专利名称：一种结核分枝杆菌抗体快速测定试剂盒的制作方法
技术领域：
本实用新型涉及一种无需特殊的仪器和专业的技术人员就可完成测定的结核分 枝杆菌抗体快速测定试剂盒。
背景技术：
结核病是青年人容易发生的一种慢性和缓发的传染病。一年四季都可以发病， 15岁到35岁的青少年是结核病的高发峰年龄。潜伏期4 8周。其中80%发生在肺 部，其他部位(颈淋巴、脑膜、腹膜、肠、皮肤、骨骼)也可继发感染。人与人之间呼 吸道传播是本病传染的主要方式。传染源是接触排菌的肺结核患者。解放后人们的生活 水平不断提高，结核已基本控制，随着环境污染和艾滋病的传播，结核病又卷土重来， 发病率愈演愈烈。在历史上，它曾在全世界广泛流行，曾经是危害人类的主要杀手，夺去了数亿 人的生命。1882年科霍发现了结核病的病原菌为结核杆菌，但由于没有有效的治疗药 物，仍然在全球广泛流行。自五十年代以来，不断发现有效的抗结核药物，使流行得到 了一定的控制。但是，近年来，由于不少国家对结核病的忽视，减少了财政投入、再加 上人口的增长、流动人口的增加、艾滋病毒感染的传播。使结核病流行下降缓慢，有的 国家和地区还有所回升。所以，世界卫生组织于1993年宣布“全球结核病紧急状态”， 确定每年3月24日为“世界防治结核病日”。结核病还是因病致贫、因病返贫的主要 疾病。结核病还是一种人畜共患传染病。结核病不仅是一个公共卫生问题，也是一个社 会经济问题。控制工作任重道远。只要政府重视，加大投入、实施现代、科学的控制策 略、长期、不间断地与之斗争，结核病是可以治愈和控制的疾病。结核病可累及全身多个脏器；但以肺结核(pulmonary tuberculosis)最为常见。排 菌病人是社会传染源。人体感染结核杆菌后不一定发病，仅于抵抗力低下时方始发病。 该病病理特点是结核结节和干酪样坏死，易形成空洞。除少数可急起发病外，临床上多 呈慢性过程。常有低热、乏力等全身症状和咳嗽、咯血等呼吸系统表现。现有结核分枝杆菌检测方法的比较(1)病原学诊断病原学诊断具有非常高的特异性和正确性，是肺结核病诊断 最可靠的依据，在日常应用中重点是查找结核菌。标本来源痰液、纤维支气管镜、肺 穿刺、手术切除标本和尸检标本等。其中痰标本是最简便、易行、实用的途径，也是诊 断中最为重要、应用最广的途径。因此在肺结核诊断时要求至少有3次痰结核菌涂片检 查的结果，有条件地区同时有1 2次痰结核菌培养的结果。为提高检查的检出率，痰 标本质量也很关键，要求做到留痰标本前清水漱口，患者做深呼吸数次后收腹，用力咳 出来自支气管深部的痰液，量不少于3ml，避免留取唾液或鼻咽部分泌物。检测方法 ①涂片包括直接涂片法、集菌法、荧光法等，直接涂片检查方法简单易行，但痰中菌 量在105/ml以下时检出率低；荧光法可缩短检查时间，提高检出率，但需荧光显微镜， 一般用于工作量大的单位。②培养比涂片法有较高的敏感性，同时可进一步进行型、种的鉴定和药物敏感性测定。但常规培养法时间较长，同时需要一定的设备和条件。自 动快速培养法，可缩短培养时间，提高阳性率，但仪器设备及培养基价格高。(2)X线及CT诊断X线是目前肺结核诊断中广为应用的一种方法，可以反映 病灶部位形态、大小、密度、范围，周围情况及病灶的动态变化等，其发现病变的敏感 性较高，但对X线表现不典型的病变往往难以做出定性诊断。有些部位病变常规X线检 查不易发现，因此X线诊断必须结合临床及其他检查综合考虑。CT主要应用在诊断有一 定困难的病例，其特点是①发现一般X线检查方法未能发现的病变，如心后区、脊柱 旁与肺门影重叠的病变；②能够更清楚地显示病变的特征性改变，如胸膜内陷征、空泡 征、空洞、少量胸水等，有利于帮助确定病变性质；③确定病变所累及的范围，可以应 用CT引导做肺组织活检等，但CT同样存在对某些病灶难以定性的问题。