专利名称：小分子有机物的量子点标记抗体多组分非竞争均相免疫分析方法
技术领域：
本发明涉及小分子有机物(农药、药物、环境内分泌干扰物)的量子点标记抗体多组分非竞争均相免疫分析技术。
背景技术：
环境和农畜产品中农药、药物、环境内分泌干扰物的残留超标，对环境和环境生物构成一定威胁，影响食品安全和人类健康。加强环境和食品安全监测，需要高效快速的分析技术。目前已报道的农药、药物、环境内分泌干扰物多残留的检测方法主要有色谱法和色质联用法。采用这些方法需要昂贵的仪器设备、专业化的实验室和训练有素的专门人才， 样品前处理要求高、过程复杂、速度慢，检测成本高，特异性不强，难以适应大量样品和现场快速检测的要求。现有小分子有机物多组分免疫分析，通常采用在聚苯乙烯微孔板的不同部位固定不同抗体或抗原，通过空间分辨进行不同免疫反应，反应在固相和液相界面进行， 通过洗涤方式实现固液分离，操作复杂；或采用不同标记物，如酶、荧光素等标记不同抗体或抗原，反应条件和检测手段难以兼容。因此，真正意义上的小分子有机物多组分免疫分析技术尚待建立。

发明内容
本发明的目的是以不同荧光发射波长的高效水溶性量子点作为纳米荧光探针标记抗不同目标分析小分子有机物(农药、药物、环境内分泌干扰物)的抗体，建立一种特异性强、灵敏度高、简便高效、用于多种目标分析物快速检测的量子点标记抗体非竞争多组分均相免疫分析技术。本发明的技术方案是以激发波长宽、荧光发射波长窄且互不干扰、荧光量子效率高、稳定性好、表面具活性羧基的不同水溶性量子点作为纳米荧光探针，采用碳二亚胺法分别标记抗不同目标分析物(农药、药物、环境内分泌干扰物)抗体；将不同的量子点标记抗体用磷酸盐缓冲液稀释成适当浓度的混合溶液，加入含对应目标分析物的混合标样，在均相体系中同时发生多种免疫反应，同样条件下以待测样品和目标分析物空白代替标样，设置样品和空白对照反应体系，量子点标记抗体与对应目标分析物结合后发生荧光淬灭；将达到平衡的反应体系在同一激发波长下直接进行荧光扫描或多波长检测，分别计算空白对照体系中各量子点标记抗体的特征荧光强度Ftl与标样体系中各对应量子点标记抗体的特征荧光强度Fs之比值FcZFs ；在条件优化的基础上，依据FcZFs (特征荧光的淬灭程度)与对应目标分析物的浓度在一定范围内呈正比的规律以及待测样品体系的FcZFs,计算待测样品中各目标分析物的含量，建立高灵敏度快速检测多种目标分析小分子有机物(农药、药物、 环境内分泌干扰物)的量子点标记抗体多组分非竞争均相免疫分析方法。本发明综合利用免疫分析特异性强、量子点荧光性能优异、均相免疫反应速度快、多种免疫反应在均相体系中同时进行、平衡时间短、反应平衡后直接进行荧光检测等优势。 与常规免疫分析技术相比，本发明所建立的量子点标记抗体多组分非竞争均相免疫分析技术，可同时对多种目标分析小分子有机物(农药、药物、环境内分泌干扰物)物进行定性定量检测，省去了固液分离和显色反应步骤，不仅特异性强、灵敏度高、重现性好，而且更加简便高效，检测时间约为常规单组分ELISA的1/4，是对现有小分子有机物免疫分析技术的发展和创新，迄今尚未见同类报道，具有很高的开发应用价值。另，本发明所述高效水溶性量子点在200 350nm范围内用同一波长紫外光激发， 发射半峰宽小于30nm、互不干扰的特征荧光，不同量子点的最大荧光波长的间隔>50nm，荧光量子效率高于60%。


图1为量子点标记抗农药抗体多组分非竞争均相免疫分析荧光光谱图。图2为量子点标记抗药物抗体多组分非竞争均相免疫分析荧光光谱图。图3为不同浓度氯霉素与量子点标记抗氯霉素抗体荧光强度变化的关系曲线。
