专利名称：实时监测溶液中病毒颗粒的方法
技术领域：
本发明涉及一种实时监测溶液中病毒颗粒的方法。
背景技术：
病毒在众多微生物中个体最小、结构特殊、致病性强。广泛存在于空气，水，土壤以及人体血液，体液，粪便中，对公共卫生造成极大威胁。以水环境为例，目前已发现的700多种介水传播病毒中，轮状病毒、肝炎病毒和肠道病毒占主导，可引起腹泻、肝炎等多种病症。 其中，轮状病毒每年导致114亿例腹泻，在发展中国家每年导致87万例死亡[Albert，M. J.， et al. ,Bangladesh. Journal of clinical microbiology, 1999. 37 (11) :ρ· 3458]。A型禾口E 型肝炎病毒的传染通常与不合格供应的水有关，E型肝炎在孕妇中尤其严重，其死亡率高达 25% [Aggarwal,R. andK. Krawczynski, Jou rnal of gastroenterology and hepatology, 2000. 15(1) :p. 9-20]。2004年，我国四川省因饮用水污染暴发传染病流行，123名学生罹患甲肝[任金法.中国卫生检验杂志，2009 (004) :p. 942-944]。由此可见，病毒对人体危害巨大，污染水源会对公共卫生造成极大威胁。而存在于血液中的肝炎病毒，HIV病毒等，以及存在于空气中的流感病毒，风疹病毒等同样会对人的健康造成影响。为了保障环境及人体的卫生安全，实时检测各类环境中的病毒的方法及小型便携设备成为临床和日常生活中的迫切需求。目前临床常用的病毒检测方法包括电镜观察，电泳分离以及间接酶联免疫法 (ELISA)，分别从病毒颗粒的大小形态，电荷性质和表面特异性识别方面对病毒的种类、特点进行检测和鉴定。然而这些方法都必须在实验室条件下进行，且耗时较长，未能实现实时检测，技术流程较为复杂，很难进行临床推广。因此，一种高灵敏度实时检测环境中病毒的方法和便携设备亟待开发。纳米孔技术，作为新一代单分子检测的热点，同样可以在高灵敏度病毒检测方面得到出色的应用。在1996 年 Kasianowicz 及其同事首次报道[Kasianowicz，J. J.，et al.， Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 1996. 93(24) :p. 13770-13773] 了单链 DNA 或 RNA 在电场作用下通过 α -溶血素纳米孔，并且得到分子通过孔时产生了阻塞电流(blockade current)的现象，可以依次获得每一个碱基通过纳米孔时阻塞电流幅度。由于不同的碱基产生的阻塞电流都有相应的降低幅度，根据这个可以区分出四种碱基，以获得了 DNA或者RNA分子的序列成分。另外还可以通过阻塞电流持续的时间推算出阻塞整个分子的长度。经过近几十年的不断的努力，纳米孔作为单分子检测的方法研究日益升温，最主要的原因就是这种方法具有方便、快速、廉价等优点。

发明内容
本发明提供一种实时监测溶液中病毒颗粒的方法，可以实现快速检测病毒颗粒。申请人:经研究发现，在病毒检测中，病毒颗粒的粒径大小，形状同样可以通过对阻塞电流大小，信号持续时间的分析得到；此外，孔壁的特异性抗体修饰还能够实现特定病毒种类的定向捕获，从而与其他颗粒区别开来。与传统的电镜观察，电泳分离以及间接酶联免疫法(ELISA)相比具有检测速度快，操作便捷，灵敏度高等特点，是一种极具吸引力的病毒检测方法。通过这种方法，原理上可以实现快速检测病毒颗粒，通过病毒颗粒通过纳米孔时形成阻塞电流的幅值和持续时间，分辨其种类，数量和状态。