专利名称：生殖系干细胞的宿主外成熟的制作方法
技术领域：
本发明涉及下述体系，所述体系使来自由于损伤其生殖系干细胞(germlinestem cell)而处于生育力风险的患者的生殖系干细胞在宿主外部或宿主外成熟(在代用(surrogate)动物体内或体外)成熟并在稍后的日子恢复患者的生育力。如果使用针对恶性肿瘤的化学疗法或放射疗法治疗此类患者,则宿主外成熟以及随后的体外受精和子宫植入是必要的；并且由于担忧可能再引入肿瘤细胞而污染原来移植的睾丸或卵巢组织，将避免直接再植入或自体移植回宿主患者。
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背景技术：
生殖系干细胞存在于繁殖器官即卵巢和睾丸中，它们潜在地代表哺乳动物体内最重要、最受保护的干细胞种类之一。已报道了在得自这些组织的干细胞中的遗传保守和高端粒酶活性，以及由染色质染色体修饰的广泛的DNA修饰。科学家们对于成年繁殖组织中存在何种干细胞以及它们在分化中的潜能持不同观点。化学疗法和放射治疗不但以癌细胞为目标，还以快速分裂细胞为目标。在睾丸中，快速分裂的生殖细胞对这些暴露是高度敏感的。在青春期前的睾丸中，生殖系干细胞同样敏感并在放射暴露后严重地剂量依赖性地衰竭。低剂量的细胞毒性药物或辐射使分化的精原细胞衰竭，而较不敏感的精原干细胞以及精母细胞和精细胞可存活。分化中的生殖细胞可继续它们的成熟成为精子细胞，并可用产生于存活的干细胞群的干细胞再定殖(re-colonize)生 精小管(seminiferous tubule)。然而，在严重衰竭的情况下，精子生成仅可在非常少的生精小管中恢复，从而限制生育力。在睾丸干细胞全部衰竭后患者会永久性的不育。对精子生成的影响在青春期时或之前表现得最严重，因为精子典型地不能在青春期后雄性中获得和冷冻保存。如果给予足够的时间重新开始精子生成，甚至少数干细胞可再定殖生精小管。直到最近，人们相信，包括人类的大多数哺乳动物物种的雌性性腺，容纳有封在原始卵泡内的有限数目的减数分裂-停止的生殖细胞(卵母细胞)，其作为在每个月经周期期间排卵时释放的卵的储备库存。通过多种机制包括细胞凋亡，卵母细胞数目在出生后生命期间减少，其被广泛认为最终导致卵巢不再含有生殖细胞。人类中，卵母细胞储备耗尽典型地在生命的第五个十年期间发生，而推动绝经。根据这些基本的繁殖生物学理论，人们还认为，一旦衰竭，卵巢生殖细胞库不能再补充。因此，加速卵母细胞损失的任何治疗对生育力下降有危险并会在比期望的更早的年龄引起绝经。例如，女性暴露于损伤卵巢的广范围的试剂(例如化疗剂和放射疗法)，通常导致过早绝经和不可逆的不孕。目前，在各种不利条件下保存生育力和正常卵巢功能的有限的治疗选择(例如，冷冻保存卵巢组织碎片或单个卵母细胞)是侵入性的并通常需要在先的激素疗法，这对许多患有激素反应性肿瘤的女性而言可能是医学上不适当的。而且，目前没有能推迟绝经期的正常卵巢衰退的治疗选择。已发现了针对在雄性和雌性二者中恢复功能性生殖细胞的两种主要途径。第一种是在存活的组织上嫁接(graft)未成熟组织(卵巢或睾丸)的组织碎片，第二种以干细胞的分离和移植为基础。生殖细胞移植已在啮齿动物模型中开发。将来自小鼠或密切相关物种的生殖细胞显微注射进小鼠的生精小管再次刺激了从供体精原干细胞的精子生成。在转移之前，精原细胞可被冷冻保存或培养。类似地，冷冻保存的卵巢皮质组织已在绵羊和人类中移植，引起发情恢复并在正常交配后产生活的后代。然而，此类自体直接移植回供体生物体对原来被治疗恶性肿瘤的患者而言可能不是最佳的。这是因为如果此类患者在化学疗法或放射疗法后复发，不清楚复发是否来自化学疗法或放射疗法没被杀死的体内恶性细胞贮主(reservoirs)或是否冷冻保存的性腺组织和细胞的再移植包含了此类恶性细胞。因此，针对此类患者的最佳途径是使冷冻保存的性腺组织成熟为功能性精子或卵，并用天然的或类似地宿主外成熟的亲本的卵或精子进行体外受精(有或没有胞质内精子注射或ICSI)，然后将受精的胚胎再移植进雌性亲本。该途径没有肿瘤污染的任何可能性，因为受精的胚胎仅从未污染的宿主外成熟的精子或卵形成。因此,需要人类的生殖系细胞储存系统(banking system),以恢复没有能力储存成熟的精子或卵子的患者的繁殖潜能并使储存的生殖系细胞宿主外/半体内或宿主外/体内成熟来产生成熟的精子或卵子。

发明内容
本公开提供了使未成熟的生殖系干细胞成熟来产生成熟的繁殖细胞的方法。在本文公开的一种实施方式中，提供了使未成熟的生殖系细胞宿主外成熟为单倍体配子的方法，其包括下述步骤:从睾丸或卵巢中获得未成熟生殖系细胞；并在模仿细胞借以体内成熟的条件的条件下，体外培养未成熟生殖系细胞，其中所述培养引起未成熟生殖系细胞成熟为功能性精子或卵母细胞。在另一种实施方式中，未成熟生殖系细胞从青春期前患者中获得。在另一种实施方式中，未成熟生殖系细胞在成熟之前被冷冻保存。在另一种实施方式中，未成熟生殖系细胞是生殖系干细胞或减数分裂前生殖细胞。在一种实施方式中，培养包括在人工生精小管中培养未成熟睾丸生殖系细胞。在另一种实施方式中，培养包括在存在选自胶质细胞源性生长因子、成纤维细胞生长因子、白血病抑制因子和表皮生长因子的组的至少一种生长促进因子的情况下培养未成熟睾丸生殖系细胞。在另一种实施方式中，培养包括在存在选自促卵泡激素、干细胞因子和维甲酸的组的至少一种成熟-诱导因子的情况下培养未成熟睾丸生殖系细胞。在另一种实施方式中，人工生精小管包括涂有细胞外基质的生物相容性管。在另一种实施方式中，细胞外基质是辜丸细胞外基质。还在另一实施方式中，辜丸细胞外基质对睾丸生殖系细胞而言是自体的。在一种实施方式中，培养包括在存在颗粒细胞和纤维蛋白凝块的情况下培养未成熟卵巢生殖系细胞。在另一种实施方式中，培养包括培养在存在生长促进因子(包括胶质细胞源性生长因子、成纤维细胞生长因子、白血病抑制因子、表皮生长因子和生长激素)的情况下被培养的未成熟卵巢生殖系细胞。还在另一实施方式中，培养包括培养在存在成熟诱导因子(包括促卵泡激素、干细胞因子和维甲酸)的情况下被培养的未成熟卵巢生殖系细胞。在另一种实施方式中，纤维蛋白凝块对卵巢生殖系细胞而言是自体的。在另一种实施方式中，颗粒细胞对卵巢生殖系细胞而言是自体的。附图简沭