(3)免疫学诊断结核菌侵入机体后，机体产生一系列细胞免疫和体液免疫反 应，使体内细胞免疫指标(如T淋巴细胞亚群)和体液免疫指标(如抗体)均发生改变， 这种改变可做为诊断结核病的参考。①结核菌素试验受结核菌感染的机体，结核菌素与已致敏的淋巴细胞特异性 结合，释放出淋巴因子在注射部位形成迟发性变态反应性炎症，形成红肿、硬结，因此 结核菌试验阳性反应只能说明受结核菌感染，不能做为结核病的依据，但在诊断和鉴别 诊断时仍有重要参考意义，特别是对儿童强阳性反应者意义更大。我国成年人大多结核 菌素为阳性反应，如呈阴性反应对排除结核病有一定参考意义。此外，结核菌素反应尚 受机体一般免疫状态影响，老年人、重症结核病、营养不良、免疫抑制药物等可以使结 核菌素反应阴性。引起结核菌素反应阴性的常见疾病有肿瘤、结节病、支原体感染、病 毒感染等。②血清学诊断结核菌主要的抗原成分是蛋白抗原和多糖抗原，机体在结核菌 抗原刺激下，淋巴细胞分化增殖成浆细胞，并产生特异性抗体，目前血清学诊断多测定 免疫球蛋白IgG水平，因为活动性结核病的变化与IgG水平的变化有一定相关性。(4)各种检测方法的优缺点

实用新型内容本实用新型所要解决的技术问题是提供一种结核分枝杆菌抗体快速测定试剂 盒，该试剂盒仅需一步操作，省去了血液样本要经过离心步骤才能得到血清样本的步 骤，大大提高了筛查的速度。本实用新型解决上述问题所采用的技术方案是一种结核分枝杆菌抗体快速测 定试剂盒，包括底板、硝酸纤维素膜、胶体金结合垫、样品垫和吸水垫，所述吸水垫、 硝酸纤维素膜、胶体金结合垫和样品垫水平方向顺序相接并固定在底板上。[0015]上述水平方向顺序相接方式有两种，一种是水平方向首尾连接，一种是水平方 向的部分重叠连接。本实用新型的一个优选方式是如上所述的结核分枝杆菌抗体快速测定试剂盒还 包括盒体，底板置于盒体内，所述盒体盒面上对应于硝酸纤维素膜的位置设有观察窗， 对应于样品垫的位置设有加样孔。这里的底板还包括固定于底板的硝酸纤维素膜、胶体 金结合垫、样品垫和吸水垫等部件共同位于盒体内。所述观察窗为方形孔或透明片。本实用新型的另一个优选方式是如上所述的结核分枝杆菌抗体快速测定试剂 盒，吸水垫上方设有产品标签层，胶体金结合垫上方设有箭头标签层。在吸水垫上方设 有与之直接接触的产品标签层，胶体金结合垫上方设有与之直接接触的箭头标签层。所述硝酸纤维素膜上设置有由结核分枝杆菌特异性抗原构成的检测线和由结核 分枝杆菌二抗构成的质控线，所述检测线位于样品垫与质控线之间。本实用新型工作原理是将结核分枝杆菌特异性抗原以条带状固定于硝酸纤维 素膜上作为检测线，将标记有捕获抗体的胶体金粒子吸附在胶体金结合垫上，当待测样 品(血液)加到样品垫上后，红细胞在样品垫上发生凝集并固定在样品垫上，血浆样本通 过毛细作用向前移动，与胶体金结合垫上的胶体金标记试剂相溶并相互反应，继续向前 移动经过硝酸纤维素膜上含有相对应的检测抗原的区域时，如果血液样品含有结核分枝 杆菌抗体，胶体金标记试剂复合物与抗原发生特异性结合而被截留，聚集在检测线上显 色呈阳性；如果样品不含有结核分枝杆菌抗体，胶体金蛋白复合物与抗原不发生特异性 结合，检测线上不显色呈阴性。对于上述结核分枝杆菌抗体快速测定试剂盒的制备方法，本实用新型解决所述 技术问题采用的技术方案是包括如下步骤1)样品垫的制备将浓度为0.5mg/ml-lmg/ml的植物凝集素或抗人红细胞抗体缓冲溶液处理包被 载体，低温冻干，裁切成长条备用；2)胶体金结合垫的制备A.胶体金溶液的制备以纯化水、氯金酸溶液和柠檬酸钠溶液为原料， 其中氯金酸溶液与柠檬酸钠溶液的体积相等，先将纯化水加热搅拌，再加入 氯金酸溶液使氯金酸的终浓度为万分之一，待溶液微沸时，快速加入柠檬酸钠溶液， 继续加热并搅拌，5-10分钟后停止加热，溶液冷却至室温，得到平均直径在40nm-50nm 的胶体金溶液，4°C保存备用； B.