专利名称：一种检测血清样本中禽流感抗体的蛋白悬浮芯片系统的制作方法
技术领域：
本实用新型涉及一种检测血清样本中禽流感抗体的蛋白悬浮芯片系统。
背景技术：
禽流感病毒属甲型流感病毒，甲型流感病毒多发于禽类，一般来说，禽流感病毒与 人流感病毒存在受体特异性差异，禽流感病毒是不容易感染给人的。个别造成人感染发病 的禽流感病毒可能是发生了变异的病毒，但1997年香港禽流感病毒首次突破种间障碍直 接感染人共有18位香港居民感染了 H5W亚型流感病毒，其中6人死亡事件的发生，打破 了人们对禽流感病毒的传统认识模式，研究表明，感染人的禽流感病毒亚型主要为H5N1、 H9N2、H7N7，其中感染H5W的患者病情重，病死率高。免疫学方法酶联免疫实验(ELISA)中利用抗原与抗体特异性反应来检测抗原或 抗体主要有由双抗原夹心测抗体、双抗体夹心测抗原、竞争法、间接法等。间接法测抗体 的原理是特异性抗原结合到固相载体上，然后和待检血清中的相应抗体结合形成免疫复合 物，洗涤后再加酶标记抗体与免疫复合物中的抗体结合形成酶标记抗体-抗体-固相抗原 复合物，加底物显色，判断抗体含量。悬浮芯片(suspension array)也称液相芯片，是20世纪70年代美国Luminex公 司研制出的新一代生物芯片技术，利用带编码的微球体作为载体，流式细胞仪作为检测平 台，对核酸、蛋白质等生物分子进行大规模测定。目前，该技术已广泛应用于免疫分析、核酸 研究、酶学分析、抗体筛选及受体与配体的识别分析等领域。目前发展的悬浮芯片主要是基于实验室检测方法的建立和方法评价及优化，以缩 短检测时间，降低方法的检测成本。但是悬浮芯片是否能够检测人血清中的禽流感抗体，其 定量检测能力如何，尚缺乏模型和评价。

实用新型内容本实用新型的目的在于提供一种检测血清中禽流感病毒抗体的蛋白悬浮芯片系 统，该芯片系统包括芯片基体、加液系统、悬浮芯片检测仪和计算机，其中，芯片基体内装 有相关缓冲溶液和待测抗体，相关缓冲液中设置有032号编码微球，编码微球上包被有捕 获抗原，加液系统依次向芯片基体中加入生物素标记的二抗和/或SPA、荧光信号检测物， 悬浮芯片检测仪包括微细管检测通道和检测激光，反应后的溶液吸入到微细管检测通道 中，以使得每个编码微球依次通过微细管检测通道，检测激光激发并识别编码微球的颜色 及其上待测物的荧光信号，计算机与悬浮芯片检测仪相连，并记录、分析悬浮芯片检测仪的 测量结果。进一步，所述相关缓冲溶液包括用于所述待测抗体稀释的样品稀释液、稀释所述 编码微球所用的微球稀释液、稀释所述生物素标记的二抗和/或SPA所用的抗体稀释液、每 个反应之后洗涤编码微球所用的微球清洗液、SA-PE稀释液、检测缓冲液。进一步，所述捕获抗原优选为禽流感H5蛋白。[0009]进一步，所述待测抗体为血清样品。进一步，所述生物素标记的二抗和/或SPA优选为Biotin-羊抗兔IgG和/或 Biotin-SPA。 进一步，所述荧光信号检测物为链亲和素-藻红蛋白。进一步，所述芯片基体为96孔滤板或者微量离心管。进一步，所述检测激光包括用激发所述编码微球基质中的颜色、识别编码微球分 类编码以确定检测项目的红色激光，用于激发并识别待测分子的颜色信号、记录信号强弱 以检测所述待测抗体的含量的绿色激光。经过大量和深入的研究，对禽流感抗体的蛋白悬浮芯片制备及其检测条件作了实 质性的改进和创新，其具有下列优点1、抗原包被量的改进禽流感H5蛋白的包被量是成功检测的关键，本实用新型对包被微球的抗原包被 量进行实质性优化使血清样本的检测效果非常良好，并且包被蛋白悬浮芯片所需的抗原包 被量很低，本实用新型的禽流感H5蛋白抗原包被量为0. 1 100μ g/1. 25X106个编码微 球或0. 