图1描绘了使用流式细胞计量术从转基因0G2小鼠中分离的睾丸干细胞GFP(绿色荧光蛋白)阳性亚群的富集。GFP表达指出的Oct-4阳性细胞在与野生型(图1A)比较的新生(图1B)和成年(图1C)0G2小鼠二者中作为不同的细胞群体被发现。在Oct-4阳性细胞中，发现由c-Kit阳性(R5)和c-Kit阴性(R2)组成的两种清晰的亚群(图1D-1E)。还展示了 GFP和c-Kit表达之间的关联(图1F-1H)。图2描绘了培养物中专能生殖细胞(mGC)系发育期间的形态改变。在培养前于细胞制备物中观察小鼠0ct-4+/GFP+细胞(图2A ;箭头；第1-3天)。培养后不久观察到Oct-4的下调(图2B;第3-7天)。在培养第二周细胞黏附后，发生明显的形态改变(图2C第7-15天；图2D第15-20天)。培养约三周后，形成含有小圆细胞的集落(图2E ;第20-30天)。培养约一个月后观察到Oct-4的上调(图2F ;第30-40天)。图2G-1中分别展示了来自于新生0G2、成年0G2或新生0G2-LacZ的三种确立的mGC株系的图像(图2G，新生0G2 ；图 2H，成年 0G2 ;图 21，0G2 LacZ)。标度棒:50μπι。图3描绘了在补充有15%胎牛血清(FBS)的ΡΜ_1 培养基中，在小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)饲养层上培养的专能生殖系前体细胞。在培养期间的不同时间点上，使用荧光辅助的细胞分选(FACS)测定GFP阳性细胞的数量(图3A-3D)。图3Ε描绘了细胞数量与时间相比的图。标度棒等于60 μ m。图4描绘了 mGC的表型特征和分子特征。多能和生殖细胞标记物的免疫定位展示于图 4A-4D (Oct-4)、图 4E-4H(Nanog)、图 4M-40(SSEA-1)和图 4I_4L(生殖细胞标记物VASA)中。标度棒:图4A-4H:25μπι;图41-40:20μπι。图4Q中展示了通过RT-PCR测定的多能和生殖特异性标记物的表达。图4Ρ中展示了免疫沉淀(IP)之前和之后对mGC细胞中Oct-4、Nanog和Sox2的蛋白质含量的Western印迹分析。图5描绘了成年的来自脂肪的干细胞(ADSC)、小鼠ES细胞、c-Kit分选后新鲜分离的生殖系干细胞和第10代专能生殖系干细胞(新生0G2)的端粒酶活性和核型分析。生殖系干细胞中的端粒酶活性与小鼠ES细胞中相当，并且高于ADSC细胞中的活性(图5A)。图5B描绘了相同的新生0G2细胞系的核型。该图代表了分析的80个中期涂片。15代后细胞显示正常的核型。图6描绘了培养之前(NGC)和之后(GC)专能生殖系前体细胞的印迹分析，并针对有差异地被甲基化的区域Meg3、PeglO、Oct-4、Igf2r和Rasgrfl与小鼠ES细胞比较。图7描绘了 mGC的自发分化。图7D-7F中展示了胚状体(EB ;图7A)的原肠胚形成和指示极化上皮的标记物的表达(E-钙黏着蛋白和层粘连蛋白I ;图7B-7C)和三种胚层的早期发育，即外胚层(ZIC1，PAX6，S0X1)、内胚层(GATA4，F0XA2)和中胚层(BRACHYURY、BMP4和C0L2A1)。在培养中，再程序化mGC也自发分化为心肌细胞(图7G-7J)、脂肪细胞(图7K)和神经细胞(图7L和7Μ)。标度棒:图7Α和71:50 μ m ;图7C和7Ε:30 μ m ;图7Β和 7D:25μπι;图 7G、7H 和 7L:45μπι;图 7Κ:12ym0图8描绘了诱导的mGC成为谱系特异性表型的分化。图8A-8G中展示了表达神经标记物的细胞的共聚焦图像。图8J中展示了神经基因标记物的表达。图81中展示了分化为心肌细胞的mGC的共聚焦图像。图8L中展示了心基因标记物的表达。图8H中展示了mGC分化后阿利新蓝(alcian blue)阳性的软骨细胞。图8K中展示了软骨细胞特异性基因的表达。标度棒:图 8A、8C 和 8G:20μπι;图 8Β 和 8Η:50μπι;图 8D-8F 和 8 J:10ymo图9描绘了小鼠ES细胞移植进皮肤、肌肉和睾丸中后形成畸胎瘤(图9A-9F)，但是专能的LacZ-GFP mGCs (图9G-9L)移植进皮肤、肌肉和睾丸中后则不形成畸胎瘤。通过H&E染色在薄石蜡切片上鉴定来自ESC的畸胎瘤的形态，而移植的专能生殖细胞(mGCs)的命运则通过以蓝色显示的LacZ染色鉴定。移植后六周，在皮肤(在毛囊的膨胀区域和邻近的皮脂腺中，箭头头部；图9G-9H)、肌肉(箭头；图91-9J)和睾丸(箭头；图9K)中发现GFP-LacZmGCs0在培养之前和之后移植生殖干细胞后的睾丸再生展示于图9M-9R中。免疫缺陷小鼠的正常睾丸的横向切片展示于图9M中。白消安处理一个月后，大部分生精小管的内部精子生成衰竭(图9N)。用新鲜分离的Oct-4阳性细胞移植的小鼠的睾丸在多于50%的生精小管横向切片中显示精子生成，表明在该群体中存在具有SSC特性的细胞(图90)。尽管用Oct-4阳性c-Kit阴性细胞移植的小鼠的多于80%生精小管显示一些程度的精子生成(图9P)，但是接受Oct-4阳性c-Kit阳性细胞的小鼠中的大部分生精小管横向切片是空的(图9Q)。移植的mGC也不能够再迁入(!^populate)受者睾丸，表明它们不具有SSC特性(图 9R)。标度棒:图 9A 和图 9K:275μπι ;图 9B、9D 和 91:60μπι ;图 9C:140μπι;图 9Ε:100 μ m ;图 9F:50 μ m ;图 9G 和 9L: 125 μ m ;图 9Η 和 9J:40 μ m ;图 9M-9R:60 μ m。图10描绘 了将mGC掺入胚泡和宿主胚胎中后嵌合体的形成。图10A-10D中展示了早期胚胎发育和胚泡形成期间LacZ-GFP+mGC细胞的掺入。在8细胞阶段注入的大部分GFP-1acZ细胞已在胚胎发育的第2天被掺入(箭头头部)，一些细胞尚未掺入(箭头)。在第3.5天时，进一步发现GFP阳性细胞被掺入胚泡的内部细胞团(箭头)中。图1OE中作为全胚胎染色展示了显示不同程度嵌合状态的四种嵌合胚胎。为了使内部器官可见，还显示了两种胚胎(用星号标明)的纵向切片(图1OF和10G)。图10H-10K显示切片器官中的嵌合模式，图10L-100显示脑、心、肝和生殖腺脊中组织学切片中的嵌合细胞群体(嵌合的LacZ-GFP细胞显示为蓝色)。图1OP和IOQ中分别展示了嵌合幼兽的组织中GFP和LacZDNA 的扩增。标度棒:图1OA 和 IOC:50μπι ;图1OB 和 IOD:25μπι;图 10E-10D:1250 μ m ;图1OH-1OK:625 μ m ;图 10L-10N:50 μ m ;图 100:10ymo图11在流式细胞计数图中以图形方式描绘了从转基因0G2小鼠中新鲜分离的新生和成年卵巢细胞，其中Oct-4启动子驱动GFP的表达。图1lA显示成年卵巢生殖系干细胞，其通过GFP的荧光强度以图形方式描绘。图1lB显示新生卵巢生殖系干细胞，其通过GFP的荧光强度(GFP+细胞上的c-Kit水平)以图形方式描绘。图1lC以图形方式描绘了表达c-Kit的新生GFP阳性细胞的荧光强度，所述细胞也已知为⑶117。图12描绘了出生后第2天转基因0G2小鼠的卵巢横向切片中可以通过绿色荧光蛋白的表达来鉴定的生殖系干细胞。图12A和12B展示了总体荧光，图12C展示经计算机强化的去除了自发荧光的图像。
