专利名称：一个基于纳米技术的psa高敏感检测方法
技术领域：
本发明涉及一种免疫酶联吸附技术的检测方法，具体的说，涉及一种大幅度提高免疫酶联吸附技术检测方法灵敏度的金纳米颗粒双标探针-PCR(Polymerase Chain Reaction，聚合酶链式反应)扩增检测方法。
背景技术：
免疫反应是免疫体系中各成员(抗原、免疫分子、免疫细胞、免疫组织)之间相互依赖，相互影响和相互作用的一种免疫学现象。基于抗原和抗体特异性反应建立起来的免疫分析方法是一种利用抗原、抗体之间高特异性的相互作用(即免疫反应)实现对血样或尿样中的抗原、抗体、激素、受体和小分子药物进行鉴定的一种分析方法。因此，免疫分析比一般化学分析的特异性和灵敏度要高，被广泛的应用于生命科学，分析科学及医学等领域。
酶免疫分析是将酶反应的高效性与免疫反应的特异性有机结合的标记免疫学技术。1966年，Engvall和Perlmarm建立了酶免疫测定法，主要是利用免疫复合体上的酶活性将特定的底物催化，使该物质的特征吸收峰发生变化，用分光光度计进行测定，从而测得待测物的量。具有灵敏度较高，操作较简便的优点，是目前使用广泛的免疫分析方法。
酶免疫分析法包括酶联免疫吸附分析法、酶免疫试验法、竞争结合酶免疫分析法等，其中ELISA(酶联免疫吸附法)是酶免疫法中应用最为广泛的一种。
ELISA的工作原理基于抗原或抗体的固定以及抗原或抗体的酶标记。利用蛋白与固相载体表面活性基团之间相互作用，将抗原或抗体吸附于固相载体表面，结合在固相载体表面的抗原或抗体仍保持其免疫学活性；同时，抗原或抗体可通过共价键与酶连接形成酶结合物，此种酶标记的抗原或抗体既保留其免疫学活性，又保留酶的活性。在测定时，待测样品与固相载体表面的抗原或抗体发生反应，经过洗涤后，加入酶标记的抗原或抗体，通过免疫反应而结合在复合物上，使酶的量与待测样品的量呈一定的比例，即酶的多少反映待测样品的多少。再加入酶的反应底物后，底物被酶催化成为特征吸收峰与底物不同的产物，通过使用分光光度法，即可对产物进行定量检测。
但是，传统的ELISA检测，其结果非常容易受到一些因素的影响。比如显色时间和温度的控制会影响实验结果；缓冲液的选择也非常重要，因为有的缓冲液体系能够减少底色；目前的ELISA检测灵敏度在ng级，难以满足对于一些微量重要物质的检测要求。
纳米技术目前被广泛应用于化学，物理和生命科学等各个领域，推动生物分析的快速发展，其高灵敏度对疾病的早期诊断，治疗效果追踪，血液和食品的微量检测筛选以及跟踪疾病的复发情况等都是必不可少的。
其中，金纳米颗粒是金盐被还原成原子金后形成的金颗粒悬液，由于静电作用成为一种稳定的胶体状态，因此也称胶体金。金颗粒大小多在Ι-lOOnm，所以又被称为纳米金。 金纳米颗粒溶液的颜色随其直径大小和所处的化学环境的不同而呈现红色至紫色不同的颜色。一般来说，直径越大，颜色越深，所有的金纳米颗粒在510-550nm的可见光范围内都有特征吸收峰。金纳米颗粒2-5nm呈桔黄色，10-20nm呈酒红色，30-64nm呈深红色。小分子的金纳米颗粒基本上呈圆球形，30-80nm为偏心圆形。
由于金纳米颗粒的高电子密度、纳米级尺度、较高的吸光度，以及其良好的生物相容性优点，使其成为免疫学实验中重要的标记物，目前，已经是现代免疫学四大免疫标记技术之一。
将核酸连接在金纳米颗粒上，使其检测延伸到了核酸领域，通过核酸上的巯基修饰与金形成共价连接，再通过盐离子减弱核酸分子间的静电排斥作用，在金纳米颗粒表面得到高密度核酸分子，从而实现信号放大。
PCR技术是80年代中期发展起来的体外核酸扩增技术。它具有特异、敏感、产率高、快速、简便、重复性好、易自动化等突出优点；能在一个试管内将所要研究的目的基因或某一核酸片段于数小时内扩增至十万乃至百万倍。发明内容