02 400ng/2500 5000个微球/测试，而一般的ELISA试验所需抗原的包被量为 Iyg/测试。2、生物素标记的改进通常，标记抗体需要使用过量的生物素。理论上讲，在检测过程中，过量的生物素 因未标记上抗体而不被微球上结合捕获抗体的抗原联接，清洗时被抽滤掉，不会与随后加 入的SA-PE反应，不影响检测。但在实际检测过程中，偶尔遇到过检测信号可能过高的现 象，因此建议生物素标记抗体后，尽量去除多余的生物素。以标记ang/mL的IgG(分子量 150，000) ImL溶液为例，需加入IOmM生物素溶液约27 μ L。3、检测的灵敏度及动态范围本实用新型的血清样品禽流感抗体的蛋白悬浮芯片定量检测方法与经典的免疫 学ELISA检测方法相比，结果有着很好的吻合性(相关系数R2 = 0.9863)。同时，悬浮芯片 方法灵敏度为检测滴度4. 767 X 10-6，高于ELISA方法的检测滴度10_5，灵敏度提高10倍 以上；并且悬浮芯片方法动态检测范围为2X 10-7 2Χ 10-2，高于ELISA方法动态检测范 围10-5 10-2达1个数量级。4、方法的特异性本实用新型通过选用禽流感Η5蛋白为包被抗原，以兔抗禽流感H5W抗体为待测 抗体，以生物素化-羊抗兔IgG为检测物。本研究试验证明，在存在鼠抗流感NP IgG、兔抗 结核血清、兔抗鼠疫菌Fl抗原多克隆抗体、兔抗SARS IgG等干扰抗体存在条件下本方法具 有良好的特异性。5、样品的检测能力本实用新型评价了蛋白悬浮芯片方法对人血清的检测能力。通过人血清的检测， 初步证实了该方法在检测人血清中禽流感抗体的实用性。

图1为本实用新型结构示意图；[0026]图2为032号微球包被禽流感H5蛋白检测兔抗禽流感H5W血清示意图；图3为蛋白悬浮芯片方法检测兔抗禽流感H5W血清剂量-反应标准曲线。图4 =ELISA方法检测兔抗禽流感H5W血清标准曲线图；图5 蛋白悬浮芯片与ELISA方法检测兔抗禽流感H5W血清的相关性。
具体实施方式
如图1至图5所示，本实用新型一种检测血清样本中禽流感抗体的蛋白悬浮芯片 系统，包括芯片基体1、加液系统2、悬浮芯片检测仪3和计算机4，其中，芯片基体1为96孔 滤板或者微量离心管，其内装有相关缓冲溶液和待测抗体，相关缓冲液中设置有编码微球 (图中未示)，编码微球上包被有禽流感H5蛋白，用于捕获待检测血清样品中的待测抗体， 如果样品中有禽流感抗体，禽流感抗体与编码微球上的禽流感蛋白结合，再加入带有生物 素标记的二抗和/或SPA,形成编码微球-禽流感H5蛋白-禽流感抗体-二抗/SPA-生物 素复合物，最后加入链亲和素-藻红蛋白，链亲和素与生物素结合，形成编码微球-禽流感 H5蛋白-禽流感抗体-二抗/SPA-生物素-链亲和素-藻红蛋白复合物，通过悬浮芯片检 测仪对藻红蛋白荧光信号的检测来达到对血清样品中禽流感抗体的检测，如果血清样品中 没有禽流感抗体，包被有禽流感H5蛋白的编码微球不会与后面加入的生物素标记的二抗 和/或SPA、链亲和素-藻红蛋白结合，最后通过悬浮芯片检测仪器进行检测时无荧光信号 或应该信号非常弱。上述芯片系统中，编码微球在微球稀释液，待测抗体在样品稀释液中，生物素标记 的二抗和/或SPA在抗体稀释液中，荧光信号检测物在SA-PE稀释液中，悬浮芯片检测仪检 测时编码微球复合物在检测缓冲液中，每步结合之后均用清洗液洗涤微球，使得没有结合 的物质清除体系。悬浮芯片的基本原理是利用聚苯乙烯(polystyrene)所制作的微球，包覆不同比 例的红光及红外光发色剂，而产生100种不同比例颜色，作为100种独特的色彩编号，每颗 微球大小约5. 6 μ m，可依不同研究目的如免疫分析、核酸研究、酶分析、受体和配体识别分 析等，并根据不同研究目的而标定特定抗体、核酸探针及各种受体探针。