图13描绘了对从分离自0G2转基因小鼠的小鼠胚胎干细胞(第3道)、小鼠胚胎成纤维细胞(MEF，第4道)、GFP阳性生殖系干细胞(第5道)和GFP阴性细胞(第6道)中分离的mRNA的RT-PCR分析结果。图14描绘了确立并作为集落在MEF细胞饲养层上生长的、经分离和基本纯化的卵巢生殖系干细胞的显微镜图像。图14A展示了培养4天后的集落；图14B展示了第一类代表性集落形态；图14C展示了第二类代表性集落形态；图14D展示了用胶原酶传代后的集落形态；图14E展示了胶原酶传代后具有清楚确定边缘的第三类代表性集落形态；图14F展示了胶原酶传代后具有不确定边缘的第四类代表性集落形态；图14G展示了传代#1后的集落形态；图14H展示了传代#2后的集落形态；图141展示了传代#3后的集落形态；图14J和14K展示了传代M后两种不同放大率的卵巢生殖系干细胞集落。图15描绘了经分离和基本纯化的卵巢生殖系干细胞的免疫细胞化学染色，所述细胞被染色以揭示以下的表达:多能干细胞标记物0ct-4(图15A);多能干细胞标记物Nanog(图15B);生殖细胞标记物VASA(图15C);和多能干细胞标记物碱性磷酸酶(图15D)。图16描绘了分化中的卵巢生殖系干细胞的图像。图16A展示了 GFP阳性细胞，其类似于在雌性生殖细胞集落中心生长的初级卵母细胞；图16B展示了滤泡样结构的图像；图16C展示了 GFP阳性细胞，其类似于在雌性生殖细胞集落附近生长的初级卵母细胞；并且图16描绘了有颜色的集落。图17在散射图中以图形方式描绘了图16培养的卵巢细胞的流式细胞尺寸分析的结果，验证和表征了大(>15mm)的卵母细胞样细胞:图17A描绘了 MEF对照细胞(< 15mm);图17B描绘了图16的卵母细胞样细胞。图18描绘了精原干细胞和生殖系细胞标记物在成年灵长类睾丸中的免疫组织化学定位。图19描绘了灵长类睾丸生精小管的基底膜上用干细胞标记物阳性染色的细胞的分布。图20描绘了使用流式细胞计量术对灵长类生殖干细胞的表型表征。图21描绘了灵长类生殖系干细胞的流式细胞分析。图22描绘了不同的富集的灵长类生殖系细胞群体中GFRa阳性/VASA阳性的细胞。图23描绘了灵长类生殖系干细胞亚群的羧基荧光素二乙酸盐琥珀酰亚胺酯(CSFE)活性。图24描绘了用白消安处理过的带有灵长类生殖系干细胞的灵长类睾丸的再迁入:用未分选的细胞移植的受者小鼠的生精小管(图24A);通过三种标记物分选的细胞(图24B) ；SSEA-4阳性分选的细胞(图24C);和假移植的对照睾丸(图24D)。图25描绘了通过碘化丙啶染色的灵长类生殖系干细胞群体的流式细胞计量术测定的DNA含量。图26描绘了对灵长类生殖系干细胞中PLZF表达(图26A)和端粒酶活性(图26B)的定量PCR分析。图27描绘了通过增殖细胞核抗原(PCNA)测定的增殖中的灵长类生殖系干细胞的百分比。图28描绘了灵长类生殖系干细胞亚群的基因表达谱。图29描绘了在MEF饲养层上培养10天后扩展的灵长类生殖系干细胞集落的形态(图29A);扩展的灵长类生殖系干细胞集落的SSEA-4染色(图29B和C);和传代4次后扩展的灵长类生殖系干细胞集落的GFR-α染色(图29D)。图30描绘了用SSEA-4(图30A)和VASA(图30B)染色的人类全睾丸组织(THT)。图31 描绘了用 GFR-α (图 31Α)和 VASA (图 31Β)染色的 THT。图32描绘了针对VASA (图32Α)和Nanog (图32Β)染色的THT。图33描绘了针对SSEA_4(图33A)和α 6_整联蛋白(图33Β)染色的THT。图34描绘了图30-33的阴性对照，其由仅用第二抗体染色的人类睾丸切片组成。图35描绘了 THT SSEA-4阳性磁珠分选的细胞移植进用白消安处理的受者小鼠睾丸中，并在一个月以后用SSEA-4(图35A)和人类核蛋白(图35B)染色。图35C和D描绘了阴性对照。图36描绘了 THT SSEA-4+磁珠分选的细胞移植进用白消安处理的受者小鼠睾丸中，并在一个月以后用α 6-整联蛋白(图36Α)和人类核蛋白(图36Β)染色。图37描绘了 THT SSEA-4+磁珠分选的细胞移植进用白消安处理的受者小鼠睾丸并在一个月以后用SSEA-4(图37A)和α 6-整联蛋白(图37Β)染色。图38描绘了图36和37的阴性对照，其由仅用第二抗体染色的人类睾丸切片组成。图39描绘了成年人类睾丸细胞的形态学和细胞表面标记物分析。注意到，得自梗塞性无精子症男人的睾丸的形态学(图39Α)与正常人类睾丸类似(图39Β)。分离后从正常睾丸(图39C)和从无精子症患者收集的睾丸(图39D) 二者也获得了具类似形态学的细胞。注意到，SSC在两种睾丸分离物中都存在并可鉴定为具有大的细胞核的圆形:细胞质比率，1-3核仁和细胞质内含物。从成年人类睾丸中分离的细胞(图39Ε-Η)的表面标记物SSEA-4、⑶49f和⑶90的流式细胞计量术分析。在成年人类睾丸活组织检查中发现了SSEA-4+、⑶49f+和⑶90+细胞的不同群体，且在成年人类睾丸中未发现⑶49f和⑶90的双染色的细胞(图39E-F)。在图391中列出四种独立的流式分析的直方图表示。图40描绘了在成年人类睾丸中的精原细胞干细胞标记物的免疫组织化学定位。生精小管的基底膜处的SSEA-4和CD49f的共定位(图40A-C)。SSEA-4特别位于生精小管的基底膜处的精原细胞亚群，可能为(perSumabely)SSCS。所有的SSEA-4+细胞针对CD49f也是阳性的，而有一些是SSEA-4-的⑶49f+细胞。C-Kit在位于生精小管的基底膜处的两种细胞中和更高级的生殖细胞中被发现(图40E-F)。SSEA-4和c-Kit的共定位揭示了，一些SSEA-4+细胞具有c-Kit并且一些是c-Kit-。CD49f与c_Kit的共定位(图40G-1)显示了生精小管横向切片的基底膜处的大多数CD49f+细胞就c-Kit而言也是阳性染色的。在成年人类睾丸中的Nanog的表达模式与c-Kit类似且其在未分化的和分化的生殖细胞中都存在(图40K-L)。SSEA-4与Nanog的共定位显示了在成年人类睾丸中的一些SSEA-4+细胞是 Nanog+。图41描绘了从成年人类睾丸中分离的SSC的富集群体的定量RT-PCR分析和端粒酶活性。SSEA-4+细胞显示了 SSC特异性基因(包括GFR- α 1、C-Ret, GPR-125和hTERT)的显著(P < 0.05)较高的表达水平(图41A)。另外，C-Kit在SSEA-4+细胞中较之阴性细胞显著增加。SSEA-4+细胞的端粒酶活性也显著(P <0.01)高于新鲜分离的非分选的细胞(图 41B)。图42描绘了人类精原干细胞再迁入小鼠睾丸中的特异性标记物表达。小鼠睾丸中的人类细胞的鉴定是通过人类核蛋白(HNP)抗体检测的(图42A)。注意到，注意到，在小鼠睾丸中建群的人类细胞就生殖细胞特异性标记物VASA而言是阳性染色的(图42B-C)。小鼠睾丸的基底膜处的一些人类细胞共定位CD49f并且一些就该标记物而言是阴性的(图42D-F)。SSEA-4与c-Kit的共定位显示了在小鼠睾丸中的所有SSEA-4+细胞表达c-Kit (图42G-1)。