专利名称：一步检测鸡新城疫和传染性法式囊病毒的试纸条的制作方法
技术领域：
本实用新型属于预防兽医学检验领域，具体是涉及一种一步检测鸡新城疫和传染 性法式囊病毒的试纸条。
背景技术：
鸡新城疫(Newcastle Disease, ND) 一直是给养鸡业带来重大危害的疫病，被 国际兽医局(OIE)列为A类传染病，该病对世界贸易有较大的商业影响。传染性法氏囊病 (IBD)是一种急性高度接触性传染病，该病对雏鸡或中雏易感性最强，感染率可达100%，死 亡率比较高，鸡群一经感染，就引起大面积死亡，给养殖户造成巨大经济损失。严重影响养 鸡业的发展。目前，鸡病的爆发已发生了一些新的变化，以往那种单纯发生某一种疾病的 情况已不多见，取而代之的是几种疫病混合感染、病毒性疫病、隐性慢性疾病日见增多，呼 吸道病的发病率超过了肠道病.这些都使鸡病日趋复杂化，给鸡病诊断与防治带来一定的 难度，特别是鸡新城疫和传染性法式囊，病鸡的临床症状有很大的差异，不同宿主对感染后 的反应也不一样，这使诊断更为复杂和困难，单一临床和病变不能作为诊断的依据。对禽病毒的检测方法，主要有病毒分离、血清学诊断以及分子生物学方法，但病毒 分离时间长，要求条件高，分离率低，而采集患者急性期与恢复期双份血清进行抗体测定来 确认，又不能及时进行诊断，因此，使这两种方法在使用中受到很大的限制，而免疫金标法 (Immunochromatography Assay)是九十年代初发展起来的，因其快速、操作简便、试剂稳 定、可室温储运、不易污染的特点得到广泛的应用。它是免疫亲和技术、印记技术、免疫标记 技术和层析技术的组合。将包被抗体、胶体金标记抗体固相化，与样本吸附材料等组合在一 起，制备出免疫层析诊断试条，使用时只需要把该试条下插入样品溶液，数分钟就可以判断 结果。与免疫渗滤法比较，稳定性好，操作更简便、检测更快速，且由于为干试条形式，无需 低温保存，储运也方便，如果能将试条形式的检测禽病毒的方法普及到地农户、养殖户、基 层及个人手中，使其尽早发现疫病，能够得到及时有效处理，以便降低经济损失。但是目前还没有关于同时检测鸡新城疫和传染性法式囊病毒的装置或者检测工 具。
发明内容本实用新型提供了一种一步检测鸡新城疫和传染性法式囊病毒的试纸条，可以解 决现有技术存在的不能同时检测鸡新城疫和传染性法式囊病毒的问题。本实用新型的试纸 条可以一步检测鸡新城疫和传染性法式囊病毒。为解决上述技术问题，本实用新型采用以下技术方案予以实现—种一步检测鸡新城疫和传染性法式囊病毒的试纸条，包括底衬，所述底衬上面 的中部粘帖包被膜，所述包被膜中部有一条包被鸡新城疫病毒的抗体的检测线、一条包被 鸡传染性法式囊病毒的抗体的检测线和一条包被抗鼠IgG抗体的控制线，所述包被膜的上 面左右分别粘帖涂覆金标抗体的玻璃纤维膜和吸水纸，所述玻璃纤维膜上面粘贴样品垫。