所述实时监测溶液中病毒颗粒的方法为，在偏置电压作用下，使包含病毒颗粒的样品溶液通过纳米孔，检测电信号，通过与包含标准病毒的溶液通过纳米孔时获得的电信号相比，确定样品溶液中包含病毒颗粒的信息。所述病毒颗粒优选为轮状病毒、乙型肝炎病毒或人类疱疹病毒。优选，通过与包含标准病毒的溶液通过纳米孔时获得的电信号的幅度、持续时间、 时间分布、频率、电信号波形特性或相位特性中的至少一种相比，确定样品溶液中包含病毒颗粒的信息。优选，所述纳米孔尺寸为100-250nm。更优选，所述纳米孔经偶联剂分子、DNA单链或双链分子、RNA分子、PNA分子或蛋白质分子表面修饰。作为本发明的改进，所述包含病毒颗粒的样品溶液通过纳米孔之前，通过亚微米级滤器进行预处理，滤去细菌及其他大颗粒杂质。本发明所使用的检测装置为现有技术，包括用带有纳米孔的芯片将两个溶液池隔开，使得两个溶液池仅通过纳米孔导通。在两个溶液池内各安置一个电极，通过屏蔽导线和数据采集与分析一起串联形成检测系统。所述实时病毒检测方法包括下述过程中的全部或部分步骤样品准备将待测样品(空气，土壤，水样中收集物的水溶液，血液及生物体液，分泌物)配制成氯化钾溶液，并用亚微米级滤膜过滤。信号检测将纳米孔安装于上述检测体系中。在电极两端加上偏置电压，记录电信号。结果比对以已知常见病毒溶液作为标准病毒溶液，通过纳米孔，检测其电信号， 得到标准病毒在不同条件下的过孔阻塞电流特征值(包括阻塞电流的幅值，持续时间，频率，波形和相位)。将所得结果进行统计分析，确定未知样品中特定病毒的有无及数量。本发明具有动态实时、高灵敏度、高通量的特点，满足环境中病毒计数、分类及实时分析等工作的要求。


图1示出固体纳米孔立体图(Ia)和中心剖视图(Ib)；图2示出与滤器装置相连的检测器件示意图；图3示出固态纳米孔用于生物传感检测的系统示意图；图4示出纳米孔病毒检测方法检测水体中轮状病毒的实验结果；图5示出纳米孔病毒检测方法检测水体中乙型肝炎病毒的实验结果；图6示出人类疱疹病毒通过EBV-Ab修饰纳米孔时的电流信号图。其中，1 纳米孔；2 氮化硅薄膜；3 带有纳米孔的芯片；4 电极；5 电解质溶液； 6 亚微米级滤器；7 信号采集分析系统。
具体实施例方式实施例1水体中主要病毒的检测方法样品准备分别将0. 0745g氯化钾加入IOml超纯水，IOml目标病毒标准品(如轮状病毒，乙型肝炎病毒)和IOml待测水样中，配置成IOOmM的氯化钾溶液A，标准病毒液B 和待测样液C。以220nm滤膜分别过滤两种液体，滤去细菌及其他大颗粒杂质。装置用带有直径IOOnm纳米孔1的芯片3将两个溶液池隔开，使得两个溶液池仅通过纳米孔导通。在两个溶液池内各安置一个电极4，电极通过屏蔽导线数据采集与分析系统7相连。标准品测试室温条件下，在芯片两侧的腔内分别加入50 μ 1氯化钾溶液和轮状病毒标准病毒液，插入电极，与数据采集系统连接，关好屏蔽箱。调整电极施加的偏置电压为200mV，记录标准病毒过孔阻塞电流的幅值，持续时间，频率，波形，作为判定此种病毒的标准。以轮状病毒和乙型肝炎病毒为例，两种病毒过孔时电流信号如图4和图5所示。其阻塞电流幅值，持续时间及波形形状都具有明显的差别。检测过程室温条件下，在芯片两侧的腔内分别加入50 μ 1氯化钾溶液和样液， 插入电极，与数据采集系统连接，关好屏蔽箱，采集并准确记录标准病毒过孔阻塞电流的幅值，持续时间，频率，波形和相位特征，并进行统计分析，最终得到不同病毒的过孔阻塞电流特征。因此，水样中的各种目标病毒都可以被准确快速的检测出来。实施例2经修饰纳米孔特异性识别人类疱疹病毒纳米孔修饰把带有直径200nm的芯片放在干燥洁净的IOml试管中，取細1 piranha溶液(75mL浓硫酸(98% )和25mL双氧水溶液(30% ))加入试管中，用枪头小心搅拌，但不要接触芯片，置于100°C水浴加热10-15min。