小鼠睾丸中建群的人类细胞之中，一些与GPR-125共定位且一些是用多能标记物Nanog阳性染色的(图42J-L)。HNP与c-Kit的共定位揭示了小鼠睾丸中的所有人类细胞是 c-Kit+(图 42M-0)。图43描绘了用于通过流式细胞计量术表征的人类精原干细胞的细胞表面标记物的表达模式。在成年人类睾丸中发现有微小量的细胞(1-2% )表达GFR-α 1、⑶24、⑶117和⑶166。BCRP、⑶29、MHCI和MHCII在成年人类睾丸细胞中被适当(2_5% )表达。⑶90、⑶49f、⑶34和SSEA-4在从成年人类睾丸细胞中分离的细胞上大量发现。值表示阳性细胞减去任何自动荧光事件的实际数量。图44描绘了用H&E染色(图44B和D) ,DAPI染色(图44C)和PNA染色(图44E)的通过光学显微镜(图44A和F)观察的宿主外成熟的睾丸细胞。图44G描绘了小鼠睾丸细胞、小鼠精子和在培养22天时的宿主外成熟的细胞的流式细胞计量。图45描绘了由于雄性生殖系干细胞移植导致的怀孕的裸鼠后代的平均重量。图45A描绘了裸鼠后代且图45B描绘了非裸鼠后代。图46描绘了不育小鼠的右侧(图46A)和左侧(图46B)睾丸中的GFP+精子和生精小管的流式细胞分析。图47描绘了具有精细胞的尺寸和形态学的宿主外成熟的细胞。图48描绘了宿主外成熟的睾丸细胞成熟为精子。图49描绘了从宿主外成熟的精子和正常卵子形成的受精卵体外受精培养(图49A)和因而产生的胚胎(图49B)。术语定义提供以下的术语定义，作为对读者有帮助的参考。本专利中使用的术语与本发明相关时具有特定的含义。我们尽一切努力根据术语的常规和常见含义使用所述术语。然而，当常见的常规含义与以下定义之间存在偏差时，下述定义优先于常见的用法。定型(committed):本文中使用的“定型”指，细胞被认为永久定型为特定功能。定型的细胞也被称为“终末分化的细胞”。培养:本文中使用的“培养”或“培养的”是指受控条件下的细胞繁殖，从而发生细胞分裂和细胞数量的增加。分化:本文中使用的“分化”指细胞被改造为特定的形式或功能。在细胞中，分化导致更为定型的细胞。胚胎干细胞:本文中使用的“胚胎干细胞”指:全能的、从发育中的胚胎(已达到附着于子宫壁上的发育阶段)获得的任何细胞。在本发明上下文中，胚胎干细胞和前胚胎干细胞是等同的术语。类胚胎干细胞(类ESC)细胞是并非从胚胎直接分离出的全能细胞。类ESC细胞可从经分离和扩展的原性细胞获得。宿主外:本文中使用的“宿主外”是指在供体体外使生殖系细胞成熟。为该公开的目的，宿主外成熟可包括半体内(ex vivo)、体外(in vitro)和体内(在另一非供体人类中或另一物种中)使供体生殖系细胞成熟。扩展的:本文中使用的“扩展的”是指生长中的细胞培养物，与其最初浓度相比其细胞数增加。胎儿干细胞:本文中使用的“胎儿干细胞”指专能的、从发育中的多细胞胎儿(不再处于早期或中期器官生成阶段)获得的细胞。配子:本文中使用的“配子”是指含有对形成完整的人类生物体而言必要的一半遗传物质的繁殖细胞。在受精期间，雄性和雌性配子(分别是精子和卵子)融合，产生受精卵。生殖细胞:本文中使用的“生殖细胞”、“生殖系细胞”或“生殖系组织”是指繁殖细胞，例如精母细胞(spermatocyte)或卵母细胞(oocyte),或将发展成为繁殖细胞的细胞或含有此类细胞的组织。生殖系前体干细胞:本文中使用的“生殖系前体干细胞”是指繁殖细胞，例如精原干细胞的前体或卵母细胞前体干细胞。生殖系干细胞:本文中使用的“生殖系干细胞”是指繁殖细胞，例如精原干细胞(SSC)或卵母细胞前体干细胞。性腺:在本文中使用时，“性腺”是指动物中产生繁殖细胞(配子)的任何配对器官。这些包括产卵的雌性卵巢和产精子的雄性睾丸。未成熟:本文中使用的术语“未成熟”是指还没有达到它们的成熟的、功能性分化状态的生殖系细胞。长期培养物:本文中使用的“长期培养物”是指细胞在受控条件下繁殖长于至少两个月或多于10代。优选地，长期培养物被培养多于4个月，多于6个月或多于I年。优选地，长期培养物被传代多于15代，多于18代或多于20代。长期培养物的持续时间高度依赖于个体细胞，并且在细胞系之间可存在差异性。成熟:本文中使用的“成熟”是指导向终末分化的细胞的经协调的生物化学步骤的过程。专能(multipotent):在本文中使用时专能”是指能产生若干其他细胞类型的细胞，但这些细胞类型数量有限。专能细胞的例子是造血细胞——能发育为数种血细胞但是不能发育为脑细胞的血液干细胞。。专能成年祖细胞:在本文中使用时，“专能成年祖细胞”指从骨髓中分离的且具有分化为外胚层、中胚层和内胚层谱系的潜力的专能细胞。多能(pluripotent):在本文中使用时多能”指能产生除了胎盘细胞或子宫的其它支持细胞之外的任何细胞类型的细胞。出生后干细胞:本文中使用的“出生后干细胞”指从出生后的多细胞生物获得的任何细胞。青春期之前:在本文中使用时，“青春期之前”或“青春期前”是指还没有进入青春期的个体。青春期的开始与高促性腺素释放激素(GnRH)脉冲发生关联，这在性激素、黄体生成素(LH)和促卵泡激素(FSH)升高之前发生。青春期一贯性地在女孩47kg左右和男孩55kg左右时开始。尽管有正常年龄的宽的范围，平均起来，女孩比男孩早约1-2年开始青春期过程(对于女孩平均年龄为9至14岁，对于男孩为10至17岁)，并在更短的时间内完成，女孩通常17岁完成青春期。原生殖细胞:本文中使用的“原生殖细胞”(PGC)指在胚胎发生早期存在的、预定成为生殖细胞的细胞。原生殖系性干细胞:本文中使用的“原生殖系性干细胞”(也简称为“生殖系性细胞”，缩写为PGLSC)是指下述细胞，其来自于成年雄性或雌性繁殖组织，并且能够产生生殖系干细胞及其后代，这通过其再迁入在例如辐射或化学疗法后繁殖性方面不育的睾丸或卵巢组织的能力证实。成年繁殖组织中生殖系性细胞可以是静止的或积极分裂的。再程序化:本文中使用的“再程序化”指重建细胞的遗传程序，使得细胞展示出多能性，并且具有产生完全发育的生物的潜力。另外，所述再程序化给予经历再程序化的细胞下述特征，所述特征在细胞的再程序化前状态中通常不表达或不存在。选择:本文中使用的“选择”是指荧光活化的细胞分选、磁珠分选或收集带有具体标记物谱的细胞的其它手段。性细胞:本文中使用的“性细胞”是指来自哺乳动物雄性或雌性繁殖组织的二倍体或单倍体细胞。这些细胞的代表性例子包括雄性生殖母细胞、雌性生殖母细胞、卵原细胞、A型精原细胞和B型精原细胞。体细胞:本文使用的“体细胞”是指除性细胞及其前体之外的体内的任何组织细胞。体干细胞:本文中使用的“体干细胞”指二倍体专能或多能干细胞。体干细胞不是全能干细胞。干细胞:本文中使用的“干细胞”是指能够自我更新(经过大量细胞分裂循环同时维持未分化的状态的能力)并且至少是专能(分化成为多于一种专门化细胞类型的能力)的细胞。基本纯净的:本文中使用的“基本纯净的”是指细胞群体，其中大于75%、大于85%、大于90%、大于95%、大于98%或大于99%的细胞具有期望的特征。