[0008]本实用新型的试纸条利用现代国际最先进的胶体金免疫层析技术，通过在试纸条 上同时设置包被鸡新城疫病毒的抗体的检测线、包被鸡传染性法式囊病毒的抗体的检测线 和包被抗鼠IgG抗体的控制线，能够同步检测鸡新城疫病毒和鸡传染性法式囊病毒，为地 农户、养殖户、基层及个人自测等提供一种同时检测鸡新城疫和传染性法式囊病毒的试纸 条，该试纸条具有特异性强、灵敏度高、检测速度快的优点，且不需使用仪器设备，成本低 廉，操作简便，能广泛应用于地农户、养殖户、基层及个人对于鸡新城疫病毒和鸡传染性法 式囊病毒的检测，为及时发现疫情，有效的进行检测奠定了基础。进一步地，所述包被鸡新城疫病毒的抗体为单克隆抗体、多克隆抗体中的一种或 两种。进一步地，所述包被鸡传染性法式囊病毒的抗体为单克隆抗体、多克隆抗体中的 一种或两种。进一步地，所述涂覆金标抗体的玻璃纤维膜中有由胶体金颗粒标记的抗鸡新城疫 病毒和抗鸡传染性法式囊病毒的单克隆抗体。上述试纸条的制备方法包括如下步骤1)先制备包被膜，用包被缓冲液稀释抗鸡新城疫的单克隆抗体或多克隆抗体、抗 鸡传染性法式囊病毒的单克隆抗体或多克隆抗体以及抗鼠IgG抗体，并将稀释后的三种 抗体分别平行地喷于硝酸纤维膜的中部上，三种抗体渗入硝酸纤维膜后分别形成鸡传染性 法式囊病毒的检测线、鸡新城疫病毒的检测线和抗鼠IgG的控制线，制得包被膜；2)再制备涂敷金标抗体的玻璃纤维膜；3)将包被膜粘贴在底衬上面的中部，在包被膜的上面左右分别粘帖涂覆金标抗体 的玻璃纤维膜和吸水纸；4)涂覆金标抗体的玻璃纤维膜上面粘贴样品垫，做成大板，切割即得胶体金试纸
^^ ο上述试纸条在一步检测鸡新城疫和传染性法式囊病毒中的应用。
图1是本实用新型的试纸条的横断面结构示意图；其中1、底衬；2、样品垫；3、玻璃纤维膜；4、包被膜；5、吸水纸；6、包被鸡新城疫病毒的 抗体的检测线；7、包被鸡传染性法式囊病毒的抗体的检测线；8、包被抗鼠IgG抗体的控制 线。
具体实施方式
以下结合附图和具体实施方式
对本实用新型作进一步详细的说明。如图1所示，一种一步检测鸡新城疫和传染性法式囊病毒的试纸条，包括底衬1， 底衬1上面的中部粘帖包被膜4，包被膜4中部有一条包被鸡新城疫病毒的抗体的检测线 6、一条包被鸡传染性法式囊病毒的抗体的检测线7和一条包被抗鼠IgG抗体的控制线8，包 被膜4的上面左右分别粘帖涂覆金标抗体的玻璃纤维膜3和吸水纸5，玻璃纤维膜3上面粘 贴样品垫2。[0023]本实用新型的试纸条可以用于一步检测鸡新城疫病毒和鸡传染性法式囊病毒。其中，包被鸡新城疫病毒的抗体为单克隆抗体、多克隆抗体中的一种或两种；包被 鸡传染性法式囊病毒的抗体为单克隆抗体、多克隆抗体中的一种或两种。涂覆金标抗体的玻璃纤维膜中有由胶体金颗粒标记的抗鸡新城疫病毒和抗鸡传 染性法式囊病毒的单克隆抗体。胶体金试纸条的具体制备方法如下新城疫病毒的单克隆抗体细胞株的制备和检定慢慢搅动含有新城疫病毒的鸡胚尿囊液，并加入氯化钠，使其终浓度为0. 5mol/L, 再加入10% (重量百分数，下同)的聚乙二醇6000 (PEG6000)，4°C过夜，8000r/min离心30 分钟，收集病毒沉淀，将病毒沉淀用磷酸盐缓冲液(PBS)溶解，4°C过夜，以lOOOOr/min离心 1小时，所得沉淀即为浓缩的病毒，储存在-20°C低温冰箱中备用。从_20°C低温冰箱取出浓缩的病毒，溶化后给BALB/C小鼠多点皮下注射(0 .5ml /只)，间隔15天，共免疫3次，融合前3日，在小鼠腹腔以上述浓缩的病毒0.25 ml的 抗原量进行攻击。