专利名称：硝基咪唑类化合物快速检测装置的制作方法
技术领域：
本发明属于食品安全检测领域，具体而言，本发明涉及一种检测动物源性食品中硝基咪唑类化合物快速残留量的检测装置。
背景技术：
硝基咪唑类(5-nitroimidazoles)药物是畜禽饲料中常用的抗原虫感染及抗菌药，并具有促生长作用，但是该类药物及其某些代谢物对哺乳动物具有致癌、致畸、致突变作用和遗传毒性。饲料中硝基咪唑类药物的不合理使用造成可食性动物组织中药物残留问题危害到人类的食品安全，因此，如何准确同步测定动物组织、产品及排泄物中药物残留和 饲料中原药对人类食品安全至关重要。硝基咪唑类药物是带有硝基的咪唑化合物，包括甲硝唑，替硝唑，二甲硝咪唑，洛硝达唑，异丙硝咪唑等，为白色或淡黄色结晶，弱碱性，能和酸结合成盐，遇光易分解，易溶于甲醇，微溶于水，主要用于预防和治疗家禽的滴虫病、猪的出血性下痢及厌氧菌感染。畜禽常用的硝基咪唑类药物包括甲硝唑(metronidazole, MNZ)、地美硝唑(dimertidazole,DMZ)、异丙硝唑(ipronidazole, IPZ)、洛硝唑(ronidazole, RNZ)、奥硝唑(omidazole,0ΝΖ)、赛克硝唑(secnidazole，SCZ)和替硝唑(tinidazole，TNZ)等。这些药物在动物体内通过C2侧链的氧化而被快速代谢，代谢物与原药具有相似的潜在毒性。硝基咪唑类药物有三致(致癌、致畸、致突变)作用，体内和体外试验已得到证实，硝基咪唑类药物可引起细胞染色体断裂，缺失和易位，畸变率明显提高，并存在一定的剂量反应关系；可透过胎盘屏障，从而产生致畸毒性和胚胎毒性。由于这些化合物具有致突变性和致癌性，FDA (Food andDrug Administration)不允许在兽医临床上使用甲硝唑,但在贾第鞭毛虫病和牛的阴道滴虫病的治疗上使用仍较普遍。据报道，德国已于1996年初宣布禁用洛硝哒唑作为饲料添加剂。1988年已在全欧洲范围内禁用动物饲料添加剂洛硝哒唑，全欧洲禁用是由于人们发现在停止使用该添加剂5天之后的家禽肉里仍有药物残留物存在，这些残留物对消费者的健康将会造成损害。由于硝基咪唑类药物在国内外畜牧养殖业的不合理使用，它在动物体内的残留问题总是引起人们的关注。为了保障食品卫生和公众健康，欧盟规定二甲硝咪唑在所有生产食品的动物类的肌肉、肝、肾、脂肪的最高残留限量为10μ g/kg，洛硝哒唑在所有生产食品的动物类的肌肉、肝、肾、脂肪的最高残留限量为2μ g/kg，我国农业部第235号公告文“关于动物性食品中兽药最高残留限量”中规定了甲硝唑、二甲哨咪哗、洛硝达唑在动物性食品中的最高残留限量为0，并将其列入残留研究计划。目前对硝基咪唑类化合物残留检测主要有极谱法、薄层色谱法、液相色谱法、液相色谱-质谱或串联质谱联用法、气相色谱法、气相色谱-质谱或串联质谱联用法等，而对于硝基咪唑类化合物残留检测相关的单克隆抗体(McAb)试剂盒的报道较少，单克隆抗体易于生产、高度均质和易于标准化，且特异性高、灵敏度高，使低残留量也能检出，具有无与伦比的优点，非常适宜对药物残留的筛选分析。因此硝基咪唑类化合物的单克隆抗体、组装ELISA试剂盒的研制，开发出具有我国自主知识产权的试剂盒，建立快速检测硝基咪唑类化合物残留的检测法和试剂盒是十分必要的，这一研究将有助于提高我国对动物源性食品安全性的检测技术水平，使我国在兽药领域的检测水平与国际同步，从而能更好地保障人们的健康，推进农副产品的绿色化进程。