全能:本文中使用的“全能”指，含有产生机体加胎盘的所有细胞所需的全部遗传信息的细胞。人类细胞仅在受精卵最初的极少数次分裂期间具有这种全能能力。发明详沭本公开提供了下述方法，例如为了避免肿瘤细胞再引入，在不能在他们自身体内使生殖细胞成熟的个体中使来自雄性和雌性二者的生殖系干细胞的宿主外成熟并恢复生育力或生育力潜能。骨髓干细胞移植之前，在治疗癌症以及其他非恶性疾病(比如，但不限于镰刀状细胞贫血症和地中海贫血)中使用的化学疗法和放射疗法对经历这些治疗的患者的生育力具有详尽记载的有害的作用。这些治疗可永久性地损害患者的繁殖能力，有30%的机会患者将变得不育。储存生殖系细胞的相关的方法在与本申请同日提交的，题目为“Germline stemcell banking system”(代理人案号 1951314-00061)共同待决申请 xx/xxx, xxx 中公开，并且其全部通过引用并入本文。雄性不育的风险储存来自青春期之前患者的睾丸性腺组织和/或生殖系干细胞并稍后在宿主外使这些细胞成熟以恢复患者的繁殖潜能是有利的。其中组织和生殖系干细胞储存是有利的雄性中的病症或情况包括，但不限于双侧隐睾病、睾丸扭转、隐睾、精索静脉曲张、癌症(包括生殖性和非生殖性癌症)、细胞毒素疗法、骨髓移植。在一种实施方式中，供体是青春期前雄性。在另一种实施方式中，供体是青春期后的雄性。对于成年患者，治疗之前的预防步骤是选择冷冻精子用于体外受精或其他辅助繁殖技术，以防患者治疗后可能变得不育。对于在化学疗法/辐射疗法时没有发育成熟精子的青春期之前的患者，除了组织或细胞储存没有其他选择。在本发明人发明目前的方法之前，对于恢复雄性青春期之前患者的生育力没有切实可行的选择。用于生育力保存的提取和冷冻保存精原干细胞是可考虑的研究主题。另外，冷冻保存睾丸组织(不是单个细胞悬液)的移植已经在动物模型中成功但在人类中还未成功。睾丸组织移植之后生育力恢复概念的证据已经在包括鼠、牛、猪的许多动物模型和灵长类模型以及人类中完善。然而，在患者遭受恶性肿瘤的情况下，担心直接再植入或移植它们的睾丸组织和细胞可能再引入一些污染的肿瘤细胞回到宿主；因此，期望使这些睾丸细胞和组织在宿主外(在另一种非人类代用动物的体内或体外)成熟为成熟的精子并接着使用成熟的精子在卵上进行体外受精。这样受精的卵可接着植入患者选择的预先准备好的子宫中，而无需担心肿瘤污染。雌性不育的风险储存青春期之前患者的卵巢组织和细胞和来自成年患者的卵巢组织、卵泡和细胞并随后使这些细胞在宿主外成熟以恢复患者的繁殖潜能是有利的。其中组织和生殖系干细胞储存是有利的雌性中的病症或情况包括直接或间接影响生育力的病症或情况，比如，但不限于卵巢囊肿、子宫外孕、子宫切除、癌症，包括繁殖和非繁殖癌症、细胞毒素治疗、骨髓移植、卵巢切除、子宫内膜异位或为了计划生育目的，如果女性想维持繁殖潜能但接近或超过她的繁殖黄金时期。在一种实施方式中，供体是青春期前雌性。在另一种实施方式中，供体是青春期后的雌性。在雌性中，细胞毒素治疗造成卵泡破坏并导致过早绝经和不育。除了降低的繁殖潜能，雌激素和其他激素的损失可导致长期的健康问题，比如骨质疏松和心血管病。超过6%的雌性儿童癌症幸存者遭受严重的卵巢衰退。已经经历癌症治疗的成年女性有30%过早绝经的发病率。其他医学程序，比如卵巢切除和子宫切除直接危及或可影响女性的生育力。当患者被诊断为恶性或良性卵巢肿瘤、子宫外孕、子宫内膜异位和卵巢囊肿时，通常需要这些程序。乳腺癌症患者，或处在发展乳腺或卵巢癌症风险的那些，通常进行卵巢切除以减少她们由于激素复杂性和遗传易感性发展这种癌症的机会。对于进行细胞毒素治疗的女性，仅有有限的选择来确保将来的繁殖能力。作为预防步骤，在细胞毒素或抑制细胞生长疗法之前或外科手术去除(一个或多个)生殖器官之前，卵母细胞或卵可被去除并冷冻保存用于辅助繁殖技术，以防患者在治疗之后变得不育。然而，冷冻的和解冻的人卵母细胞的活力相当低，因为冷冻具有低的面积体积比的非常大的细胞的固有的难点，其不允许冷冻保护剂容易地渗透细胞膜。因此，组织、原始卵泡或卵巢细胞(可能包含生殖系干细胞)储存是代替或除了卵母细胞冷冻之外的可行的选择。如果患者变得不育，在治疗之后当他们准备恢复他们的生育力的时候，储存的、冷冻保存的卵巢组织或卵泡可被移植回患者。可选地，对于正在进行治疗癌症或不具有(一个或多个)完整生殖器官的患者，冷冻组织或卵泡可用于本文描述的宿主外成熟方法中，或者在体外或者在动物宿主(仅仅用作使卵母细胞/卵泡成熟的支持系统)中，并且成熟的卵可通过辅助繁殖技术受精。本文公开的生殖系细胞分离自来自哺乳动物包括，但不限于啮齿动物、家养动物、狗、猫和灵长类的性腺组织。术语“灵长类”包括，但不限于人类。生殖系细胞基于它们的表达或缺乏表达许多生殖系细胞标记物、胚胎细胞标记物和多能细胞标记物而被分离。生殖系细胞标记物包括，但不限于VASA、前髓细胞白血病锌因子(PLZF)、源自神经胶质的神经营养因子受体α I (GFR-α I)、a 6_整联蛋白、Thy-1、CD9、⑶90、⑶49f、二花豆凝集素(DBA)、神经细胞黏附分子(NCAM)、生殖细胞核抗原I (GCNAl)和DAZL。多能细胞标记物包括，但不限于0ct_4(P0U5Fl)、Nanog、碱性磷酸酶、SSEA-4、TRA1-60 和 TRA1-81。此外，生殖系细胞也可基于生殖系干细胞基因和/或多能干细胞基因的表达而被分离。生殖系干细胞基因包括，但不限于端粒酶、VASA, c-RET, c-Kit、PLZF、DAZL和GFR- α I。多能细胞基因包括,但不限于0ct-4、Nanog、Dppa_5、Sox2、碱性磷酸酶和Crypto。本文呈现的其他实施方式包括生殖系细胞某些群体的长期培养物，以便产生长期专能或多能细胞系。这些细胞系可用作细胞源，用于分化成组织特异性谱系。长期培养本发明生殖系细胞包括下列步骤:基于生殖系细胞标记物和/或多能细胞标记物和生殖系基因和/或多能基因的表达或表达缺乏，分离基本纯净的期望生殖系细胞的群体；如在实施例部分公开的在生长培养基中培养细胞，其允许连续的细胞分裂同时保持未分化的专能或多能状态。本文描述的长期培养物可被冷冻保存用于将来使用。在某些实施方式中，分离的、基本纯净的生殖系细胞或生殖系细胞系群体可用于在再生性医疗中的治疗应用。本文公开的生殖系细胞能够形成更分化的生殖系细胞，比如雄性中的精母细胞(spermatocyte)、精细胞(spermatid)和精子(sperm),和雌性中的卵泡(follicle)和卵母细胞(oocyte)并能够再迁入(re-populate)不育生殖器官体内。生殖系组织储存系统包括下列组成和/或步骤:1)组织收集；2)将组织转运至中心储存地点；3)在中心储存库处理组织；4)在中心储存库冷冻保存组织和分离的细胞；和5)组织和/或分离的细胞的质量保证和释放。任选的第六和第七步骤包括再植入组织和/或分离的细胞进入供体或宿主外成熟随后体外受精并胚胎植入。