用含10% (体积百分数，下同)小牛血清的DMEM培养SP2/0细胞和免疫 的BALB/C小鼠的淋巴细胞，分别按2X IO7和2X IO8比例用聚乙二醇1500 (PEG1500)融 合，将融合孔中的上清液分别加在新城疫病毒抗原包被的聚乙烯96孔扳上，用ELISA法检 测，确定细胞阳性孔。将检测所得的阳性株以有限稀释法进行亚克隆，将亚克隆所得的单抗 细胞株于体外进行传代培养，并进行反复液氮冻存和复苏，产生新城疫病毒单克隆抗体阳 性率100%，且保持稳定分泌抗体的能力，其ELISA效价达到1:1000以上。在无菌条件下每 只小鼠腹腔注射液体石蜡0. 5ml，一周后每只小鼠腹腔注射扩大培养为0. 2ml含1-3XI06 个杂交瘤细胞。注射细胞株7-10天后，或小鼠濒死前一次采集腹水，-20°C下保存。采用 硫酸铵沉淀法粗提，进而用HITraprProteinA柱纯化，经SDS-PAGE电泳检定，仅显示单一 蛋白带。采用NaSCN竞争ELISA实验，测定其半数有效量(ED5tl)的下降值，来间接反映其 抗体亲合力的大小。选择其中亲和力较好的细胞株，用相加ELISA法对其的抗原结合位点 进行检测。传染性法式囊病毒的单克隆抗体细胞株的制备和检定 根据传染性法式囊病毒病毒vp2序列构建表达载体，诱导产生vp2蛋白的包涵体， 破碎纯化，获得高纯度的传染性法式囊病毒病毒vp2，储存在_20°C低温冰箱中备用。 从_20°C低温冰箱取出浓缩的病毒，溶化后给BALB/C小鼠多点皮下注射(0 .5ml /只)，间隔15天，共免疫3次，融合前3日，在小鼠腹腔以上述浓缩的病毒0.25 ml的 抗原量进行攻击。用含10%小牛血清的DMEM培养SP2/0细胞和免疫的BALB/C鼠的淋巴 细胞，分别按2X107和2X108比例用聚乙二醇1500 (PEG1500)融合，将融合孔中的上清 液分别加在鸡传染性法式囊病毒抗原包被的聚乙烯96孔扳上，用ELISA法检测，确定细胞 阳性孔。将检测所得的阳性株以有限稀释法进行亚克隆，将亚克隆所得的单抗细胞株于体 外进行传代培养，并进行反复液氮冻存和复苏，产生鸡传染性法式囊病毒单克隆抗体阳性 率100%，且保持稳定分泌抗体的能力，其ELISA效价达到1:1000以上。在无菌条件下每 只小鼠腹腔注射液体石蜡0. 5ml，一周后每只小鼠腹腔注射扩大培养为0. 2ml含1-3XI06 个杂交瘤细胞。注射细胞株7-10天后，或小鼠濒死前一次采集腹水，-20°C下保存。采用 硫酸铵沉淀法粗提，进而用HITraprProteinA柱纯化，经SDS-PAGE电泳检定，仅显示单一蛋白带。采用NaSCN竞争ELISA实验，测定其ED5tl的下降值，来间接反映其抗体亲合力的 大小。选择其中亲和力较好的细胞株，用相加ELISA法对其的抗原结合位点进行检测。包被膜的制备包被缓冲液的制备将0. 05M、pH9. 6的碳酸盐缓冲液(PBS)，用0. 22u膜过滤，置