实用新型内容本发明的目的在于提供一种成本低、快速、操作简便、灵敏度高的硝基咪唑类化合物快速检测试剂盒。本发明的技术方案是包括一个双层试剂盒盒体，盒体内上层装有包被硝基咪唑类化合物-卵清蛋白抗原的96孔酶标板、一张盖板膜、一个自封袋、一份说明书、一份质检报告，下层有固定泡沫模具形成的放置试剂的下凹瓶位、位于下凹瓶位上的试剂瓶，其特征在于酶标板上装有12条可拆卸的酶标条，每个酶标条有8个反应孔，每个酶标孔预包被了硝基咪唑类化合物-卵清蛋白抗原，放入铝箔袋，装入干燥剂后真空；所述试剂瓶包括有6瓶2mL从O 7. 2ppb梯度浓度的硝基咪唑类化合物标准品、I瓶2mL lmg/L的高浓度硝基咪唑类化合物标准品、7mL硝基咪唑类化合物抗体工作液、30mL样品稀释液、12mL酶标 II抗工作液、40mL浓缩洗涤液、7mL底物A液、7mL底物B液、7mL终止液；试剂瓶的大小、瓶盖的颜色各不相同，固定在具有下凹瓶位的泡沫塑料模具中盖板膜、自封袋、说明书和质检报告一同装在一个自封袋中置于酶标板的下方。试剂盒可以一次连续测定多份样品，也可将板孔拆开多次检测。本试剂盒检测的原理是样品中的硝基咪唑类化合物与酶标板上固定的抗原特异性竞争抗体，加入酶标II抗，与抗体反应，通过酶催化显色剂显色，根据显色的深浅来判断样品中硝基咪唑类化合物的含量。如果样品中的游离硝基咪唑类化合物量少，显色深，反之，则显色浅。本试剂盒具有很高的灵敏度和很高的特异性,可检测的样本包括猪肉、鸡肉、牛肉、蜂蜜，最低检测限为O. 2ppb，准确度80±15%。试剂盒的变异系数均小于10%。本试剂盒检测简便，所需仪器较少，只需要酶标仪、均质器、离心机等简单的实验室仪器，所需检测成本低。可满足食品生产企业的自我质量控制、也可作为食品安全监督和检测机构的常规筛查手段，也能用于科研中动物药理和毒理学研究的辅助手段。

图I是本实用新型的上层示意图图2是本实用新型下层示意图；图3是本实用新型打开上层后的俯视图
具体实施方案参见附图1-3，展现了本实施例所述的一种可快速检测硝基咪唑类化合物的试剂盒的结构，所述盒体I上层装有所述的96孔酶标板2，所述盖板膜、自封袋、说明书、质检报告共同装在一个自封袋中放置于所述酶标板2下面；所述试剂盒下层内具有固定泡沫模具3形成的下凹瓶位，共有14个下凹瓶位2mL lmg/L的高浓度硝基咪唑类化合物标准品瓶位4，7mL硝基咪唑类化合物抗体工作液瓶位5，40mL浓缩洗涤液瓶位6，12mL酶标II抗工作液瓶位7，7mL底物A液瓶位8，7mL底物B液瓶位9，7mL终止液瓶位10，2mL O μ g/L浓度硝基咪唑类化合物标准品11，2mL O. 05 μ g/L浓度硝基咪唑类化合物标准品12，2mL O. 15 μ g/L浓度硝基咪唑类化合物标准品13，2mL O. 45 μ g/L浓度硝基咪唑类化合物标准品14，2mL1.8μ g/L浓度硝基咪唑类化合物标准品15，2mL 7. 2 μ g/L浓度硝基咪唑类化合物标准品16，30mL样品稀释液瓶位17。所述下凹瓶位用于放置装有相应溶液的试剂瓶(14瓶)。本实用新型的实施例一、工作液的准备配液I :0. 3M氢氧化钠溶液称取6. Og氢氧化钠加去离子水溶解定溶至500ml。 配液2:乙酸乙酯-正己烷量取70ml乙酸乙酯，加入30ml正己烷，混匀。配液3 :洗涤工作液用去离子水将20X浓缩洗涤液按I :19体积比进行稀释(I份20X浓缩洗涤液+19份去离子水)用于酶标板的洗涤，洗涤工作液在4°C环境可保存一个月。配液4:样品稀释液用去离子水按1:10 (I份浓缩样品稀释液+9份去离子水)稀释。配液5:肉样提取液用去离子水按1:50 (I份浓缩液+49份去离子水)稀释。二、样品前处理肉样准确称取2±0. Ig均质后的猪肉、鸡肉、牛肉样品于50mL离心管中；加入IOmL肉样提取液;室温(23-27°C )下，高速涡动Imin ；4000g以上，离心IOmin ;取100 μ L于新的离心管中，加入I. 5mL样品稀释液，充分涡动30s ;取50 μ L进行检测。蜂蜜样本称取5. 