胶体金pH的调节上述步骤得到的胶体金溶液调节pH在6-9 ；C.胶体金标记上述步骤得到的胶体金溶液中加入待标记蛋白，搅拌10-30分 钟后，得到的每IOOml溶液中加入IOml 10%的牛血清白蛋白，混勻后8000-12000rpm离 心30分钟，弃上清，沉淀经处理得到胶体金蛋白复合物；D.胶体金结合垫的制备上述步骤得到的胶体金蛋白复合物均勻的铺在结合垫 上，低温冻干，裁切成长条备用；3)结核分枝杆菌Iam抗原的制备[0031]结核分枝杆菌lam抗原采用体外固相培养结核分枝杆菌标准菌株H37RV，灭活 后超声破碎，离心去除沉淀后，上清经分子筛纯化所得可溶性抗原。4)硝酸纤维素膜设置检测线(12)和质控线(13)用包被机将吸入到检测线注射 泵中的lmg/ml结核分枝杆菌Iam抗原和吸入到质控线注射泵中lmg/ml的二抗包被到硝 酸纤维素膜上分别形成检测线(12)和质控线(13)，于37°C干燥过夜后备用。所述沉淀是这样处理得到胶体金蛋白复合物的沉淀按照IOOml IOml的比 例，每IOOml胶体金用IOml含有牛血清白蛋白、0.1%聚乙二醇、pH = 8.2的PBS溶 液悬浮。所述样品垫采用玻璃纤维膜或无纺布作为包被载体，胶体金结合垫采用玻璃纤 维膜、无纺布或聚酯膜作为包被载体。所述硝酸纤维素膜采用尼龙膜、羧化纤维素膜或纯纤维素膜替代。本实用新型结核分枝杆菌抗体快速测定试剂盒的检测方法按照以下步骤操作 将待测样本直接加入到试剂盒的加样孔中，再使用滴管滴加2-3滴稀释液于加样孔中， 15分钟内观察窗内检测线显色即为阳性，检测线不显色为阴性。综上所述，本实用新型的有益效果是(1)本实用新型将吸水垫、硝酸纤维素膜、胶体金结合垫和样品垫顺序铺在底板 上，体积小，制作方便；再置于盒体内，体积小、便于携带；(2)盒体上设有供样品进入的加样孔和供观测结果的观察窗，根据是否显色判断 检测结果，准确可靠，没有人为操作误差；(3)能大大缩短结核分枝杆菌抗体检测时间，具有快速、简单、现场、不需要昂 贵仪器、不需要对人员进行专业培训等优点；(4)本实用新型将胶体金粒子标记在捕获抗体上，没有有害物质及放射性物质的 参与，安全可靠，适用于结核分枝杆菌的诊断；(5)适用于检测人体血液样本中是否存在结核分枝杆菌抗体；(6)可批量生产，可单人单份、也可多人单份，适用于临床快速诊断和现场大数 量的快速检测；易于保存，有利于基层单位推广。

图1是实施例1的结构示意图；图2是实施例2的结构示意图；图3是实施例3的结构示意图；图4是实施例4的结构示意图。图中标记相对应的部件名称1-底板；2-硝酸纤维素膜；3-胶体金结合垫； 4-样品垫；5-吸水垫；6-产品标签层；7-箭头标签层；8-观察窗；9-加样孔；10-盒 体。
具体实施方式下面结合实施例及附图，对本实用新型作进一步的详细说明，但本实用新型的 实施方式不限于此。[0050]实施例1如图1所示，结核分枝杆菌抗体快速测定试剂盒，包括底板1，还包括硝酸纤维 素膜2、胶体金结合垫3、样品垫4和吸水垫5，所述吸水垫5、硝酸纤维素膜2、胶体金 结合垫3和样品垫4水平方向顺序相接并固定在底板1上，具体的，其连接方式是水平方 向首尾连接的。吸水垫5上方设有产品标签层6，胶体金结合垫3上方设有箭头标签层 7。实施例2 如图2所示，结核分枝杆菌抗体快速测定试剂盒，包括底板1、硝酸纤维素膜 2、胶体金结合垫3、样品垫4和吸水垫5，吸水垫5、硝酸纤维素膜2、胶体金结合垫3 和样品垫4水平方向顺序相接并固定在底板1上，具体的，其连接方式是水平方向首尾连 接的。还包括盒体10，底板1置于盒体10内，所述盒体10盒面上对应于硝酸纤维素膜 2的位置设有观察窗8，对应于样品垫4的位置设有加样孔9。实施例3如图3所示，所述吸水垫5、硝酸纤维素膜2、胶体金结合垫3和样品垫4水平 方向顺序相接并固定在底板1上，具体的，其连接方式是部分重叠连接的。