本发明要解决的技术问题是针对目前传统的ELISA检测方法的灵敏度需要进一步提高的问题，提供一种大幅度提高ELISA检测灵敏度的技术。
本发明的技术解决方案是将纳米技术与ELISA相结合，该技术包括两种探针一种是磁珠探针，连接有能够与PSA (Prostatespecific antigen)特异性识别的PSA抗体，通过共价键连接到磁珠表面。第二种是金纳米颗粒双标探针，连接有PSA特异性抗体和寡核苷酸序列。这两种探针可与PSA形成三明治结构。金纳米颗粒上携带的数以百计的寡核苷酸链，作为PSA的生物编码。待形成三明治结构后，利用磁场对三明治结构进行分离和收集。释放核酸，并对被释放的核酸进行PCR扩增，通过PCR扩增以及核酸测序对PSA进行定性定量检测。本方法可以检测到60ag/ml的底物，相对于临床上的同类检测，检测灵敏度高了六个数量级。
具体地说，免疫酶联吸附的双标金纳米颗粒探针-PCR扩增检测法，其特点包括如下步骤
1.金纳米颗粒双标探针的制备制备13nm的胶体金溶液；将抗体修饰到金纳米颗粒上；设计作为生物条码的核酸序列；将其连接到已经修饰有抗体的金纳米颗粒上。
2.在液相中利用双抗夹心法捕捉待测蛋白质将抗体与磁珠进行交联，制备磁珠探针；向磁珠探针中加入含有PSA的待测抗原液；将金纳米颗粒双标探针加入磁珠探针中进行孵育，形成三明治结构。
3. DTT对金纳米颗粒双标探针上的核酸进行释放利用磁力架对磁珠探针-PSA-金纳米颗粒双标探针形成的三明治结构进行分离；加入DTT溶液对金纳米颗粒上的核酸进行释放。
4.核酸扩增核酸扩增方法采用PCR。
5.信号处理核酸扩增信号可以用普通的琼脂糖凝胶电泳的方法进行检测，并用图像分析软件获取信号的灰度值，进行定量分析。
本方法具有如下的优点和效果
1.本方法可以对血清中的蛋白进行高灵敏度的可视化检测，与原始的ELISA检测相比，检测灵敏度提高了六个数量级。
2.本方法的样品标记即金纳米颗粒双标探针的方法，具有操作简便、试剂有效期长、成本低廉、反应灵敏等优点。
3.本方法的信号显示方法是扩增后的核酸，结果易于保存、对比、以及标准化；同时，与酶联免疫方法相比，该方法具有环境条件要求低的优点。
4.本方法对扩增核酸信号进行灰度值扫描，具有制备方法简单、性能稳定、分析结果数字化，易于分析的优点。


图1为放大30万倍的13nm金颗粒电镜图。
图2为各种经修饰的金纳米颗粒探针的紫外可见吸收峰峰值图，紫外吸收峰分别 DNA-AuNP 522nm、AuNP 519nm、Protein-AuNP 538nm、Protein-AuNP-DNA 526nm。
图3为磁珠交联前和交联后的蛋白溶液紫外可见吸收峰变化图。
图4为不同浓度梯度PSA的三明治检测实验释放核酸PCR扩增结果示意图。其中 1为BSA封闭阴性对照；2为BSA和tRNA共同封闭阴性对照；3_8为实验组，其中PSA的浓度分别是 3 为 62. 5ag/ml，4 为 1. 25fg/ml，5 为 25fg/ml，6 为 0. 5pg/ml，7 为 10pg/ml，8 为 200pg/ml ；9为阳性对照，10无模板对照，11无引物对照。
图5为三次PCR扩增结果灰度扫描均值线性回归图。
具体实施方式
实施实例1
用免疫酶联吸附的金纳米颗粒双标探针-PCR扩增检测法检测PSA抗原的过程
1.自制13nm的胶体金溶液。
2.磁珠探针的制备取2X108个磁珠，按说明书上提到的缓冲液进行操作，经PBS 洗涤后，向其中加入6 μ g PSA的多克隆抗体，在37°C下孵育4小时，并且保证充分混勻。最后经过封闭液封闭。磁珠探针保存于4°C备用。