标记探针的微球与 待测物在96孔板中进行反应。反应后，利用机器自动将反应液吸起并通过一微细管检测通 道，每次仅允许一个微球通过检测通道。检测通道中设有两道激光，一道为红色，激发微球 基质中的颜色，识别微球分类编码以确定检测项目；一道为绿色，激发报告分子的颜色，记 录信号强弱以检测待测物的含量。当待测样本与特定微球的探针吸附在一起时，两道激光 所激发的光都可被检测到。而若样本中不含该标的物，则仅有微球中的激发光可被检测到。 再通过机器与计算机自动统计分析两道激光所激发的微球种类与数量，从而判定待测样本 中有几种测试目标物在其中，得知测试样本中有无待测病原存在，或同时存在有几种至数 十种病原。悬浮芯片技术由于利用微球在溶液中反应，克服了片膜芯片在大分子检测时受 表面张力、空间效应等对反应动力学的影响，同时利用激光检测技术，大大提高了样品检测 的准确性和重复性，具有优于片膜芯片的操作简便、重复性好等特点。本实用新型一种检测血清样本中禽流感抗体的蛋白悬浮芯片系统，通过下面的具 体实施方式作进一步说明，但本实用新型不以任何方式受该实施例的限定。一、材料[0035]1.蛋白悬浮芯片的相关缓冲液(I)PBS 缓冲液(pH7. 4) :NaCl 137mmol/L ；KCl 2. 7mmol/L ；Na2HP04 10mmol/L ； KH2P04 2mmol/L。用 800mL 蒸馏水溶解 8gNaCl，0. 2gKCl，1. 44g Na2HP04 和 0. 24g KH2P04。 用HCl调节溶液的pH值至7. 4，加水至1L。分装后在15psi (1. 05kg/cm2)高压蒸汽20分 钟，或过滤除菌，保存于室温。(2)微球清洗液:PBS(ρΗ7· 4) ,0. 05% TWEEN-20。(3)微球活化缓冲液 IOOmM NaH2P04 :3g NaH2P04,5N NaOH 1. 5mL，定容于 25OmL, pH 6. 2。(4)微球包被缓冲液 0· 05M MES，pH 5. 0 2. 44g MES，5N NaOHO. 15mL，定容于 250mLo(5)微球保存液PBS-TBN :PBS，0. 1%BSA,0. 02% TWEEN,0. 05%叠氮化物，pH 7. 4。(6)微球封闭液 PBS-BN :PBS, 1% BSA,0. 05%叠氮化物，ρΗ7· 4。(7)检测缓冲液:PBS, 1 % BSA, ρΗ7· 4。(8)抗体稀释液 PBS，ρΗ7· 4。。(9)微球稀释液PBS，1 % BSA, ρΗ7· 4。(10)样品稀释液 PVX :PBS,0. 5% PVA,0. 8% PVP ；(Il)SA-PE 稀释液PBS(pH7. 4),1% BSA。2.抗原与抗体本实用新型所使用抗原重组禽流感病毒H5蛋白，其可购自哈尔滨兽医研究所。本实用新型所使用待测抗体为兔抗禽流感H5W血清，其可购自中国疾病预防控 制中心病毒病预防控制研究所，检测抗体为生物素化羊抗兔IgG和生物素化SPA，羊抗兔 IgG和SPA，其可购自北京欣经科生物有限公司。二、待测样品的制备1、目标分析物样品的制备目标分析物为兔抗禽流感H5W IgG,干扰样品或作为方法特异性测试的样品是目 标检测物外的其它抗体或其它蛋白质，包括兔抗结核血清、兔抗SARS IgG、兔抗禽流感H5W 血清、兔抗鼠疫IgG、BSA、酪蛋白、胰蛋白胨等。将上述待分析样品均溶于样品稀释液液中， 4°C保存。抗禽流感H5m IgG的储备液浓度为0. ang/mL。比较实验中，相同样品用于ELISA 和蛋白悬浮芯片的检测。将待分析的兔抗禽流感H5W IgG用样品稀释液以4倍倍比系列稀释为不同浓度 样品，以绘制样品检测剂量-反应的标准曲线，其中几个样品浓度低于检测的敏感度，高浓 度样品应使编码微球的结合位点处于饱和状态。