清洗完毕后，将芯片浸入2 % APTS (3-氨基丙基三乙氧基硅烷)溶液中，室温结合30min。取出芯片，用甲醇，超纯水多次清洗。随后，将芯片置于0. 5ml活化缓冲液(0. IM MES,0. 5M NaCl，pH 6. 0)中，加入0. 2mg EDC, 0. 3mg NHS，反应30min后，将0.5ml pH7. 2的磷酸盐缓冲液加入其中，5min后加入 0. 1 μ M人类疱疹病毒抗体EBV-Ab。通过氨基与氨基酸残基的羧基反应，结合于芯片纳米孔内。样品准备取待测唾液样本A (含有EBV)，加入轮状病毒的唾液样品B (不含EBV， 含有轮状病毒)和对照唾液样本C (不含有EBV和其他病毒)lml，分别与9ml IOOmM氯化钾溶液混勻。以220nm滤膜分别过滤两种液体，滤去细菌及其他大颗粒杂质。检测过程室温条件下，在芯片两侧的腔内分别加入50 μ 1氯化钾溶液和样液， 插入电极，与数据采集系统连接，关好屏蔽箱，采集并准确记录标准病毒过孔阻塞电流的幅值，持续时间，频率，波形和相位特征，并进行统计分析，最终得到不同病毒的过孔阻塞电流特征。人类疱疹病毒通过EBV-Ab修饰孔过程电流信号如图6所示。结果显示，只有存在 EBV-Ab特异性识别的抗原病毒EBV时，才会出现阻塞电流持续下降的现象。通过这种方法， 可以实现病毒的准确快速检测。
权利要求
1.一种实时监测溶液中病毒颗粒的方法，其特征在于，在偏置电压作用下，使包含病毒颗粒的样品溶液通过纳米孔，检测电信号，通过与包含标准病毒的溶液通过纳米孔时获得的电信号相比，确定样品溶液中包含病毒颗粒的信息。
2.如权利要求1所述的实时监测溶液中病毒颗粒的方法，其特征在于，所述样品溶液中包含病毒颗粒的信息为包含病毒颗粒的种类、数量或状态中的至少一种信息。
3.如权利要求1所述的实时监测溶液中病毒颗粒的方法，其特征在于，通过与包含标准病毒的溶液通过纳米孔时获得的电信号的幅度、持续时间、时间分布、频率、电信号波形特性或相位特性中的至少一种相比，确定样品溶液中包含病毒颗粒的信息。
4.如权利要求1或2所述的实时监测溶液中病毒颗粒的方法，其特征在于，所述纳米孔尺寸为 100-250nm。
5.如权利要求4所述的实时监测溶液中病毒颗粒的方法，其特征在于，所述纳米孔经偶联剂分子、DNA单链或双链分子、RNA分子、PNA分子或蛋白质分子表面修饰。
6.如权利要求5所述的实时监测溶液中病毒颗粒的方法，其特征在于，所述纳米孔经病毒抗体表面修饰。
7.如权利要求1或2所述的实时监测溶液中病毒颗粒的方法，其特征在于，所述包含病毒颗粒的样品溶液通过纳米孔之前，通过亚微米级滤器进行预处理。
全文摘要
本发明涉及实时监测溶液中病毒颗粒的方法，可以实现快速检测病毒颗粒。所述实时监测溶液中病毒颗粒的方法为，在偏置电压作用下，使包含病毒颗粒的样品溶液通过纳米孔，检测电信号，通过与包含标准病毒的溶液通过纳米孔时获得的电信号相比，确定样品溶液中包含病毒颗粒的信息。优选，通过与包含标准病毒的溶液通过纳米孔时获得的电信号的幅度、持续时间、时间分布、频率、电信号波形特性或相位特性中的至少一种相比，确定样品溶液中包含病毒颗粒的信息。本发明具有动态实时、高灵敏度、高通量的特点，满足环境中病毒计数、分类及实时分析等工作的要求。
文档编号G01N15/00GK102507395SQ201110309068
公开日2012年6月20日 申请日期2011年10月13日 优先权日2011年10月13日
发明者刘全俊, 吴宏文, 孔婧琳, 孙峰, 易红 申请人:东南大学