于4°C备用，有效期为7天。缓冲液的制备的封闭将0. 01M、pH7. 0的PBS，用0. 22u膜滤过，置于4°C备用，有 效期为7天。封闭工作液的配制将含2% BSA、2%脱脂奶、0. 01Μ、ρΗ7· 0的PBS，用0. 22u膜滤
过，置于4°C备用，有效期为3天。抗鸡新城疫病毒的检测线6的制备调试喷膜机，喷液量为25微升/35厘米，用包 被缓冲液稀释抗鸡新城疫病毒的单克隆抗体，浓度为70ug/ml，在硝酸纤维膜中部上划线， 室温晾干20分钟。抗鸡传染性法氏囊病毒检测线7的制备调试喷膜机，喷液量为25微升/35厘米， 用包被缓冲液稀释抗鸡传染性法氏囊病毒的单克隆抗体，浓度为70ug/ml，在硝酸纤维膜中 部上划线，该线与抗鸡新城疫病毒检测线6平行，两线间隔5mm，应细致均勻，室温晾干20分钟。控制线8的制备调试喷膜机，喷液量为25微升/35厘米，用包被缓冲液稀释抗鼠 IgG抗体，浓度为2mg/ml，在硝酸纤维膜上划线，该线与抗鸡传染性法氏囊病毒检测线7平 行，两线间隔5mm，应细致均勻，室温晾干20分钟。该三线用的液体分别渗入硝酸纤维膜中， 即分别为抗鸡新城疫病毒检测线6、抗鸡传染性法氏囊病毒检测线7和控制线8。包被膜4制备用上述封闭工作液将含有检测线6和控制线8的硝酸纤维膜于 37°C封闭60分钟，取出后置37°C下烘干处理两小时，封袋备用。涂覆金标抗体的玻璃纤维膜3的制备氯金酸水溶液的配制将IOg氯金酸用IOOOml双蒸水溶解，配成1 %的水溶液，置 于4°C备用，有效期为3天。柠檬酸三钠的配置用双蒸水溶解柠檬酸三钠，配成的水溶液，置于4°C备用， 有效期为3天。0. IM碳酸钾水溶液的配制将13. 8g碳酸钾用IOOOml用双蒸水配制成0. IM碳 酸钾水溶液，用0. 22u膜滤过，置于4°C备用，有效期为7天。标记洗涤液的配制将20g BSA用IOOOml 0. 01M、pH7. 0的PBS配置成2% BSA溶
液，用0. 22u膜滤过，置于4°C备用，有效期为15天。金标抗体保存液的配置将IOg BSA、5g脱脂奶粉、0. 5g NaN3和Iml Tween-20在 1000 ml 0.01M、pH 7. 0的PBS中溶解，用0. 22u膜滤过，置于4°C备用，有效期为15天。胶体金的烧制用双蒸水将氯金酸稀释成0. 01%，置电炉煮沸，按每100毫升 0. 01 %氯金酸加入4毫升1 %柠檬酸三纳，继续煮沸，直到液体呈亮红色即停止加热，冷却 至室温后补足失水。外观应纯净，透亮，无沉淀和漂浮物。金标抗体的制备用0. IM碳酸钾水溶液调胶体金pH值至7. 6，按20微克抗体 /毫升胶体金加入抗新城疫和传染性支气管炎病毒的单克隆抗体，混勻，静置30分钟，以 12000rpm离心30分钟，弃去上清液，沉淀用标记洗涤液洗涤两次，最后一次弃去上清液，