2、人血清样本的处理将人血清样本用样品稀释1 10稀释，例如人血清样本5 μ L加样品稀释液50 μ L 混勻后，作为待检样品进行蛋白悬浮芯片方法的检测。实施例1、检测禽流感抗体的蛋白悬浮芯片的制备1、捕获抗原包被编码微球本实用新型采用的032号编码微球购自美国Bio-Rad公司，编码微球用于标记可 以捕获禽流感抗体的禽流感Η5蛋白抗原，即利用禽流感Η5蛋白包被微球。[0059]A、编码微球的活化取100 μ L (1. 25X106个)032编码微球到1. 5mL离心管中，14000 Xg离心，小心 吸出并弃去上清液。加入100 μ L的微球清洗缓冲液悬浮，震荡并超声后14000Xg离心， 小心吸出并弃去上清液。加入100 μ L的微球活化缓冲液，接着先加入10 μ L新鲜配置的 EDC (50mg/mL)，再加入IOyL新鲜配置的50mg/mL的Sulfo-NHS，高速震荡30秒后用铝箔包 裹，在室温震摇20分钟。加入150μ L的PBS(pH7. 4)，震荡后，14000Xg离心，小心吸出并 弃去上清液。加入100 μ L的PBS (ρΗ7. 4)悬浮编码微球。B、用抗原包被编码微球取捕获抗原禽流感Η5蛋白抗原1 50 μ g加入到活化后的032编码微球中，用PBS 缓冲液定容至500 μ L，室温震摇2小时。14000 X g离心，小心吸出并弃去上清液。用500 μ L 的PBS缓冲液洗一次，14000 Xg离心，小心吸出并弃去上清液。加入250 μ L的封闭缓冲液 悬浮编码微球，在室温震摇30分钟，14000Xg离心，小心吸出并弃去上清液。加入500 μ L 的微球保存液洗涤编码微球，16000Xg离心，小心吸出并弃去上清液。最后用150yL的微 球保存液悬浮编码微球，于4°C避光保存备用。C、包被微球的计数吸取适量微球，稀释后，用血球计数板(0. IOmm ；l/400mm2)在普通显微镜下计数。 根据公式(每个大格数X104X稀释倍数X体积(mL))计算微球数量。2、检测抗体标记生物素A、生物素的标记分别配制好浓度为IOmM生物素溶液和^iig/mL的待标记抗体溶液，将计算好体积 的生物素加入到待标记抗体溶液中，在室温震摇30分钟(或冰上2小时)，过柱脱盐后分 装，-20°C冻存备用。B、抗体的用量以标记2mg/mL的IgG (分子量150，000) ImL溶液为例，需加入IOmM生物素溶液约 27 μ 1。实施例2、蛋白悬浮芯片制备法条件的优化1、微球包被抗原包被量的选择分另Ij以 1μ g、5y g、10y g、15y g、20y g、25y g、30y g、35y g、40y g、45y g、 50 μ g、100 μ g的量包被100 μ L编码为032号的微球。经检测效果比较，以1 50 μ g/1. 25 X 106个编码微球即0. 2 200ng/2500 5000个微球/包被效果最好，显微镜 下计数后避光冷藏保存待用。如图1所示，包被禽流感H5蛋白抗原的032号微球均落在其 正确检测区域内，并且获得高信噪比结果(MFI值远大于2000)，说明优化的蛋白悬浮芯片 检测系统可成功用于禽流感抗体的检测。2、生物素化抗体的优化本实用新型分别用氨基活性的生物素，例如LC-酰胼(hydrazide)-生物素和羧基 活性的生物素，例如Sulfo-NHS-生物素和SH-活性的生物素标记检测抗体，经质控过程检 测效果比较，本实验中Sulfo-NHS-生物素标记检测抗体检测效果较好，检测效果的方法采 用本领域的常规方法或安装制造商的产品说明书所述的方法。