专利名称：用于检测i型糖尿病特征蛋白的质谱模型及构建方法
技术领域：
本发明涉及糖尿病检测领域，为一种全新的非入侵性检测方法，在体外对糖尿病， 特别是I型糖尿病进行的发现和检测，其敏感性和特异性均达到以上。
背景技术：
糖尿病是由于胰岛素不足而引起的代谢性疾病。基本特征是长期高血糖。胰岛素是由胰腺中β细胞分泌的，是葡萄糖代谢中不可缺少的一种激素。当胰岛素分泌不足，葡萄糖利用及贮存受阻，血液中葡萄糖浓度(血糖浓度)就会升高。血糖浓度超过一定水平， 多余的葡萄糖便通过肾脏排出体外，这时化验小便会发现尿糖阳性，故称糖尿病。糖尿病分原发性和继发性两大类。原发性糖尿病是指其发病原因尚未明确，也称特发性糖尿病或原因不明性糖尿病，占绝大多数。一般所称糖尿病即指原发性糖尿病。可分以下几型1胰岛素依赖型糖尿病(IDDM，I型)该型约占糖尿病总数的5% _10%，发病年龄多小于40岁，主要为幼年及青少年， 偶见于非肥胖的成人。患者体内胰岛素极少或缺乏，发病时糖尿病症状较明显，病情较重， 有酮症倾向(指易发生糖尿病酮症酸中毒)必须依赖外源性胰岛素为生，一旦中止胰岛素治疗则会威胁生命。2非胰岛素依赖型糖尿病(NIDDM，II型)该型约占糖尿病总数的90%或以上，多于40岁后发病，起病缓慢、隐匿，临床症状不典型，病情较轻，有些病人是因动脉硬化、冠心病、肾脏疾病或眼科疾病就诊而发现糖尿病，有些是在健康检查时才发现患有糖尿病。该型糖尿病一般无酮症倾向，控制饮食或加用口服降糖药治疗便能控制病情，少数病人为控制血糖必须用胰岛素治疗，但不依赖外源性胰岛素(即停用胰岛素不致于威胁病人生命)。目前我国糖尿病及糖耐量低减的患病率分别为2. 51%和3. 27%，糖尿病患病率最高地区为新疆自治区克拉玛依市6%)，其次是北京地区(3. 99%)，浙江省糖尿病患病率为2. 96%。虽然中国糖尿病患病率与世界发达国家相比仍然较低，但是中国人口众多， 估计现有25-64岁的糖尿病人约1500万。另一观察发现，大于25岁的成年人糖尿病的发病率超过130/10万，推算在大于25岁的人口中，每年将有70万糖尿病新病人，调查还发现， 糖尿病患病率随着年龄、体重还发现，糖尿病患病率随着年龄、体重及平均收入的增加而增加，肥胖者患病率约为正常体重者的5倍。尿病对患者生活质量和健康的严重影响，以及控制糖尿病所付出的代价体现在以下几个方面死亡率增加2-3倍；患心脏病及中风几率增加2-3倍；失明者比正常人多10倍；坏疽和截肢者比正常人多20倍。引发致命肾脏病的主要原因。现在国内外还没有基于血清多肽的糖尿病诊断方法，我们应用基于质谱的蛋白质组学技术提供一种可用于诊断的方法。基质辅助激光解析电离飞行时间质谱(MALDI-T0F-MS)是近年来发展起来的一种新型的软电离生物质谱，其原理是用激光照射样品与基质形成的共结晶薄膜，基质从激光中吸收能量传递给生物分子，而电离过程中将质子转移到生物分子或从生物分子得到质子，而使生物分子电离的过程。TOF的原理是离子在电场作用下加速飞过飞行管道，根据到达检测器的飞行时间不同而被检测即测定离子的质荷比(M/Z)与离子的飞行时间成正比， 检测离子。尽管MALDI-T0F的准确度高达0. 1 % 0. 01 %，远远高于目前常规应用的SDS 电泳与高效凝胶色谱技术，但在糖尿病标志物的应用中仍然存在一些缺陷，因此国内迄今为止尚无采用MALDI-T0F-MS技术获得检测糖尿病血清特征蛋白的报道。

发明内容
