专利名称：一种蜂蜜中氯霉素残留量的液相色谱－串联质谱测定方法
技术领域：
本发明涉及一种对食品中氯霉素残留量的测定方法，更具体是对蜂蜜中残留的微量氯霉素进行定量测定的方法。
背景技术：
氯霉素是一种广谱抗生素，因具有广谱性、效果好以及相对廉价等特点，曾作为农产品生产中杀菌消毒的辅助手段及用于治疗家畜禽疾病。但近年来发现氯霉素有严重的副作用，它能抑制人体骨髓造血功能而引起再生障碍性贫血症和粒状白细胞缺乏症，更会导致神经毒性和胚胎致畸；故动物性食品中的氯霉素残留对人类的健康构成了潜在的危害。
由于氯霉素对人体的影响无法控制，所以不可能制定安全标准。美国和欧盟规定在动物性的食品中不得检出氯霉素，任何制造、出售或进口含有氯霉素的食品或动物饲料均为非法。
随着我国加入WTO，国际贸易中的技术壁垒问题突现，并具有要求指标越来越严格、范围不断增大、往往会引起连锁反应的特点。欧盟曾以中国蜂蜜中氯霉素等抗生素超标为由，中止进口中国的蜂蜜。受欧盟影响，日本、加拿大、美国也由此加强了对中国蜂蜜的检验。按照目前的国际标准，蜂蜜产品中氯霉素含量不得超过0.1ppb。
蜂蜜中残留氯霉素的检测分别可采用微生物法、免疫法、GC、HPLC、GC-MS等分析方法，但方法检测的灵敏度大多难以满足目前的要求。近年来相继有报道可采用液相色谱-串联质谱法(LC-MS/MS)可对蜂蜜中残留氯霉素进行高灵敏度的定量分析。
而在现行的蜂蜜中残留氯霉素的LC-MS/MS检测中，或采用外标法定量，或用未经提取的氯霉素标样作为定量的标准，影响了测定结果的可靠性。同时，因其样品预处理采用多次液-液萃取、固相萃取或液-液萃取与固相萃取相结合的方法，其操作烦琐费时并易引入污染，而氯霉素的色谱分离又需要一定的时间，故难以满足实际工作尤其是批量分析的需要。

发明内容
本发明的目的是建立一种可快速、同时有效地对蜂蜜中残留氯霉素进行定量测定的切实可行的并具有通用性的方法，可较好地满足实际工作的需要。
本发明是这样实现的本发明建立的LC-MS/MS方法以氘化氯霉素为内标，以内标法对蜂蜜中残留的氯霉素进行定量。与外标法相比，利用理化性质与氯霉素十分相似的氘化氯霉素为内标，可对包括样品预处理、色谱分离和质谱检测在内的样品分析全过程中所可能产生的各种误差进行校正。
本发明的定量工作曲线，系在空白蜂蜜中添加氯霉素标样后提取获得，可避免因提取回收率不同而产生的影响。在样品预处理中，采用简便的液-液萃取法对蜂蜜中残留的氯霉素进行净化和富集，在样品的色谱分离中，采用细口径的色谱短柱和等度或梯度洗脱法实现氯霉素的快速色谱分离。
1.样品处理方法液-液萃取法取适量蜂蜜样品，于相当于蜂蜜样品体积10-200％(V/V)的水溶液或盐水溶液(乙酸胺、乙酸钠、氯化铵、氯化钠或硫酸钠等水溶性盐类，其浓度为重量百分比5％-饱和)混合；取适量混合液，添加内标溶液和相当于待提取溶液体积1-10倍量的有机溶剂(乙酸乙酯、甲酸乙酯、乙酸甲酯、丙酮、乙腈、特丁基甲醚或乙醚)后旋涡混合提取，离心分离有机相后氮气挥干，用少量与色谱流动相的组成相类似的溶液溶解残渣后供LC-MS/MS进样测定。
2.LC-MS/MS测定条件液相条件流动相由乙腈(或甲醇)和含甲酸或乙酸(0.01～0.5％；V/V)水溶液或醋酸铵(1～100mmol)的水溶液(用氨水调节pH＝6-9)组成，采用等度或梯度洗脱；乙腈∶1～100mmol醋酸铵水溶液用氨水调节PH6-9，以体积比计为80-20％∶20-80％，或乙腈∶含水甲酸的水溶液为以体积比计80-20％∶20-80％。色谱柱为硅胶键合相填料柱(C18、C8、氰基)的细径短柱(内径为1.0-3.0mm；长度为30-100mm)。
