为虫卵抗原原液，保存于_20°C中备用。2、胶体金的烧制a.将1/万氯化金溶液缓慢加热，待水温达到50 60°C (以玻璃器皿外不凝结水蒸气为标准)；b.用大火将1/万氯化金溶液煮沸，煮沸持续2分钟；c.迅速加入新鲜配制已溶解好的柠檬酸三钠溶液；d.观察胶体金溶液由深紫色转变为淡紫色，并最终转变为橘红色为宜；e.持续小火，20分钟；f.待稍冷却，密封；g.使用超声仪，对烧制好的胶体金溶液超声破脆，使胶体金溶液颗粒大小均勻。3、SPA标记胶体金的NaCL破坏定量实验标记前将胶体金溶液PH调整到8. 0。a.将SPA溶液稀释到lmg/ml，再将SPA溶液(lmg/ml)按如下比例稀释1 1、 1 5、1 10、1 20、1 40、1 80、1 160,1 320,1 640,1 1280,1 2560、
I 5120,1 10240.每管中加入胶体金溶液lml，充分混勻并静置15分钟以上。b.每管加入2mol/L的氯化钠溶液1ml，静置2小时左右，观察每一管中SPA-胶体金溶液的颜色变化情况，并记录结果。以SPA-胶体金溶液颜色没有改变的那一管的SPA量为最低胶体金的标记量，对应计算出每毫升胶体金溶液所需SPA的量。4、SPA-胶体金保护液配置配方三羟甲基氨基甲烷溶液(Tris-HCL溶液)Tris 0.5 %以10%的盐酸调整PH到7. 5。牛血清白蛋白(BSA% ) 1.0% ；吐温-20 (TTOEN-20 % ) :1.5% ；聚乙二
II-20000 (PEG-20000% ) :2.0% ；十二烷基硫酸钠(SDS% ) 0. 15%5、SPA-胶体金的标记
将胶体金溶液PH调整到8. 0。当蛋白质的最适稳定量被确定以后便可进行标记， 边滴加SPA边摇动胶体金溶液；将所有的SPA都加入到胶体金溶液中后。具体步骤如下 (1)根据用以标记的胶体金的总量计算出所需要的待标记蛋白质的总量；( 在电磁搅拌下，将蛋白质溶液加入胶体金溶液中(pH已调至PI超过0. 5pH)，加入蛋白质时应逐滴加入， Img的蛋白质大约5min加完；(3)在磁性搅拌下加入5%的稳定剂使其终浓度为1%。SPA-胶体金标记溶液以15000转/分钟，40分钟离心，弃去上清液，保留沉渣，并以少量胶体金-SPA保护液溶解，过滤于洁净容器中；以此稀释液配制SPA-胶体金浓缩液并将调到7. 5左右，450nm吸光度为1. 0 2. 0。纯化的目的是除去其中未标记的SPA，未充分标记的SPA以及在标记过程中可能形成的各种聚合物。(1)以2000r/min 4°C离心5min，留上清液，弃沉淀。(2)将胶体金溶液选用15000r/min 4°C离心40min，吸弃上清，留沉淀。(3)将离心收集的SPA-胶体金用 PH值7. 5左右的保护液稀释，用450nm调整0D1. 0 2. 0之间。6、洗涤液的配制配方三羟甲基氨基甲烷溶液(Tris-HCL溶液)Tris 0.5 %以10%的盐酸调整PH到8.0。牛血清白蛋白(BSA% ) 2. 0% ；吐温-20 (TWEEN-20 % ) :1.5% ；聚乙二醇-20000 (PEG-20000% ) :2. 0% ；十二烷基硫酸钠(SDS % ) 0. 15%07、检测点和对照点的点样(1)、抗原稀释液选取5%蔗糖pH7. 2的磷酸盐缓冲液(PBS)作为血吸虫抗原的稀释液，PBS配置比例如下0.15mol/L的磷酸氢二钠(含结晶水)0. 15mol/L的磷酸二氢钾(含结晶水)0.9%氯化钠=1:1:1测定PH值应在7. 2，可用0. 15mol/L的磷酸氢二钠(含结晶水)或0. 15mol/L的磷酸二氢钾(含结晶水)溶液进行PH值的调整。O)、点样将硝酸纤维素膜裁剪成IX lcm，将血吸虫抗原(作为检测点)及SPA (金黄色葡萄球菌A蛋白作为对照点)用抗原稀释液稀释成1 20，然后各取0.5μ1点在硝酸纤维素膜中央靠边缘2点，室温干燥2小时，干燥后，4°C密封保存。检测前将点样膜紧贴在惰性吸水板上，组装成测试试剂板。8、SPA(金黄色葡萄球菌A蛋白)标记胶体金免疫渗滤斑点法测定血吸虫抗体试剂盒的具体操作方法1、在试剂板的反应孔中间加入2滴洗涤液，待完全渗入；2、取30 50ul新鲜血清标本，加入反应孔中间，待完全渗入；3、在反应孔中间加2滴洗涤液，待完全渗入；4、在反应孔中间加入2滴胶体金液，待完全渗入；5、在反应孔中间加入2滴洗涤液，待完全渗入，5分钟内目测结果；6、结果判断试剂板上出现两个(T 检测点、C 对照点)红色点为阳性结果；出现一个(C 对照点)红色点，(T 检测点)不显色为阴性结果。
权利要求
1. 一种人畜两用检测血吸虫抗体试剂盒，其特征在于包括a、试剂板由已包被了日本血吸虫虫卵可溶性抗原和金黄色葡萄球菌A蛋白的硝酸纤维素膜、不渗水海绵、吸水垫经渗水惰性胶水粘贴而成，再分切成固定宽度的板状，外加聚苯乙烯塑料外壳制成；b、洗涤液是向缓冲液中加入保护剂、洗涤剂配置而成的无色或淡黄色液体；c、金标液由胶体金标记的SPA红色液体。
全文摘要
本发明公开了一种人畜两用检测血吸虫抗体试剂盒，其特征在于包括a、试剂板；b、洗涤液；c、金标液。本发明具有操作简便、快速、灵敏度高、特异性好、结果稳定可靠并能长期保存实验结果，又能同时检测人和多种家畜血清中血吸虫抗体，是一种不需要其他仪器设备就可进行检测血吸虫抗体的试剂盒。
文档编号G01N21/78GK102466728SQ20101054100
公开日2012年5月23日 申请日期2010年11月12日 优先权日2010年11月12日
发明者刘照武, 谢端泉 申请人:岳阳迅超生物技术有限公司