为了解决上述问题，本发明目的在于提供一种用于检测I型糖尿病特征蛋白的质谱模型及其制备方法。为了实现上述目的，本发明首先提供一种用于检测I型I型糖尿病特征蛋白的质谱标记，其包括质荷比为:7010. 32,8141. 47,7597. 7,7645. 62,3314. 94,8862. 88,7765. 57、 9062.14,7921.58,7832.64,6630.96,4643.76,9289.11,8565.22,3302.42,9429.72 和 1984. 14m/z 的峰。本发明还提供一种用于检测I型糖尿病特征蛋白的质谱模型，该质谱模型中包含质荷比为 7010. 32m/z、8141. 47m/z、7597. 7m/z、7645. 62m/z、3314. 94m/z、8862. 88m/z、 7765. 57m/z、9062. 14m/z、7921. 58m/z、7832. 64m/z、6630. 96m/z、4643. 76m/z、9289. llm/z、 8565. 22m/z、3302. 42m/z、9429. 72m/z 和 1984. 14m/z 的峰，其中，当 3314. 94m/z、6630. 96m/ ζ,3302. 42m/z和1984. 14m/z的峰上调表达，其余质荷比的峰都下调表达时，预示为I型糖尿病患者或潜在患者。所述的3314. 94m/z、6630. 96m/z、3302. 42m/z和1984. 14m/z特征蛋白的上调表达的临界值分别为 31. 44士8. 94,85. 84士51. 23,9. 70士3. 31 和 20. 01 士5. 07。 所述的 7010.32m/z、8141. 47m/z、7597. 7m/z、7645. 62m/z、8862. 88m/z、7765. 57m/z、 9062. 14m/z、7921. 58m/z、7832. 64m/z、4643. 76m/z、9289. llm/z,8565. 22m/z 和 9429. 72m/ ζ的特征蛋白下调表达的临界值分另为34. 36士9. 05、15. 17士4. 61,9. 45士2. 58、 14. 69士3. 31,17. 10士5. 98,115. 29士47. 08,24. 36士9. 51,16. 19士4. 34,11. 59士3. 81、 202. 98士98. 84,960. 32士365. 62,8. 40士 1. 64 和 45. 82士 19. 61。进而，本发明提供一种建立所述质谱模型的方法，包括如下步骤1)收集多例临床确诊的I型糖尿病患者血清和正常对照人员的血清作为两组血清标本，进行低温冷冻备用；2)对血清蛋白进行质谱前预处理；3)对预处理过的两组血清蛋白进行质谱检测读取，获得两组血清多肽的指纹图谱；4)对所有的糖尿病患者和正常人血清多肽的指纹图谱进行标准化处理，并收集数据；5)对所得数据进行标准化处理，筛选出具有下列质荷比峰的糖尿病特征蛋白:7010.32,8141.47,7597.7,7645.62,3314. 94,8862. 88,7765. 57,9062. 14,7921. 58、 7832. 64,6630. 96,4643. 76,9289. 11,8565. 22,3302. 42,9429. 72,1984. 14m/z,根据这 17 个质荷比峰建立检测糖尿病特征蛋白的质谱模型。其中，所述步骤幻预处理的方法是采用磁珠纯化和稳定样品中的血清蛋白或多肽。
其中，所述步骤3)采用WCX2芯片对两组血清蛋白进行吸附，并对结合在弱阳离子 WCX2芯片上的两组血清蛋白进行读取，获得两组血清多肽的指纹图谱。本发明与其它糖尿病的检测方法比较，具有以下优点第一，本发明采用糖尿病患者与正常人具有差异的多个特征蛋白组合进行对糖尿病血清的检测，并采用了传统统计学与现代生物信息学方法相结合的方法进行数据处理， 从而得到糖尿病患者和健康人血清蛋白质指纹图谱检测模型，并且所发现的一系列蛋白质质荷比峰为寻找新的更理想的疾病标志物提供了基础和资源。第二，与以往的血清学检测方法比较具有较高的敏感性和特异性，并能用于筛选抗糖尿病的药物中。第三，本发明模型的构建方法设计合理可行，为提供糖尿病的临床治愈率提供了新的筛查方法，同时也为探索肿瘤发生发展的机制提供了新的思路。第四，利用本发明分析了 50份血清样品，验证结果显示，50例判断正确，检出率达 100%，特异性为100%，灵敏性为100%，因此本发明可对糖尿病作出诊断，提高病人的存活率和生活质量。