本文公开了使储存的或新鲜的生殖系细胞，比如生殖系干细胞、精原干细胞、卵巢干细胞、睾丸组织或卵巢组织宿主外成熟的方法以使不能通过天然方式受孕的患者的繁殖潜能恢复。1.来自雄性的组织收集在启动细胞毒素程序之前或在可导致生殖细胞组织破坏的损伤后不久从睾丸中取出生殖系细胞。在外科无菌环境和麻醉下摘除至少I克生精小管组织。形成单个细胞悬液的组织的物理消化和酶消化可在装运组织至中心储存设施之前或之后进行。在一种实施方式中，睾丸生精小管组织被切成约IOxlOmm的小块并且最多5小块放置在包含灭菌运输培养基的灭菌管中。在另一种实施方式中，组织保持单个小块并放置在包含灭菌运输培养基的灭菌管中。运输培养基包括可维持睾丸生精小管组织和/或解离的细胞的活力达24hr的任何培养基。组织维持培养基的非限制性例子包括PBS、FRS、补充HEPES和抗生素(青霉素和链霉素)的DMEM以及美国专利申请公开号2007/0020759公开的专有培养基，其通过引用对于它关于组织培养基的所有并入本文。2.来自雌性的组织收集在启动细胞毒素程序之前、可导致生殖细胞组织破坏的损伤后不久或在卵巢切除或子宫切除时，从卵巢中取出生殖系细胞。在外科无菌环境和全身麻醉下摘除至少I克卵巢组织。形成单个细胞悬液的组织的物理消化和酶消化可在装运组织至中心储存设施之前或之后进行。在一种实施方式中，卵巢组织被切成约IOxlOmm的小块并且最多5小块放置在包含灭菌运输培养基的灭菌管中。在另一种实施方式中，组织保持单个小块并放置在包含灭菌运输培养基的灭菌管中。运输培养基包括可维持卵巢组织和/或解离的细胞的活力达24hr的任何培养基。组织维持培养基的非限制性例子包括PBS、FRS、补充HEPES和抗生素(青霉素和链霉素)的DMEM以及美国专利申请公开号2007/0020759公开的专有培养基。3.运输组织收获的睾丸或卵巢组织保持在约4°C并运输至中心储存设施以便它在组织收获的24-72hr内到达中心储存设施。4.处理组织收获的卵巢和睾丸组织被酶解离，评价活力和细胞标记物，然后冷冻保存。在一种实施方式中，从组织中富集生殖系干细胞，然后冷冻保存。在另一种实施方式中，不富集生殖系干细胞的总的睾丸或卵巢细胞被冷冻保存。在另一种实施方式中，通过流式细胞计数分选使用对雄性和/或雌性生殖系干细胞特异性的抗体进行生殖系干细胞的富集。5.冷冻保存许多培养基和程序可用于冷冻性腺组织和/或生殖系干细胞。在一种实施方式中，生殖系干细胞冷冻保存在溶液中，所述溶液包含:包括但不限于二甲亚砜(DMSO)、乙二醇、丙三醇和丙二醇的至少一种冷冻保护剂；包括但不限于上面公开的DMEM、MEM和专有培养基的至少一种培养基；包括但不限于蔗糖、葡聚糖、血清替代品和HEPES缓冲液的至少一种添加剂。在一种实施方式中溶液包括CryoStor CS-10培养基(BioLife Solutions Inc.，Bothell, WA)。在另一种实施方式中，血清替代品是敲除血清替代物(Knockout Serum Replacement) (Invitrogen 10828-028)。接着以可控速过程或通过“手工”过程冷冻细胞。通过打开可控速的制冷机开始可控速冷冻程序并为组织或细胞冷冻设置冷冻程序。可控速制冷机将使用液氮以降低内室的温度(并因此降低该室任何内容物的温度)。通过将内室冷却至4°C开始细胞的冷冻程序并保持在那里直到启动继续程序。当可控速制冷机被冷却时，细胞被悬浮在冷却至4°C的冷冻保存培养基中。该细胞悬液等量分装至冷冻管，每个冷冻管lmL。冷冻管接着贴标签并放置在可控速制冷机室中并且启动程序继续。首先，室温度保持在4°C另外的10分钟。接下来，室被以-1°C /分钟的速率冷却直到温度到达_80°C。接着室被以-50°C /分钟的速率冷却直到它达到_120°C的温度。在_120°C下5分钟后冷冻的细胞的温度将平衡至_120°C。冷冻的细胞的冷冻管接着转移至液氮杜瓦(Dewar)用于长期储存。通过制备用于缓慢冷冻细胞的“严寒先生(Mr.Frosty) ”冷冻容器(Nalgene)开始手工冷冻程序。“严寒先生”容器是聚碳酸酯装置，其提供成功细胞冷冻保存和复苏所需要的关键的、可重复的_1°C /分钟的冷却速率。“严寒先生”的底部填充250mL的100%异丙醇。管架放置在顶部，盖子向下螺旋超过管架并且在使用前“严寒先生”放置在4°C下至少I小时。细胞悬浮在冷却至4°C的冷冻保存培养基中。该细胞悬液等量分装至冷冻管，每个冷冻管lmL。冷冻管接着贴标签并放置在预先冷却的“严寒先生”中。“严寒先生”放回4°C10分钟。“严寒先生”接着放置在_80°C制冷机中过夜。保持在_80°C制冷机中过夜之后，冷冻管转移至液氮杜瓦用于长期储存。6.源自卵巢和源自睾丸的生殖系组织和/或细胞的质量保证和释放在冷冻保存之前或在特定的时间点(对于稳定性)，和当释放时，对样品进行效能、纯度、身份、活力和稳定性测定，以确保组织或细胞处在用于移植的合适条件。这些测定量化组织/细胞样品中的具体的相关标记物，从而提供存在的生殖系干细胞的量(以推断如果移植时再迁入睾丸的“效能”)的信息、细胞的活力和任选的DNA分析以确认细胞的身份。稳定性测定由每隔一定间隔被解冻的组织或细胞的小样品组成，以检查冷冻保存的质量。7.源自睾丸的生殖系组织和/或细胞的再植入通过使用本领域普通技术人员已知的标准注射方式的直接注射完成将分离的基本纯净的生殖系干细胞群体移植进入受者(recipient)。在另一种实施方式中，支持细胞，比如为精原细胞分化提供激素刺激的莱迪希或塞尔托利细胞，与生殖系干细胞一起被转移至受者睾丸。这些转移的支持细胞是未修饰的，或被遗传修饰的。这些转移的支持细胞可以是自体的或与供体或受者睾丸异源的。在转移流体中细胞的示例浓度通过简单的实验可容易地确定，但将很可能在约IO3-1Oltl个细胞每ml的范围内。细胞被引入输精管、睾丸网或生精小管通过手工完成。合适的染料或泡沫(直径小于2 μ m)可任选并入载体流体以便简单地识别符合要求的移植生殖系干细胞至睾丸的输送。配备适当变频器的超声波可有助于将针放置在注射部位。合适的细胞移植工具为本领域普通技术人员所知，并包括分子，比如血清白蛋白，胆固醇和/或卵磷脂，硒和无机盐以及血清成分和/或生长因子和/或细胞因子。通常，细胞移植工具为大体上生理学的PH，即7.0至7.6。本发明细胞组合物可单独施用或结合一种或多种药学上可接受的载体施用，以单个剂量或多个剂量施用。合适的药学载体可包括惰性生物输送凝胶或生物可降解半固体基质，以及稀释液或填充物，无菌水溶液和各种非毒性溶剂。药学上可接受的载体一般执行下列3个功能:(I)在本发明细胞组合物中维持并保存细胞；(2)在需要再生、恢复或恢复活力的组织部位处保留细胞；和(3)改善技术人员处理本发明组合物的简单性，比如，但不限于改善可注射组合物的性质或处理外科移植。通过本发明细胞组合物结合药学上可接受的载体形成的药学组合物可以以各种剂型比如可注射的溶液等施用。