质谱条件采用电喷雾离子源，负离子多反应监测扫描。离子选择通道(Q1/Q3m/z)分别为氯霉素321/151或(和)321/176或(和)321/257；氘化氯霉素(内标)326/156或(和)326/179或(和)326/262。
3.标准工作曲线的制备和样品中氯霉素的定量取空白蜂蜜样品，定量添加不同浓度的氯霉素标准品后按上述样品处理方法提取后供LC-MS/MS进样测定；以标准工作曲线样品峰面积与内标峰面积比为纵坐标，工作样品浓度(ng/g)为横坐标，按线形回归计算后所得。
标准曲线的回归方程为y＝b x+a…………………………………………(式1)样品中氯霉素浓度由标准曲线计算所得由式1推得c＝(m-a)/b…………………………………………………(式2)(式中c-试样中被测组分残留量，单位为纳克每克(ng/g)；m-试样中样品峰面积与内标峰面积比。)注计算结果应扣除空白值。
本发明样品处理方法操作简便，色谱分离快速，定量可靠。蜂蜜中的其他成分对氯霉素的定量无干扰；蜂蜜中氯霉素定性检测限优于0.1ppb(信噪比≥3)；定量限优于0.1ppb(信噪比≥10)；线性范围为0.1-25.6ppb，相关系数r在0.999以上；日内及日间精密度≤15％；不同来源的蜂蜜中氯霉素的提取回收率大于75％。样品检测专一性强、灵敏度高。各项方法学指标均能可靠地满足检测蜂蜜中残留氯霉素的实际需要。
本发明蜂蜜中残留氯霉素的液相色谱-串联质谱(LC-MS/MS)测定方法。其特点为以氘化氯霉素为内标，采用内标法定量；其定量工作曲线系在空白蜂蜜中添加氯霉素标样后提取获得；样品处理方法简便，蜂蜜样品经简便的一次液-液萃取就可使其中的微量氯霉素得到净化和富集；色谱分离采用细口径的色谱短柱和乙腈或甲醇及含氨水和醋酸铵或甲酸、乙酸的水为流动相进行等度或梯度洗脱。采用本法可简便、可靠地对蜂蜜中残留的氯霉素进行定量检测，各项方法学指标均可满足实际检测的需要。


图1是氯霉素标准物质碎片离子扫描图。
图2是氘化氯霉素碎片离子扫描图。
图3是氯霉素标准物质和氘化氯霉素的选择离子扫描图(碱性流动相，等度洗脱)。
图4是氯霉素标准物质和氘化氯霉素的选择离子扫描图(酸性流动相，梯度洗脱)。
具体实施例方式
<实施例>
1a.样品处理方法(液-液萃取)称取5g试样，精确到0.001g，准确加入5ml水后混合。精确量取上述混合液1.0ml置于10mL具塞离心管中，准确加入50μL内标工作溶液(氘化氯霉素，D5)和3mL乙酸乙酯，在旋涡混合器旋涡混合5min，以3000r/min离心5min，吸取上层乙酸乙酯转入另一5mL具塞离心管中，用氮气吹干仪在55℃挥干，加入200μL流动相溶解，以10000r/min离心5min，取上清液供液相色谱-串联质谱仪进样测定。
1b.样品处理方法(盐析/液-液萃取)称取5g试样，精确到0.001g，准确加入5ml醋酸钠饱和水溶液后混合。精确量取上述混合液1.0ml置于10mL具塞离心管中，准确加入50μL内标工作溶液(氘化氯霉素，D5)工作溶液和3mL乙酸乙酯，在旋涡混合器旋涡混合5min，以3000r/min离心5min，吸取上层乙酸乙酯转入另一5mL具塞离心管中，用氮气吹干仪在55℃挥干，加入200μL流动相溶解，以10000r/min离心5min，取上清液供液相色谱一串联质谱仪进样测定。
2a.液相色谱条件(等度洗脱)a)色谱柱CAPCELL PAK C18.MG.5μm，100mm×2.0mm(i.d)；b)流动相乙腈∶10mmol醋酸铵水溶液(用氨水调节pH＝8)＝25份∶75份；c)流速0.3ml/min；d)柱温室温；e)进样量10μL。
2b.液相色谱条件(梯度洗脱)a)色谱柱CAPCELL PAK C18.MG.5μm，50mm×2.0mm(i.d)；b)流动相A乙腈，B0.02％甲酸水溶液。