本实用新型人经过试验验证，发现ang/mL生物素化的羊抗兔抗体以1 250稀释作为检测抗体进行检测兔血清中禽流感抗体，检测结果显示生物素化检测抗体Bio-羊抗 兔抗体可获得高检测值和低背景值的检测效果；2mg/mL生物素化SPA以1 2500稀释作 为检测人血清中禽流感抗体，检测结果显示生物素化检测抗体Bio-SPA可获得高检测值和 低背景值的检测效果。实施例3、样品的制备、检测及结果判定1、待测样品制备用样品稀释液将待测样本配置为不同浓度样本进行蛋白悬浮芯片检测。2、样品的检测及结果判定检测过程全部反应均在96孔滤板上进行，检测过程如下1)每孔加入50 μ L含相应编码微球的工作溶液，用清洗液洗涤并用真空泵抽滤；2)加入50 μ L检测样品，混勻后室温避光震摇30分钟，用清洗液洗涤并抽滤；3)加入50 μ L适当浓度的用抗体稀释液稀释后的生物素化抗体，混勻后室温避光 震摇30分钟，洗液洗涤并真空泵抽滤；4)加入50 μ L的SA-PE，混勻后室温避光震摇10分钟。洗液洗涤并真空泵抽滤；5)加入125 μ L的检测缓冲液，经蜗旋重悬混勻；6)用蛋白悬浮芯片系统读取MFI数值并分析数据。3、检测结果判定根据试验研究结果与相关研究报道，本实用新型定义蛋白悬浮芯片方法检测禽流 感抗体的最低检出限(L0D值)为检测荧光强度临界值(Cutoff)对应的检测物浓度。其中， Cutoff的定义是采用空白对照样品(Blank)荧光检测信号MFI均值加3倍标准差(SD)，即 Cutoff值为=MFI (空白对照)+3倍标准差。若检测结果高于Cutoff对应荧光强度值则判 定为禽流感抗体检测结果阳性；若检测结果低于Cutoff对应荧光强度值则判定为禽流感 抗体检测结果阴性。实施例4、蛋白悬浮芯片对禽流感H5蛋白抗原的特异性试验应用蛋白悬浮芯片检测方法分别对兔抗结核IgG、鼠抗流感NP IgG、兔抗SARS IgG、兔抗禽流感H5W血清、兔抗鼠疫IgG、BSA、酪蛋白、胰蛋白胨等进行检测，根据实施例3 中检测结果判定标准，仅兔抗禽流感H5m IgG为阳性，其余干扰抗体或蛋白均为阴性。说 明本实用新型所建立的禽流感抗体的蛋白悬浮芯片检测方法与其它测试抗体均不发生交 叉反应或非特异反应。实施例5、对血清样品中禽流感抗体的蛋白悬浮芯片定量检测1、兔抗禽流感H5W IgG标准曲线样品制备用样品稀释液将兔抗禽流感H5W IgG标准品由20 μ g/mL以4倍倍比梯度稀释至 19Ip g/mL成系列浓度样品。2、剂量-反应标准曲线的绘制按照实施例3中的检测方法检测上述系列浓度样品，并根据蛋白悬浮芯片系统检 测结果绘制剂量-反应标准曲线(如图3所示)。其中，X轴代表抗体的浓度(ng/mL)，Y轴 代表悬浮芯片仪检测的荧光值(MFI)。每个数据代表3次的检测结果平均值，坐标轴以对 数-对数关系设定，图2中兔抗禽流感H5W血清的浓度(ng/mL)分别为做4倍比稀释范围 为:S1 :0. 004，S2 :0. 0162，S3 :0. 647，S4 :0. 259，S5 :1. 04，S6 :4. 14，S7 :16. 56，S8 :66. 25，S9 :265, SlO :1060ο蛋白悬浮芯片系统根据检测结果拟合兔抗禽流感H5W血清剂量-反应标准曲线 方程为FI = -1. 31918+(13360. 5+1. 31918)/[1+(Conc/3. 93328)^ 957367]0'9536893、本实用新型蛋白悬浮芯片法检测血清中兔抗禽流感H5migG的灵敏度和动态 范围根据最低检出限定义和剂量-反应标准曲线方程，本实用新型即蛋白悬浮芯片方 法检测兔抗禽流感H5NlIgG的灵敏度为0. 0015ng/mL (Cutoff = 8. 6213，MFI (空白对照) =6. 5，标准差=0. 7071)。