如果需要，药学载体可包含另外的成分，比如粘合剂、赋形剂等。如果必要，水溶液可被适当地缓冲并且首先用充足的盐水或葡萄糖使液体稀释剂等渗。这类水溶液适用于静脉内、肌内、皮下和腹膜内注射。使用的无菌水性介质可以通过本领域技术人员已知的标准技术获得。8.源自卵巢的生殖系组织和/或细胞的再植入在化学疗法或放射疗法之前，卵巢生殖系干细胞可从患者中分离，体外扩展其数目并保持冷冻直到患者需要它们以恢复他们的生育力。从人类卵巢分离的细胞使用精细针可直接移植到卵巢表面上皮或可选地细胞可被凝聚在纤维蛋白凝块中。纤维蛋白凝块从患者自己的血液制备并在植入过程期间支持细胞的活力和存活。纤维蛋白凝块可被移植回患者并种植在卵巢囊下。在一种实施方式中，为了在具有恶性肿瘤的患者中移植卵巢细胞，使用阳性-阴性选择程序从恶性细胞中分离生殖细胞。然而，在非恶性患者中，卵巢表面上皮(OSE)的移植可能更实际。在收集组织时，OSE被解剖刀从剩余卵巢组织中切片至直径Imm的0.5cm x0.5cm的小块。这些小块使用透明化(vitrification)程序冷冻并保持冷冻直到患者需要它们用于生育力恢复。当需要时，OSE小块被解冻并缝合在一起形成更大的块并移植至不育卵巢的表面。另外，在不同发育阶段的卵巢卵泡可被冷冻并再移植回患者或用于体外培养成为成熟卵泡。来自这些卵泡的卵母细胞可接着通过ICSI(胞质内精子注射)或其他辅助繁殖技术受精。卵巢生殖系干细胞的移植是永久性的生育力恢复。9.源自卵巢的生殖系干细胞的宿主外成熟在超低粘性培养皿中使用没有生长因子和β-巯基乙醇的凝聚物随后在海藻酸钠或存在生长激素的纤维蛋白凝块中3D培养，从人类卵巢中分离的雌性生殖系干细胞可分化成原始卵泡。为进一步支持生殖细胞发育成成熟卵，这些细胞用来自青春期前年龄供体的未成熟颗粒细胞凝聚。该方法允许初级卵母细胞发育成可受精的中期-1I卵母细胞。为分离颗粒细胞，来自青春期前人类卵巢的卵巢被切片并且通过两步分化粘附程序将颗粒细胞与生殖细胞分离。该方法适用于具有恶性肿瘤的患者，并将无恶性细胞的卵泡接着移植回患者卵巢，允许进一步的成熟和卵泡发育。或者这些卵泡在体外成熟。从患者中分离的卵巢卵泡可被冷冻并且随后进行该方案。在每个情况下，源自这些卵泡的MII卵母细胞用于体外受精或ICSI用于受精和随后的胚胎发育。10.源自睾丸的生殖系干细胞的宿主外成熟在生殖系干细胞再植入患者睾丸不可行的的情况下(即在恶性肿瘤、睾丸扭转、隐睾情况下)或在由于睾丸支持细胞的衰退生殖细胞发育受损(即成熟停止)的情况下，睾丸生殖系干细胞在代用动物中或在体外分化至进一步发展阶段并用于ICSI或其他辅助繁殖技术。在一种实施方式中，精原干细胞(SSCs)与适当的支持细胞和生精小管细胞外基质(ECM)混合以制造可支持生殖细胞进一步发育的环境。在青春期前患者中精子生成已经开始但未完成的情况下，已经进入减数分裂的部分成熟的生殖细胞(初级和次级精母细胞)可被储存并用于进一步分化成圆形或伸长的精细胞。精细胞接着可用于ICSI以允许受精和随后的胚胎发育。
本文描述了通过在模仿细胞体内成熟的条件下在体外培养未成熟生殖系细胞，在宿主外使未成熟生殖系细胞成熟为单倍体配子的方法，其中培养引起未成熟生殖系细胞成熟为有功能的精子或卵。未成熟生殖系细胞获得自青春期前哺乳动物或具有阻止生殖系细胞正常成熟的病况的哺乳动物。公开的方法适合用于任何哺乳动物包括，但不限于人类、小鼠、家养动物，比如牛、猪、绵羊和山羊、狗、猫等等。对于睾丸生殖系细胞的宿主外成熟，本文公开的人工生精小管可由可被灭菌的任何生物相容性管制造。在一种实施方式中，管是柔韧的、塑料或硅材料。在另一种实施方式中，管的内径从约150 μ m至约400 μ m,或从约200 μ m至约350 μ m,或从约250 μ m至约300 μ m。管的内表面涂布 细胞外基质材料以模仿生精小管的环境。在一种实施方式中，细胞外基质是睾丸细胞外基质。细胞外基质可从生殖系干细胞供体或从其他个体中分离。睾丸生殖系细胞在人工生精小管中在培养基中培养。培养基，例如是PM-Γ培养基(见US 2007/0020759)。可选的培养基包括DMEM、F12等等或其组合。培养基被补充生长因子和成熟因子，其包括，但不限于胶质细胞源性生长因子、成纤维细胞生长因子、白血病抑制因子、表皮生长因子、生长激素、促卵泡激素、干细胞因子、维甲酸和其组合。睾丸生殖系细胞被培养直到在人工生精小管中形态学上观察到成熟精子并接着收获并用于通过体外受精、胞质内精子注射使卵受精或用于阴道内或子宫内受精。另外，较不成熟的细胞，比如精细胞，可被移植回供体睾丸。对于卵巢生殖系细胞的宿主外成熟，在存在颗粒细胞的情况下在本文公开的任何培养基中培养卵巢生殖系细胞。成熟的细胞可接着用于体外受精、胞质内精子注射，或可被移植回供体卵巢。
实施例下述实施例意图阐明一个或多个实施方式，所述实施方式不限于下文描述的实施方式。实施例1对不同鼠雄性生殖系干细胞群体的分离通过分选Oct-4-GFP生殖细胞分离了纯生殖系干细胞的群体。然后以c_Kit受体分子的表达为基础，再细分Oct-4阳性生殖细胞。酪氨酸激酶受体C-Kit及其配体干细胞因子(SCF ;也已知为Kit配体或Steel因子)是PGC生长和存活的关键调节器。C-Kit从PGC的初始隔离到达到生殖脊期间均在PGC中表达。在出生后小鼠睾丸中，据报道c-Kit可以用作未分化和分化中的A型精原细胞分化的标记物。Oct-4和c-Kit的组合允许分离生殖系干细胞中的两种不同群体:一种含有更原始的生殖细胞或生殖系祖先(0ct-4+/ckit+)，另一种含有预定成为SSC(0ct-4+/c-Kit-)并且能够再生不育睾丸的生殖系干细胞。在培养之前和之后分析这些细胞的分子和表型特征，并且比较它们在具有生长因子混合物的确定的培养条件下产生专能细胞系的能力。另外，使用精原干细胞移植技术评价这些亚群和它们派生的mGC株系再迁入受者睾丸的功能性。雄性生殖干细胞(GSC)通过SSC的自我更新和定型至分化的精原细胞的产生维持精子生成。在某些体外条件下，据报道来自新生和成年小鼠睾丸的GSC均能产生专能干细胞(mGC)系，所述专能干细胞系具有与ESC类似的特征和分化潜能。然而，在不同实验室产生的mGC显示不同的生殖细胞特征，例如一些保留它们的SSC特性，一些则将所述特性完全丢失。因此仍然存在下述可能性，衍生的专能生殖细胞系可来自于小鼠睾丸中存在的不同亚群的生殖系干细胞。为了研究这一问题，使用在生殖细胞特异性Oct-4启动子控制下表达GFP的转基因小鼠模型。关于对转录因子Oct-4和c-Kit受体的表达，在生殖系干细胞中找到了两种不同的群体。只有小鼠生殖系干细胞的0ct-4+/c-Kit+亚类在从新生或成年睾丸中分离并在生长因子的复合混合物中培养时产生下述细胞系，所述细胞系表达多能ES标记物(即Oct-4、Nanog、Sox2、Rex_l、Dppa5、SSEA-1、碱性磷酸酶),显示高端粒酶活性，并且在诱导型分化方案后分化为多种谱系，包括搏动的心肌细胞、神经细胞和软骨细胞。