其余与实施 例1相同。实施例4如图4所示，所述吸水垫5、硝酸纤维素膜2、胶体金结合垫3和样品垫4水平 方向顺序相接并固定在底板1上，具体的，其连接方式是部分重叠连接的。其余与实施 例2相同。实施例5结核分枝杆菌抗体快速测定试剂盒的制备方法如下(1)样品垫的制备以含有浓度为0.5mg/ml-lmg/ml的抗人红细胞抗体或植物凝集素缓冲溶液均勻 处理玻璃纤维膜或纺布包被载体，包被方式可以采取用移液器将包被溶液均勻的铺到样 品垫中，也可以采取将样品垫置于包被溶液中浸泡均勻。处理好的包被材料采用冷冻干 燥、真空干燥或加热干燥的方式处理，再按照规格裁切成适当大小的长条后备用。(2)制备胶体金溶液采用柠檬酸三钠还原法制备纳米胶体金溶液。洁净的圆底烧瓶中加入IL纯化 水，加热并搅拌，取的氯金酸溶液IOml于圆底烧瓶中，待溶液沸腾时，快速加入 的柠檬酸三钠溶液10ml，继续搅拌溶液并反应5-10分钟，溶液中的氯金酸逐渐被还原成 金颗粒，溶液由无色到黑色，最后变成酒红色。停止加热将溶液冷却至室温后2-8°C保存 备用。(3)胶体金标记最佳pH和最佳标记蛋白量在胶体金标记蛋白质之前，先要做好最佳标记PH和标记蛋白量的确定，达到用 最小的蛋白用量与胶体金达到最佳的结合比例，既可以节省蛋白的用量，又可以降低标 记后产生过多的游离标记蛋白，简化通过离心去除游离蛋白的纯化工作量。本试验方法 采用目测法，取一系列离心管，每管中各加入Iml胶体金溶液，具体按照下表操作表1胶体金-SPA最佳标记pH的确定[0067]
权利要求1.一种结核分枝杆菌抗体快速测定试剂盒，包括底板(1)，其特征在于，还包括硝酸 纤维素膜(2)、胶体金结合垫(3)、样品垫(4)和吸水垫(5)，所述吸水垫(5)、硝酸纤维 素膜(2)、胶体金结合垫(3)和样品垫(4)水平方向顺序相接并固定在底板(1)上。
2.根据权利要求1所述的一种结核分枝杆菌抗体快速测定试剂盒，其特征在于，还包 括盒体(10)，底板(1)置于盒体(10)内，所述盒体(10)盒面上对应于硝酸纤维素膜(2) 的位置设有观察窗(8)，对应于样品垫(4)的位置设有加样孔(9)。
3.根据权利要求2所述的一种结核分枝杆菌抗体快速测定试剂盒，其特征在于，所述 观察窗(8)为方形孔或透明片。
4.根据权利要求1所述的一种结核分枝杆菌抗体快速测定试剂盒，其特征在于，所述 吸水垫(5)上方设有与之直接接触的产品标签层(6)，胶体金结合垫(3)上方设有与之直 接接触的箭头标签层(7)。
5.根据权利要求1所述的一种结核分枝杆菌抗体快速测定试剂盒，其特征在于，所述 硝酸纤维素膜(2)上设置有由结核分枝杆菌特异性抗原构成的检测线和由结核分枝杆菌 二抗构成的质控线，所述检测线位于样品垫(4)与质控线之间。
专利摘要本实用新型公开了一种结核分枝杆菌抗体快速测定试剂盒。该试剂盒包括底板(1)、硝酸纤维素膜(2)、胶体金结合垫(3)、样品垫(4)和吸水垫(5)，所述吸水垫(5)、硝酸纤维素膜(2)、胶体金结合垫(3)和样品垫(4)水平方向顺序相接并固定在底板(1)上。本实用新型的试剂盒将吸水垫、硝酸纤维素膜、胶体金结合垫和样品垫顺序铺在底板上，体积小，制作方便；再置于盒体内，体积小、便于携带；盒体上设有供样品进入的加样孔和供观测结果的观察窗，根据是否显色判断检测结果，准确可靠，没有人为操作误差；能大大缩短结核分枝杆菌抗体检测时间，具有快速、简单、现场、不需要昂贵仪器、不需要对人员进行专业培训等优点。
文档编号G01N33/543GK201796035SQ201020244230
公开日2011年4月13日 申请日期2010年7月1日 优先权日2010年7月1日
发明者刁维钧, 刘东泽, 刘廷勇, 杨卫平, 王俊, 王保宁 申请人:四川迈克生物科技股份有限公司