6将沉淀用十分之一初始胶体金体积的金标抗体保存液溶解，置于4°C备用，有效期为7天。将标记好的胶体金均勻地铺在玻璃纤维膜上，用每毫升溶液铺10平方厘米，干 燥，封袋，置于4°C备用。胶体金试纸条的制作底衬1、样品垫2和吸水纸5是本领域通用的部件。将上述包被膜4、覆金标抗体 的玻璃纤维膜3、底衬1、样品垫2和吸水纸5依次粘贴起来，得到试纸板，最后将该试纸板 切割成不同宽度的试纸条即可。上述的胶体金试纸条在检测鸡新城疫和传染性法式囊病毒中的应用本试纸条可以用来检测发病期鸡的口腔或者肛门拭子中含有的液体样品，操作 时，把发病期鸡的口腔或者肛门拭子中的液体离心分离，将所得的液体滴加在本试纸条的 样品垫2上，出现的结果在试纸条的鸡新城疫病毒的抗体的检测线6、鸡传染性法式囊病毒 的抗体的检测线7和控制线8位置上各出现一条紫红色条带时，鸡新城疫和传染性法式囊 病毒均为阳性结果；在试纸条的鸡新城疫病毒的抗体的检测线6和控制线8位置上各出现 一条紫红色条带时，鸡新城疫病毒为阳性结果；在试纸条的鸡传染性法式囊病毒的抗体的 检测线7和控制线8位置上各出现一条紫红色条带时，鸡传染性法式囊病毒为阳性结果；仅 试纸条的控制线8位置上出现一条紫红色条带时，为阴性结果；在试纸条的控制线8位置上 未出现紫红色条带时为无效结果。以上所述，仅是本实用新型的较佳实施例而已，并非是对本实用新型作其它形式 的限制，任何熟悉本专业的技术人员可能利用上述揭示的技术内容加以变更或改型为等同 变化的等效实施例。但是凡是未脱离本实用新型技术方案内容，依据本实用新型的技术实 质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与改型，仍属于本实用新型技术方案的保 护范围。
权利要求1.一种一步检测鸡新城疫和传染性法式囊病毒的试纸条，其特征在于包括底衬，所述 底衬上面的中部粘帖包被膜，所述包被膜中部有一条包被鸡新城疫病毒的抗体的检测线、 一条包被鸡传染性法式囊病毒的抗体的检测线和一条包被抗鼠IgG抗体的控制线，所述包 被膜的上面左右分别粘帖涂覆金标抗体的玻璃纤维膜和吸水纸，所述玻璃纤维膜上面粘贴 样品垫。
2.根据权利要求1所述的试纸条，其特征在于所述包被鸡新城疫病毒的抗体为单克 隆抗体或多克隆抗体。
3.根据权利要求1所述的试纸条，其特征在于所述包被鸡传染性法式囊病毒的抗体 为单克隆抗体或多克隆抗体。
4.根据权利要求1所述的试纸条，其特征在于所述涂覆金标抗体的玻璃纤维膜中有 由胶体金颗粒标记的抗鸡新城疫病毒和抗鸡传染性法式囊病毒的单克隆抗体。
专利摘要本实用新型提供了一种一步检测鸡新城疫和传染性法式囊病毒的试纸条，可以解决现有技术存在的不能同时检测鸡新城疫和传染性法式囊病毒的问题。所述试纸条包括底衬，底衬上面的中部粘帖包被膜，包被膜中部有一条包被鸡新城疫病毒的抗体的检测线、一条包被鸡传染性法式囊病毒的抗体的检测线和一条包被抗鼠IgG抗体的控制线，包被膜的上面左右分别粘帖涂覆金标抗体的玻璃纤维膜和吸水纸，玻璃纤维膜上面粘贴样品垫。本实用新型的试纸条可以一步检测鸡新城疫和传染性法式囊病毒，具有特异性强、灵敏度高、检测速度快的优点，成本低廉，操作简便，能广泛应用于地农户、养殖户、基层及个人对于鸡新城疫病毒和鸡传染性法式囊病毒的检测。
文档编号G01N33/577GK201859147SQ20102020645
公开日2011年6月8日 申请日期2010年5月28日 优先权日2010年5月28日
发明者从雁方, 凌红丽, 朱绍辉, 肖长赏, 蒋贻海, 高亚东 申请人:青岛宝依特生物制药有限公司, 青岛康地恩药业有限公司