本实用新型定义最高检出限为使编码微球的结合位点处于饱和状态的检测物浓 度。根据标准曲线随着兔抗禽流感H5migG浓度的升高，其对应的MFI值也随之递增，当兔 抗禽流感H5migG浓度超过0. 05mg/mL时，抗原抗体的免疫反应未达到饱和状态，MFI值还 没进入平台期，说明样品中的待检物浓度还没达到使MFI值饱和的浓度，需要高浓度的样 品再检测。因此，根据最低检出限与最高检出限可以判定本发明即蛋白悬浮芯片定量检测 兔抗禽流感H5m IgG的动态范围为48. 828 50000ng/mL。实施例6、蛋白悬浮芯片方法与ELISA方法检测禽流感抗体的比较1、生物素-亲和素ELISA (BAS-ELISA)检测方法作为对比，生物素-亲和素ELISA采用包括下列步骤1)向普通ELISA微孔板每孔加入50yL用PBS缓冲液稀释的禽流感H5蛋白 5-50μ g，4°C静止过夜；2)加入封闭液，在37°C封闭2小时；3)洗液洗3次，拍干；4)加入检测样品，每孔50 μ L，室温放置40分钟；洗液洗3次，拍干；5)加入适量生物素化检测抗体，每孔50 μ L，室温放置30分钟；洗液洗3次，拍干；6)加入适量SA/HRP (辣根酶标记链霉亲和素)，50 μ L/孔，室温放置3分钟；洗液 洗3次，拍干；7)加入TMB显色液(可溶型单组分TMB底物溶液)显色，50 μ L/孔，室温放置10 分钟；8)用 2M H2SO4 终止反应;9)应用酶标仪测读A450nm数值。2、样品的蛋白悬浮芯片检测方法采用间接法测抗体的免疫学检测模式，检测过程中全部反应均在96孔滤板上进 行。1)每孔加入50 μ L含相应编码微球的工作溶液，洗液洗涤并用真空泵抽滤2次；2)加入50μ L检测样品，混勻后室温避光震摇30分钟，用清洗液洗涤并抽滤3次；3)加入50 μ L适当浓度的用抗体稀释液稀释后的生物素化抗体，混勻后室温避光 震摇30分钟，洗液洗涤并真空泵抽滤3次；4)加入50 μ L的SA-PE，混勻后室温避光震摇10分钟。用清洗液洗涤并真空泵抽 滤3次；[0119]5)加入125 μ L的检测缓冲液，经蜗旋重悬混勻；6)用Bio-Plex悬浮芯片系统读取MFI数值并分析数据。3、两种检测方法的灵敏度和动态范围及相关性的比较制备的相同一组兔抗禽流感H5W血清样品用样品稀释液10倍比稀释同时应用蛋 白悬浮芯片和ELISA方法进行检测。绘制ELISA方法检测兔抗禽流感H5W血清的标准曲 线(图中横坐标为样品浓度，纵坐标为吸光度值，坐标轴取对数-对数关系)，并与蛋白悬浮 芯片方法结果进行比较。根据两种方法标准曲线蛋白悬浮芯片方法如图2所示的灵敏度为 4. 767 X 10-6(血清滴度)，线性检测范围2X10-7 2X10-2 ；ELISA方法如图3所示的灵 敏度为105(血清滴度)，线性检测范围10-5 10-2。可以得出结论检测相同兔抗禽流感 H5N1血清样品，蛋白悬浮芯片方法比ELISA方法具有更高的检测灵敏度，即高10倍；并且 具有更宽的动态检测范围，即高2个数量级。另外，如图4所示，将两种方法检测结果在10-5 10-2范围内进行比较可以判定 蛋白悬浮芯片方法与ELISA方法有良好的相关性，相关系数为0. 9863。实施例7、人血清样品的检测1、人血清样品的准备将人血清样品用样品稀释液1 10稀释(人血清样本5 μ L加样品稀释液50 μ L 混勻)后用于蛋白悬浮芯片检测。2、人血清样品的检测1)每孔加入50 μ L含相应编码微球的工作溶液，用清洗液洗涤并用真空泵抽滤；2)加入50 μ L待检测人血清样品，混勻后室温避光震摇30分钟，用清洗液洗涤并 抽滤；3)加入50 μ L适当浓度的用抗体稀释液稀释后的生物素化羊抗人抗体，混勻后室 温避光震摇30分钟，洗液洗涤并真空泵抽滤；4)加入50 μ L的SA-PE，混勻后室温避光震摇10分钟。