专利名称：地龙溶栓酶的制备及其鉴定方法
技术领域：
本发明涉及一种地龙溶栓酶的制备及其作用、作用机制和性质的鉴定方法。
蛋白酶是生物学、医学及相关学科中广泛应用的工具酶类和药品制剂，也是轻工业生产中常用的催化剂。目前虽有种类繁多的蛋白酶被发现，但经中国科学院情报所国际计算机联机检索表明，国内外尚未见有地龙溶栓酶的研究报导。此外，目前所发现的蛋白酶，由于其化学性质不稳定，原料来源不广泛，制备方法难度大等缺点，严重限制了其在工业上的广泛应用。另一方面，由于蛋白酶类药物可以引起人体强烈的免疫反应以及作用机制的局限性，目前由于药物治疗的酶类为数有限，而在用于溶栓治疗方面的不同作用机理的两类酶制剂中，应用较广的只有尿激酶(U.K)一种。它的作用机理是激活人体血液中的纤溶酶原，进而溶解纤维蛋白和纤维蛋白原，达到溶栓治疗的目的。但另一类，即直接溶解纤维蛋白的溶栓酶类药物，虽然有人体中分离出的纤溶酶及其衍生物、蛇毒溶栓酶等，但由于其缺点突出，致使应用非常有限。
本发明的目的是，建一系列可为大规模生产所用的制备地龙溶栓酶及鉴定其性质、作用机制的方便有效的方法。
本发明的要点在于，以新鲜蚯蚓为原料，经细胞碎裂、硫酸氨分段盐析、超滤膜超滤分级分离及DEAE纤维素、DEAE-Sephadex-A-25和Sephadex-G-50三种柱层析方法，可从蚯蚓体内得到聚丙烯酰胺电泳一条带的电泳纯地龙溶栓酶。采用酪蛋白或纤维蛋白为底物，酚试剂为显色剂，721型分光光度计为测定仪器，将不同酶量与相同浓度底物作用后的样品进行色谱分析，即可测定该酶活性。酶与底物的作用条件是PH7.4，37℃。该酶的分子量，可用SDS-聚丙烯酰胺电泳结合Sephadex-G50柱层析进行测定。测定结果，该酶的分子量为29，000道尔顿。该酶的热稳定性较好，于25-50℃保温三小时，酶活力基本保持不变，60℃时，活力保留65%，酶的最适温度为57℃。温度稳定性可比较各种温度下的酶活力进行鉴定。该酶的最适PH为8.0，在PH4.7-11.0范围内，酶作用稳定。PH值的影响，可比较不同PH值条件下的酶活力进行测定。其溶栓作用初步鉴定方法是，体外以动物或人血浆形成1mm2的凝块，用生理盐水洗涤数次(10次左右)，然后加入溶于PH7.4缓冲液中的各种浓度的酶溶液，观察其溶解情况。溶栓作用及作用机制的定量分析方法是，用50mg/ml药用纤维蛋白原溶液加入104/ml凝血酶制成1mm2厚纤维蛋白平板，然后将该酶溶液点于平板上，在12小时内观察溶解面积。用与该酶作用一定时间后的纯纤维蛋白原样品，进行聚丙烯酰胺电泳和SDS-聚丙烯酰胺电泳，观察其特异性及活性。溶栓作用的体内和半体内的鉴定方法是1、取正常人血浆，加凝血酶，用chandler′s(肯特勒斯)体外血栓形成仪制成人工血栓，在保温(37℃)条件下，观察溶栓情况;2、将方法1中的血栓注入兔的肺动脉中，用血管造影法，观察其作用。抗凝血的鉴定方法是，把该酶溶液在体外，或注入家兔体内，观察血液的凝血酶时间，白陶土部分凝血活酶时间、凝血活酶时间以及血液中的纤维蛋白(原)含量及其降解产物的含量。制备鉴定方法流程见流程表。
采用本发明，可以方便、经济、有效地从蚯蚓体内分离和鉴定出地龙溶栓酶。该酶具有低抗原性，高稳定性及高效性的优点。
地龙溶栓酶制备及鉴定方法流程表。
权利要求
1.一种地龙溶栓酶的制备及其作用、作用机制和性质的鉴定方法，其特征在于所说的地龙溶栓酶是从蚯蚓内体分离提取的一种成份。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征是以新鲜蚯蚓为原料，经细胞碎裂、硫酸铵分段盐析、超滤膜超滤分级分离及DEAE纤维素、DEAE-Sephadex-A-25和Sephadex-G-50三种柱层析方法，可从蚯蚓体内得到聚丙烯酰胺电泳纯地龙溶栓酶。
3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征是地龙溶栓酶的活性，是采用酪蛋白或纤维蛋白为底物，酚试剂为显色剂，721型分光光度计为测定仪器，把不同酶量与相同浓度底物作用后的样品进行光谱分析确定的。
4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征是该酶的分子量可用SDS-聚丙烯酰胺电泳结合Sephadex-G-50柱层析进行测定，结果证明，其分子量为29，000道尔顿，该酶的热稳定性可比较各种温度下的酶的活力进行鉴定，结果证明，在25-50℃保温三小时酶的活力基本不变，其最适温度为57℃，该酶PH的影响可比较不同PH值条件下的酶活力进行鉴定，结果表明，在PH4.7-11.0范围内，酶作用稳定，而其最适PH值为8.0。
5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征是该酶的作用与作用机制的鉴定方法是，体外以动或人血浆形成1mm3的凝块，用生理盐水洗涤数次(10次左右)然后加入溶于PH7.4缓冲液中的各种浓度的酶溶液，观察其溶解情况，其定量分析方法是，用50mg/ml药用纤维蛋白原溶液加10μ/ml凝血酶制成1mm2原纤维蛋白平板，然后将该酶溶液点于平板上，在12小时内观察溶解面积，再用与该酶作用一定时间后的纯纤维蛋白原样品，进行聚丙烯酰胺电泳和SDS聚丙烯胺电泳，观察其特异性。
全文摘要
地龙溶栓酶(ERTHWORM THROMBOLYTIC ENZYME)是一种从蚯蚓体内经硫酸铵盐析、超滤、DEAE-纤维素、DEAE-Sephadex-A25、Sephadex-G50柱层析纯化出的蛋白酶，经鉴定，该酶具有高效抗凝促纤溶作用及降解其它蛋白质的作用，该酶分子量小，化学性质稳定，鉴于以上性质，作用机制以及原料来源丰富经济等特点，该酶可在生物学、医学和工业生产中广泛应用。
文档编号G01N33/573GK1037345SQ88101579
公开日1989年11月22日 申请日期1988年4月4日 优先权日1988年4月4日
发明者牛勃, 程牛亮, 单鸿仁, 张祖询 申请人:牛勃