图1为部分健康人血清和I型糖尿病患者血清的多肽图谱。图2重复做样的5个Sigma血清质谱指纹图。图3为蛋白峰在所有建模型样品中的表达水平展示，箭头指向荷质比为 7010. 32m/z的I型糖尿病特征蛋白峰；其中箭头指向建模型的7010. 32m/z的特征蛋白带， 红色代表正常组，绿色代表I型糖尿病组。图4为蛋白峰在所有建模型样品中的表达水平展示，箭头指向荷质比为 3314. 94m/z的I型糖尿病特征蛋白峰；其中箭头指向建模型的3314. 94m/z的特征蛋白带， 红色代表正常组，绿色代表I型糖尿病组。图5为蛋白峰在所有建模型样品中的表达水平展示，箭头指向荷质比为 7765. 57m/z的I型糖尿病特征蛋白峰；其中箭头指向建模型的7765. 57m/z的特征蛋白带， 红色代表正常组，绿色代表I型糖尿病组。
具体实施例方式以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。实施例11、样本和仪器共50例血清样本，其中25例来自I型糖尿病患者，另外25例来自健康人群。所有25例I型糖尿病患者均经诊断病理报告确定。所有的血清样本均在清晨空腹下抽取，分离血清后储存在-80低温冰箱中。基质辅助激光解析飞行时间质谱Autof IexII T0F/T0F及实验用的WCX磁珠试剂盒由美国Bruker公司研制。使用Bruker公司的数据分析软件Clinprotools做数据的预处理.应用Waters公司的液相系统Nano Aquity UPLC和HiermoFisher公司的质谱系统 LTQ ObitrapXL(Thermo)，金星磁珠富集法蛋白鉴定。
2、血清的采集及处理收集静脉血在BD管中，避免溶血。缓慢地上下振荡管五次，使血液中的凝结块混勻。室温(25°C )血凝结1小时，垂直放置。其中血液必须精确凝结一小时，否则，由于样品不同的凝结时间而导致不同的肽谱。室温下，用临床离心机以1. 400-2. OOOg离心SST管 (真空采血管，BD公司)十分钟。吸取血清(上清液)到对应的已标记管中。标记干净的 0.5ml离心管，同一血清样品50 μ 1—管，分装多管。立即冻存血清样品于-80°C。由于反复冻融血清样品易造成多肽沉淀，从而使得肽谱丢失部分多肽，应避免反复冻融。冻存血清分为永久保存和待分装的。血清分装后可在-80°C保存多年。血清样品的磁珠处理在进行Clirfrot实验前，从低温冰箱提取分装的血清样品各1管，放于湿冰上。化冻60 90分钟。取出10 μ 1磁珠结合缓冲液(BS)，10 μ 1混勻的磁珠悬浮液，5μ 1血清样品至样品管，混勻。室温静置5min后，将样品管放入磁珠分离器。 使磁珠贴壁1分钟，磁珠与悬浮的液体分离，吸去悬浮的液体，再向样品管中加入100 μ 1磁珠清洗缓冲液(WQ，在磁珠分离器前后相邻两孔间反复移动样品管10次。最后一次使样品管在磁珠分离器上静置，磁珠与悬浮的液体分离，吸去悬浮的液体。重复从加100 μ 1磁珠清洗缓冲液，到最后吸去悬浮液体的操作步骤共3次。从磁珠分离器上取下样品管，并向样品管中加入5 μ 1磁珠洗脱缓冲液(EQ，溶解贴壁的磁珠，样品管放入磁珠分离器，磁珠贴壁2min，磁珠与悬浮的液体充分分离后，将上清液移入干净的刚加入5μ 1磁珠稳定缓冲液 (SS)O. 5ml 样品管。3.生物信息学方法(一 )质谱数据采集应用Autof lexIITOF/TOF质谱仪。激光能量 50% 时，IOshots 去杂，36% 时 50shots 采集一个样品结晶点的某一个点，平均每个样品结晶点收集8次共400shots。激光频率 50Hz。数据收集范围l-20KDa。在每8个样品结晶点收集数据前用标准品进行外标校正， 平均分子量偏差小于lOOppm。