3.磁珠探针捕获PSA抗原将不同浓度的PSA溶液加入到磁珠探针中，PSA浓度分别为 62. 5ag/ml、l. 25fg/ml、25fg/ml、0. 5pg/ml、10pg/ml、200pg/ml，4°C，避光，孵育过夜。
4.胶体金探针的制备向胶体金中加入PSA抗体，室温孵育半小时后加入核酸，向溶液中加入10. 8 μ L 0. 5Μ的磷酸缓冲液和一定量2Μ NaCl溶液使其Na浓度递增，当Na+ 浓度升至0. IMjh后停止反应，加入BSA封闭。制得的胶体金双标探针保存于4°C备用。
5.三明治结果形成将胶体金双标探针加入磁珠中4°C，避光，孵育过夜。
6.核酸释放加入0. 5M DTT释放液，室温孵育过夜，回收上清液。
7.核酸扩增用回收的上清液直接进行核酸扩增，其引物采用自己设计合成的按设计条件进行PCR扩增-MV，5分钟；940C，30秒；44°C，30秒；72°C，15秒；72 °C，5分钟； 20循环。循环完成后，即对扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳。用紫外成像仪照胶记录，通过条带比较进行初步定性和定量分析。
8.信号处理采用图像分析软件Image J对获取条带进行灰度值扫描及定量分析，计算出三次灰度值平均值见表1。灰度值与对应的PSA浓度值进行线性分析，线性系数 r = 0. 9818。
权利要求
1.一种基于纳米技术的微量蛋白质检测方法，其特征在于将磁珠探针技术、金纳米颗粒双标探针技术、免疫酶联吸附技术和核酸扩增技术四者结合起来。
2.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于方法为免疫酶联的金纳米颗粒双标探针PCR检测法。
3.根据权利要求2所述的检测方法，其特征在于包括以下步骤(1)在液相中利用双抗夹心法捕捉待测蛋白质；(2)金纳米颗粒双标探针的制备；(3)DTT对金纳米颗粒双标探针上的核酸进行释放；(4)核酸扩增；(5)信号处理。
4.根据权利要求3所述的检测方法，其特征在于步骤(1)在液相中利用双抗夹心法捕捉待测蛋白质为磁珠探针在液相中利用免疫酶联吸附方法捕捉PSA等蛋白质并与带有抗体和核酸修饰的金纳米颗粒双标探针作用，形成夹心结构。
5.根据权利要求3所述的检测方法，其特征在于步骤( 金纳米颗粒双标探针的制备为将PSA特异性抗体和具有特定序列的核酸同时修饰在金纳米颗粒表面。
6.根据权利要求3所述的检测方法，其特征在于步骤(3)DTT对金纳米颗粒双标探针上的核酸进行释放为将DTT溶于一定pH的PB溶液中，使其终浓度达到0. 5M，对金纳米颗粒双标探针上的核酸进行释放。
7.根据权利要求书3所述的检测方法，其特征在于步骤(4)核酸扩增为对洗脱下来的核酸进行PCR扩增，使其实现信号放大。
8.根据权利要求书3所述的检测方法，其特征在于步骤(5)信号处理为采用图像分析软件获取信号的灰度值，进行定量分析。
全文摘要
一个基于纳米技术的PSA高敏感检测方法，是将磁珠探针技术、金纳米颗粒双标探针技术、免疫酶联吸附技术和核酸扩增技术四者结合起来的一种新型生物高灵敏度检测方法。该方法将针对待测蛋白质(如PSA)的一种抗体与磁珠交联，捕捉样品中的待测蛋白质后，加入用另一种抗体和核酸标记的金纳米颗粒双标探针。进行磁性分离纯化后，对核酸进行释放扩增，由琼脂糖凝胶电泳得到可视化结果，进行灰度值扫描。与传统的ELISA相比，其检测灵敏度高了六个数量级，对于癌症的早期诊断以及微量重要物质，包括核酸和蛋白质的检测，均具有重要意义。
文档编号G01N33/68GK102520189SQ20111042085
公开日2012年6月27日 申请日期2011年12月16日 优先权日2011年12月16日
发明者孙莉, 张玉祥 申请人:首都医科大学