具体实施例方式一、量子点标记抗农药抗体多组分非竞争均相免疫分析技术实施例1
将荧光发射波长为545nm、625nm、705nm的高效水溶性量子点采用碳二亚胺法(Greg Τ. Hermanson, Bioconjugate Techniques, 2ed 2008, p495-496) ^ !!^^ !^ 氰菊酯抗体、抗克百威抗体共价偶联，分别制备荧光发射波长约为M5nm的量子点标记抗烯效唑抗体、荧光发射波长约为625nm的量子点标记抗氯氰菊酯抗体和荧光发射波长约为 705nm的量子点标记抗克百威抗体，经超滤纯化后用pH8. 3、含0. 5g/L叠氮化钠和lmol/ L甜菜碱的0. 05mol/L硼酸盐缓冲液溶解定容至1 μ moL/L，4°C保存备用，临用前分别将所述量子点标记抗烯效唑抗体、量子点标记抗氯氰菊酯抗体和量子点标记抗克百威抗体用 0. 02mol/L、ρΗ7· 0的PBS稀释100倍、200倍和50倍后等体积混合。先用甲醇配置含烯效唑、氯氰菊酯和克百威标样各lmg/mL的母液，再用0. 02mol/ L、pH7. 0 PBS稀释成分别含烯效唑、氯氰菊酯和克百威标样标样10 10_Vg/mL的混合标样系列，同样条件下以待测样品和目标分析物空白代替标样，设置样品和空白对照。分别在IOOPL标样、待测样品和空白对照溶液中加入等体积的所述量子点标记抗体混合液，在室温下混合反应约10 15min。反应平衡后在235nm激发波长下扫描(见图1 所示)或分别检测M5nm、625nm和705nm附近的最大特征荧光强度。优化反应介质、反应物浓度比、反应温度和时间、激发波长与荧光发射波长等相关条件，选择量子点标记抗体与对应目标分析物免疫反应速度快、敏感性强、稳定性好、量子点标记抗体用量少、空白对照体系荧光强度(Ftl)与含对应目标分析物体系的荧光强度(Fs) 比值高、背景干扰少的条件组合。在此基础上，依据FcZFs (量子点标记抗体荧光淬灭的程度)与对应目标分析物浓度在一定范围内成正比的规律以及各样品的FcZFs，计算样品中烯效唑、氯氰菊酯和克百威的含量，对待测样品中的烯效唑、氯氰菊酯和克百威进行定性定量快速检测，从而建立烯效唑、氯氰菊酯和克百威的量子点标记抗体多组分非竞争均相免疫分析技术。
二、量子点标记抗药物抗体多组分非竞争均相免疫分析技术实施例2
将荧光发射波长为545nm、625nm、705nm的高效水溶性量子点采用碳二亚胺法(Greg Τ. Hermanson, Bioconjugate Techniques, 2ed 2008, p495_496)与抗氯霉素抗体、抗己烯雌酚抗体、抗克伦特罗抗体共价偶联，分别制备荧光发射波长约为M5nm的量子点标记抗氯霉素抗体、荧光发射波长约为625nm的量子点标记抗己烯雌酚抗体和荧光发射波长约为 705nm的量子点标记抗克伦特罗抗体，经超滤纯化后的量子点标记抗体用pH8. 3、含0. 5g/L 叠氮化钠和lmol/L甜菜碱的0. 05mol/L硼酸盐缓冲液溶解定容至1 μ moL/L, 4°C保存备用。 临用前分别将所述量子点标记抗氯霉素抗体、量子点标记抗己烯雌酚抗体和量子点标记抗克伦特罗抗体用0. 02mol/L、pH7. 0的PBS稀释100倍、200倍和50倍后等体积混合。先用甲醇配置含氯霉素、己烯雌酚和克伦特罗标样各lmg/mL的母液，再用 0. 02mol/L、pH7. 