参见图1，图1中为血清多肽指纹谱图，前三个(sigmaA-C) 为健康人的，后三个为I型糖尿病患者的。实验质控(1)对于每一张采集到的原始图谱，我们设定S/N >= 5的峰数量做为评判图谱质量的一个标准；对于峰数量大于50的图谱才保存，舍弃峰数量小于50的图谱。 (2)针对整个实验操作，采用Sigma血清的组内变异系数保证实验的一致性，本实例方法的变异系数为16. 2%，满足一致性允许范围，说明实验一致性良好，参见表1、图2。表1为 Sigma血清中12个蛋白峰的变异系数值；图2为实验中5个Sigma A-E血清的指纹图谱。表ISigma血清的组内变异系数
权利要求
1.用于检测I型糖尿病特征蛋白的质谱标记，其包括质荷比为7010.32、8141. 47、 7597.7,7645.62,3314.94,8862.88,7765.57,9062. 14,7921.58,7832.64,6630.96, 4643. 76,9289. 11,8565. 22,3302. 42,9429. 72 和 1984. 14m/z 的峰。
2.用于检测I型糖尿病特征蛋白的质谱模型，其特征在于，该质谱模型中包含质荷比为 7010.32,8141.47,7597.7,7645.62,3314.94,8862.88,7765.57,9062.14,7921.58、 7832. 64,6630. 96,4643. 76,9289. 11,8565. 22,3302. 42,9429. 72 和 1984. 14m/z 的峰，其中，当3314. 94,6630. 96,3302. 42和1984. 14m/z的峰上调表达，其余质荷比的峰都下调表达时，预示为I型糖尿病患者或潜在患者。
3.建立权利要求2所述质谱模型的方法，包括如下步骤1)收集多例临床确诊的I型糖尿病患者血清和正常对照人员的血清作为两组血清标本，进行低温冷冻备用；2)对血清蛋白进行质谱前预处理；3)对预处理过的两组血清蛋白进行质谱检测读取，获得两组血清多肽的指纹图谱；4)对所有的I型糖尿病患者和正常人血清多肽的指纹图谱进行标准化处理，并收集数据；5)对所得数据进行标准化处理，筛选出具有下列质荷比峰的17个I型糖尿病特征蛋白:7010. 32,8141. 47,7597. 7,7645. 62,3314. 94,8862.88,7765.57,9062.14,7921.58、 7832. 64,6630. 96,4643. 76,9289. 11,8565. 22,3302. 42,9429. 72 和 1984. 14m/z，根据这 17 个质荷比峰建立检测I型糖尿病特征蛋白的质谱模型。
4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，其中步骤幻预处理的方法是采用磁珠纯化和稳定样品中的血清蛋白或多肽。
全文摘要
本发明提供了一种用于检测I型糖尿病特征蛋白的质谱模型，其包括质荷比为7010.32、8141.47、7597.7、7645.62、3314.94、8862.88、7765.57、9062.14、7921.58、7832.64、6630.96、4643.76、9289.11、8565.22、3302.42、9429.72、1984.14m/z，其中，当3314.94、6630.96、3302.42和1984.14m/z的峰上调表达，其余质荷比的峰都下调表达时，预示为I型糖尿病患者或潜在患者。本发明的质谱模型，可用于I型糖尿病早期检测和筛查，方法简单易于操作，准确性高，为I型糖尿病早期检测和筛查提供了新的思路。
文档编号G01N30/06GK102323365SQ20111021697
公开日2012年1月18日 申请日期2011年7月29日 优先权日2011年7月29日
发明者任晶, 殷汝雷, 胡晓慧, 马庆伟 申请人:毅新兴业(北京)科技有限公司