梯度方式0-1.5min，80-20％B；1.5-1.6min，20％B-80％B；1.6-5.0min，80％B；5.0min，stop。
c)流速0.3ml/min；d)柱温室温；e)进样量10μL。
3.质谱条件a)离子源电喷雾离子源；b)扫描方式负离子扫描；c)检测方式多反应监测(MRM)；d)雾化气压力(NEB)10；e)气帘气压力(CUR)8；f)辅助气流速(CAD)12L/min；g)电喷雾电压(IS)-1500V；h)离子源温度(TEM)450℃；i)定性离子对、定量离子对和测定参数

*DP去簇电压；FP聚焦电压；EP进口电压；CE碰撞能量；CXP碰撞池进口能量按内标法以峰面积或峰高法计算出蜂蜜中氯霉素的含量浓度。
在上述条件下，蜂蜜中氯霉素的检测限为0.1ng/g(信噪比≥3)。氯霉素的色谱参考保留时间为5min(2a条件)和2.6min(2b条件)，色谱图参见说明书附图。
权利要求
1.一种蜂蜜中氯霉素含量测定方法，包括a、蜂蜜样品添加氘化氯霉素内标溶液和10-200％(V/V)的水溶液或盐水溶液后采用液-液萃取进行预处理；b、取预处理后的样品进行LC-MS/MS测定；采用硅胶键合相填料C18、C8、氰基的细径色谱柱内径为1.0-3.0mm；长度为30-100mm和由乙腈或甲醇和含氨水和醋酸铵pH＝6-9或甲酸或乙酸0.01～0.5％V/V水溶液组成的流动相，进行等度或梯度洗脱；c、质谱检测采用电喷雾离子源，负离子多反应监测扫描。离子选择通道为Q1/Q3 m/z分别为氯霉素321/151或/和321/176或/和321/257；内标氘化氯霉素326/156或/和326/179或/和326/262。
2.根据权利要求1所述的蜂蜜中氯霉素含量测定方法，其特征在于预处理样品时在蜂蜜样品中添加的盐水溶液中的盐为乙酸胺、乙酸钠、氯化铵、氯化钠或硫酸钠的水溶性盐类，其浓度为重量百分比5％-饱和。
3.根据权利要求1所述的蜂蜜中氯霉素含量测定方法，其特征在于液-液萃取提取氯霉素的溶剂包括乙酸乙酯、甲酸乙酯、乙酸甲酯、丙酮、乙腈、特丁基甲醚或乙醚。
4.根据权利要求1所述的蜂蜜中氯霉素含量测定方法，其特征在于色谱柱长度为30-100mm，内径为1.0-3.0mm，填料为C18、C8或氰基硅胶键合相。
5.根据权利要求1所述的蜂蜜中氯霉素含量测定方法，其特征在于采用LC-MS/MS以氘化氯霉素为内标，采用C18、C8或氰基填料的色谱柱，流动相为含乙腈或甲醇和含氨水和醋酸铵(pH＝6-9)及甲酸或乙酸(0.01～0.5％)水溶液组成，进行等度或梯度洗脱。
6.根据权利要求1所述的蜂蜜中氯霉素含量测定方法，其特征在于在蜂蜜样品中添加氘化氯霉素为内标，以内标法进行定量。
7.根据权利要求1所述的蜂蜜中氯霉素含量测定方法，其特征在于采用流动相进行等度或梯度冼脱，乙腈∶1～100mmol醋酸铵水溶液(用氨水调节pH＝6-9)为80-20％∶20-80％V/V。
8.根据权利要求1所述的蜂蜜中氯霉素含量测定方法，其特征在于采用流动相进行等度或梯度冼脱乙腈∶含甲酸的水为80-20％∶20-80％V/V。
9.根据权利要求1所述的蜂蜜中氯霉素含量测定方法，其特征在于其定量工作曲线系在空白蜂蜜中添加0.1-25.6ppb的氯霉素标样后，按权利要求2和3的方法提取后获得。
全文摘要
本发明公开了一种蜂蜜中氯霉素含量测定方法，包括被测样品用一次液－液萃取的预处理，以氘化氯霉素为内标进行LC－MS/MS检测。
文档编号G01N30/72GK1763521SQ20041006740
公开日2006年4月26日 申请日期2004年10月22日 优先权日2004年10月22日
发明者余琛, 陈忠敏, 贾晶莹, 刘罡一, 龚洪岗, 马又娥, 张渊 申请人:上海市徐汇区中心医院