0±0.05g蜂蜜至50ml聚苯乙烯离心管中；加入IOml乙酸乙酯-正己烷，再加入8ml O. 3M氢氧化钠溶液，用振荡器振荡至蜂蜜全部溶解；3000g以上，室温(20-25°C)离心5min ;移取5ml上层有机相至IOml干净的玻璃试管中，于50°C水浴中氮气流下吹干；加入O. 5ml复溶工作液，涡动30S，加入Iml正己烷，涡动30S，3000g以上，室温(20-25°C)离心IOmin ;除去上层有机相，取下层水相50ml用于分析。三、操作步骤I.将所需的酶标板条插入酶标板架上，并记录下各标准品和样品的位置，建议均做平行实验，未使用的酶标板条用自封袋密封后，立即保存于2-8°C环境中；2.将50 μ L各标准品工作液/样品溶液分别加入对应的标准品/样品孔中；3.在每个板孔中加入50 μ L抗体工作液；4.盖好盖板膜，轻轻振荡酶标板10s，充分混匀，室温(25±2°C)，避光反应30min ；5.揭开盖板膜；6.倒掉板孔中液体，每孔加入260 μ L洗涤工作液，浸泡15 30s ；7.再重复上一步骤3次；8.倒掉板孔中液体，将酶标板倒置于吸水纸上，拍干；9.立即在各板孔中加入100 μ L酶标II抗工作液；[0039]10.盖好盖板膜，轻轻振荡酶标板10s，充分混匀，室温(25±2°C)，避光反应30min ；11.重复步骤 9. 5 9. 8 ;12.立即在每孔中加入100 μ LA、B混合液；(底物A液、底物B液按体积I : I混合，必须充分混匀，混合液在5min内使用，避免使用金属盛装、搅拌试剂)；13.盖好盖板膜，轻轻振荡酶标板10s，充分混匀，室温下(25±2°C)，避光反应15 20min ；14.揭开盖板膜，在各板孔中加入50 μ L终止液，轻轻振荡酶标板10s，充分混匀；15.用酶标仪在双波长450nm、630nm下检测吸光度,在5min内读取。四、计算各标准品(或样品)的平均吸光度值，除以零标(浓度为Oppb的标准品)吸光度值，乘以100，可以得到各标准品对应的吸光度的百分比将各标准品所得值输入半对数系统中，对应各标准品浓度可以拟合标准曲线，请参见质检报告。
权利要求1.一种硝基咪唑类化合物快速检测装置，其特征在于一个双层试剂盒盒体，盒体内上层装有，包被硝基咪唑类化合物-卵清蛋白抗原的96孔酶标板、一张盖板膜、一个自封袋、一份说明书、一份质检报告，下层有固定泡沫模具形成的下凹瓶位、位于下凹瓶位上的试剂瓶，所述试剂瓶包括有6瓶2mL从O 7. 2ppb梯度浓度的硝基咪唑类化合物标准品、I瓶2mL lmg/L的高浓度硝基咪唑类化合物标准品、7mL硝基咪唑类化合物抗体工作液、30mL样品稀释液、12mL酶标II抗工作液、40mL浓缩洗涤液、7mL底物A液、7mL底物B液、7mL终止液。
2.根据权利要求I所述的硝基咪唑类化合物快速检测装置，其特征在于所述的包被硝基咪唑类化合物-卵清蛋白抗原的96孔酶标板酶标板上装有12条可拆卸的酶标条，每个酶标条有8个反应孔，每个酶标孔预包被了硝基咪唑类化合物-卵清蛋白抗原，放入铝箔袋，装入干燥剂后真空。
专利摘要本实用新型涉及一种检测动物源性食品中硝基咪唑类化合物残留量的试剂盒。该试剂盒包括上、下两层，上层装有包被硝基咪唑类化合物-卵清蛋白抗原的酶标板、盖板膜、自封袋、说明书、质检报告；下层有6瓶不同梯度浓度的硝基咪唑类化合物标准品、1瓶高浓度硝基咪唑类化合物标准品、硝基咪唑类化合物抗体工作液、样品稀释液、酶标Ⅱ抗工作液、浓缩洗涤液、底物A液、B液和终止液。采用间接竞争法，待测样品中硝基咪唑类化合物残留与酶标板上固定抗原竞争抗体，再加入酶标结合物，通过酶催化显色，利用样本吸光度值计算出样本中硝基咪唑类化合物的含量。本试剂盒具有检测简便，快速，灵敏度高，检测费用低廉等优点，可满足多种检测需求。
文档编号G01N33/543GK202693589SQ201220254459
公开日2013年1月23日 申请日期2012年6月1日 优先权日2012年6月1日
发明者何丹婷, 王照鹏, 杨铮, 李淑芳 申请人:北京维德维康生物技术有限公司