0 PBS稀释成分别含氯霉素、己烯雌酚和克伦特罗标样1 10_Vg/mL的混合标样系列，同样条件下以待测样品和目标分析物空白代替标样，设置样品和空白对照。分别在IOOPL标样、待测样品和空白对照溶液中加入等体积的所述量子点标记抗体混合液，在室温下混合反应约10 15min。反应平衡后在235nm激发波长下扫描(见图2 所示)或分别检测M5nm、625nm和705nm附近的最大特征荧光强度。优化反应介质、反应物浓度比、反应温度和时间、激发波长与荧光发射波长等相关条件，选择量子点标记抗体与对应目标分析物免疫反应速度快、敏感性强、稳定性好、量子点标记抗体用量少、空白对照体系荧光强度(Ftl)与含对应目标分析物反应体系的荧光强度 (Fs)比值高、背景干扰少的条件组合。在此基础上，依据FcZFs (反映量子点标记抗体荧光淬灭的程度)与对应目标分析物浓度在一定范围内成正比的规律以及各样品的FcZFs，计算样品中氯霉素、己烯雌酚和克伦特罗的含量，对待测样品中的氯霉素、己烯雌酚和克伦特罗进行定性定量快速检测，从而建立氯霉素、己烯雌酚和克伦特罗的量子点标记抗体多组分非竞争均相免疫分析技术。不同浓度氯霉素与量子点标记抗氯霉素抗体荧光强度变化的关系曲线，如图3所示，FcZFs与氯霉素的浓度在一定范围内成正比。
权利要求
1.一种小分子有机物的量子点标记抗体多组分非竞争均相免疫分析方法，其特征在于以激发波长宽、荧光量子效率高、荧光发射波长不同且互不干扰、稳定性好、表面具有活性羧基的不同核壳结构水溶性量子点作为纳米荧光探针，采用碳二亚胺法标记抗不同目标分析小分子有机物的抗体；将不同量子点标记抗体用磷酸盐缓冲液稀释配置混合溶液，加入含对应目标分析物的混合标样，在均相体系中同时发生多种免疫反应，同样条件下以待测样品和目标分析物空白代替标样，设置样品和空白对照反应体系；将达到平衡的反应体系在同一激发波长下直接进行荧光扫描或多波长检测，分别计算空白对照体系中各量子点标记抗体的特征荧光强度Ftl与标样体系中各对应量子点标记抗体的特征荧光强度Fs之比值；在条件优化的基础上，依据FcZFs与对应目标分析物的浓度在一定范围内呈正比的规律以及待测样品体系的FcZFs,计算待测样品中各目标分析物的含量，建立高灵敏度快速检测多种目标分析小分子有机物的量子点标记抗体非竞争多组分均相免疫分析方法。
2.根据权利要求1所述小分子有机物的量子点标记抗体多组分非竞争均相免疫分析方法，其特征在于所述高效水溶性量子点在200 350nm范围内用同一波长激发光激发，发射半峰宽小于30nm、互不干扰的特征荧光，不同量子点的最大荧光波长的间隔>50nm，荧光量子效率高于60%。
全文摘要
小分子有机物的量子点标记抗体多组分非竞争均相免疫分析方法，涉及小分子有机物的量子点标记抗体多组分非竞争均相免疫分析技术。以荧光发射波长不同的高效水溶性量子点标记抗不同目标分析物的抗体。将不同的量子点标记抗体分散于磷酸盐缓冲液中，加入含对应目标分析物的标样溶液混匀进行非竞争均相免疫反应。将反应平衡后的各标样、样品及空白对照体系分别在同一波长紫外光激发下直接进行荧光扫描或多波长检测，依据空白对照体系的特征荧光强度与标样体系的特征荧光强度的比值大小与对应目标分析物的浓度在一定范围内呈正比的规律，建立高灵敏度快速检测多种目标分析小分子有机物的量子点标记抗体多组分非竞争均相免疫分析技术。
文档编号G01N33/542GK102495205SQ20111039938
公开日2012年6月13日 申请日期2011年12月6日 优先权日2011年12月6日
发明者冯大和, 刘曙照, 徐科 申请人:扬州大学