洗液洗涤并真空泵抽滤；5)加入125 μ L的检测缓冲液，经蜗旋重悬混勻；6)用悬浮芯片系统读取MFI数值，根据标准曲线，确定待检测人血清中禽流感抗 体的浓度。经过多次重复试验，生物素化SPA稀释比例选用1 2500稀释，SA-PE稀释比例 选用1 300稀释，经过对94份人血清的检测，所得的MFI值的均值与其标准差的3倍之 和为作为判断阴阳性的界值，即C utoff值为2观6，换算为浓度值是0. 68ng/mL，检测得到 的MFI值如果大于2286，即血清中的禽流感抗体浓度过高，可视为禽流感抗体阳性可能被 禽流感病毒感染，如果MFI值小于2286，即血清中的登革热抗体浓度低于0. 68ng/mL可判断 为禽流感抗体阴性，未感染禽流感病毒或禽流感病毒隐性携带者。
权利要求1.一种检测血清样本中禽流感抗体的蛋白悬浮芯片系统，其特征在于，该芯片系统包 括芯片基体、加液系统、悬浮芯片检测仪和计算机，其中，芯片基体内装有相关缓冲溶液和 待测抗体，相关缓冲液中设置有032号编码微球，编码微球上包被有捕获抗原，加液系统依 次向芯片基体中加入生物素标记的二抗和/或SPA、荧光信号检测物，悬浮芯片检测仪包括 微细管检测通道和检测激光，反应后的溶液吸入到微细管检测通道中，以使得每个编码微 球依次通过微细管检测通道，检测激光激发并识别编码微球的颜色及其上待测物的荧光信 号，计算机与悬浮芯片检测仪相连，并记录、分析悬浮芯片检测仪的测量结果。
2.如权利要求1所述的蛋白悬浮芯片系统，其特征在于，所述相关缓冲溶液包括用于 所述待测抗体稀释的样品稀释液、稀释所述编码微球所用的微球稀释液、稀释所述生物素 标记的二抗和/或SPA所用的抗体稀释液、每个反应之后洗涤编码微球所用的微球清洗液、 SA-PE稀释液、检测缓冲液。
3.如权利要求2所述的蛋白悬浮芯片系统，其特征在于，所述捕获抗原优选为禽流感 H5蛋白。
4.如权利要求2所述的蛋白悬浮芯片系统，其特征在于，所述待测抗体为血清样品。
5.如权利要求2所述的蛋白悬浮芯片系统，其特征在于，所述生物素标记的二抗和/或 SPA优选为Biotin-羊抗兔和/或Biotin_SPA。
6.如权利要求2所述的蛋白悬浮芯片系统，其特征在于，所述荧光信号检测物为链亲 和素-藻红蛋白。
7.如权利要求1所述的蛋白悬浮芯片系统，其特征在于，所述芯片基体为96孔滤板或者微量离心管。
8.如权利要求1所述的蛋白悬浮芯片系统，其特征在于，所述检测激光包括用激发所 述编码微球基质中的颜色、识别编码微球分类编码以确定检测项目的红色激光，用于激发 并识别待测分子的颜色信号、记录信号强弱以检测所述待测抗体的含量的绿色激光。
专利摘要本实用新型公开了一种检测血清中禽流感抗体的蛋白悬浮芯片系统，包括芯片基体、加液系统、悬浮芯片检测仪和计算机，芯片基体内装有相关缓冲溶液和待测抗体，相关缓冲液中设置有编码微球，编码微球上包被捕获抗原，加液系统依次向芯片基体中加入生物素标记的二抗和/或SPA、荧光信号检测物，悬浮芯片检测仪包括微细管检测通道和检测激光，编码微球依次通过微细管检测通道，检测激光激发并识别编码微球的颜色及其上待测物的颜色，计算机与悬浮芯片检测仪相连，并记录、分析悬浮芯片检测仪的测量结果。悬浮芯片技术利用微球在溶液中反应，利用激光检测技术，提高了样品检测的准确性和重复性，具有优于片膜芯片的操作简便、重复性好等特点。
文档编号G01N33/543GK201903543SQ20102062844
公开日2011年7月20日 申请日期2010年11月24日 优先权日2010年11月24日
发明者孙肖红, 徐宝梁, 杨宇, 杨永莉, 王静 申请人:中国检验检疫科学研究院