所述数据清楚地显示生殖系干细胞中不同群体的存在，所述群体中只有生殖系祖先能够产生具有一些多能特征的专能细胞系。为了富集生殖系干细胞，将新生和成年睾丸组织在涂有明胶的培养皿上培养2小时，获得差异黏附以去除体细胞而不去除生殖细胞。在差异黏附后，可以回收含有GFP阳性细胞(新生中4-10%;成年中0.01-0.05% )的细胞悬液(图1A-C)。GFP和c-Kit的表达之间存在相关(图1F-1H)。在培养皿上含有所述生长因子混合物的干细胞培养基中培养收获的新生生殖细胞。培养若干天后初始GFP信号(图2A)消失(图2B)。之后，细胞经历不同的形态改变，形成不具GFP信号的持续生长的链样集落(图2C-2D)。通过集落内GFP阳性细胞的出现表明的Oct-4的上调在培养3-4周后出现(图2F)。培养2-4周后，将GFP阳性集落机械转移进下述培养皿中，所述培养皿在补充有15% FBS的相同培养基中含有经细胞色素C处理的鼠胚胎成纤维细胞饲养层(MEF)。通过机械转移至新的MEF培养物而传代3-4次后，集落确立并且能够从培养平板上酶促(胶原酶lmg/ml，5-10分钟)取出用于进一步扩展和/或储存于液氮中。为了从成年小鼠衍生细胞系，使用流式细胞计量术分选在差异黏附后收获的GFP阳性细胞，并直接在MEF上培养。使用0G2或0G2_lacZ小鼠总计产生19个细胞系(10个新生和9个成年)。所有的细胞系或者表达GFP (14个株系)，或者表达GFP-LacZ (5个株系)(图 2G-2I)。另外，从新生野生型⑶-1小鼠中产生mGC株系表明该方法不限于转基因0G2小鼠。所选择的细胞系已被冻/融和繁殖多于40代，估计的细胞倍增时间为72小时(使用手动细胞计数和GFP分选二者(图14))。在培养期间的不同时间点(第2天，图3A ;第5天，图3B ;第9天，图3C ’第15天，图3D)，通过FACS分析GFP阳性细胞数(图3E)。通过流式细胞计量术将C-kit阳性/GFP阳性细胞与c-Kit阴性/GFP阳性细胞分离(图1D-E)，并在MEF养料上培养。只有c-Kit阳性群体产生mGC集落，并且c-Kit阴性池不能产生细胞系。在该研究中使用的生长因子中，GDNF的去除产生更小的集落，表明GDNF在mGC自我更新中的作用。相反，FGF2的去除导致集落的分化，表明FGF2在mGC维持其未分化阶段中的可能作用。LIF或EGF的去除不影响mGC的扩展或分化。mGC集落中的大部分细胞表达0ct_4 (图4A-4D)、Nanog (图4E-4H)、VASA (图41-4L)和 SSEA-1 (图 4M-40)。它们也表达多能基因 Sox2、DPPa5、Rex-U eRas 和 Cripto,以及生殖系特异性标记物 ，包括Stella、DazI> Vasa和cRet (图4Q)。另外,通过Western印迹分析证实了 Oct-4、Nanog和Sox2的表达(图4P)。
第20代的小鼠细胞系显示高端粒酶活性(图5A，与ESC类似)和正常核型(40，XY)(图 5B)。还在培养之前和之后分析了 mGC的全局基因表达和印迹模式，并与ESC比较。有趣的是培养条件未改变测试的所有DMR(差异甲基化区域)中mGC的印迹模式。与仅显示部分产雄(androgenetic)印迹的小鼠ESC相反，mGC清楚地展示100%的产雄印迹模式(图6)。有些令人惊讶的是，微阵列分析显示mGC的全局基因表达谱在培养之前和之后具有87%的相似性。当mGC聚集形成胚状体(EB)时,在9_15天内观察到原肠胚形成(7A)。EB中的细胞表达早期发育标记物，包括E-钙黏着蛋白和层粘连蛋白I (极化的上皮的标记物，图7B-7C)，Zicl、PAX6和Soxl (早期外胚层标记物，图7D和7F)，GATA4和FoxA2(早期内胚层标记物，图7E-7F)和Brachyury、BMP4和C0L2A1 (早期中胚层标记物，图7F)。在培养中，mGC集落自发地分化为心肌细胞(图7G-7J)、脂肪细胞(图7K)和神经细胞(图7L和7M)表达标记物的表型。自发地分化为心肌细胞的一些细胞展示至多3天的有节律的收缩。使用定向分化方案，可以将mGC株系诱导以分化为代表神经祖先(巢蛋白，neuroDl)、神经元(MAP2、NF-68、GAD67)和胶质细胞(GFAP、MBP、A2B5、04、NG2)的神经细胞，如图 8A-8G 和8J中所示。它们也可以被诱导以形成心肌细胞(肌钙蛋白1、心肌球蛋白、结蛋白、Nkx2.5、GATA4，图81和8L)或软骨细胞(胶原Xal，和通过阿利新蓝染色，图8H和8K)。在单独的使用mGC的分化研究中，在培养物中的7个集落内计数使用或不使用神经标记物染色的细胞(核)数量，平均百分比估计为=GFAP+细胞17.6%，Tuj-1+细胞2.5%, MAP-2+细胞2.3%。一般而言，与mGC相比，通过这些方案在ES细胞中诱导的分化高得多。移植后四周，对照动物以及接受Oct-4阳性/c-Kit阳性细胞的动物的睾丸显示在大部分生精小管中无精子生成。然而，接受新鲜分离的Oct-4阳性/c-Kit阴性睾丸细胞的小鼠中80%显示在整个睾丸中一些程度的精子生成，表明细胞悬液中功能性SSC的存在。只有生殖系干细胞的c-Kit-阴性亚群在受者睾丸中建群。图9M-9R和表I中展示了用培养后和培养前的生殖系干细胞移植后的睾丸再生。图9M中展示了免疫缺陷小鼠的正常睾丸的横向切片。白消安处理后一个月，大部分生精小管的内源精子生成衰竭(图9N)。尽管用Oct-4-阳性/c-Kit-阴性细胞移植的小鼠的生精小管中73%显示一些程度的精子生成(图90)，但是接受Oct-4-阳性/c-Kit-阴性细胞的小鼠的大部分生精小管横向切片是空的(图9P)。图9R中展示了 Oct-4-阳性/c-Kit-阴性细胞移植后不久CSFE-标签为阳性的集落。在用mGC移植的受者小鼠睾丸的大部分生精小管中未发现精子生成，表明这些细胞不具有SSC特性(图9Q)。表1.受者小鼠睾丸中生殖系干细胞亚群和专能生殖细胞系移植后精子生成的重
建
权利要求
1.使未成熟生殖系细胞宿主外成熟为单倍体配子的方法，其包括下述步骤: 从睾丸或卵巢中获得未成熟生殖系细胞；并 在模仿所述细胞在原宿主体内成熟的条件的条件下在原供体的外部在代用动物体内或体外培养所述未成熟生殖系细胞，其中所述培养引起所述未成熟生殖系细胞成熟为功能性精子或卵母细胞。
2.根据权利要求1的方法，其中所述未成熟生殖系细胞获得自青春期前患者。
3.根据权利要求1的方法，其中所述未成熟生殖系细胞在成熟之前被冷冻保存。
4.根据权利要求1的方法，其中所述未成熟生殖系细胞是生殖系干细胞或减数分裂前生殖细胞。
5.根据权利要求1的方法，其中所述培养包括在人工生精小管中培养未成熟睾丸生殖系细胞。
6.根据权利要求1的方法，其中所述培养包括在存在选自由胶质细胞源性生长因子、成纤维细胞生长因子、白血病抑制因子和表皮生长因子组成的组的至少一种生长促进因子的情况下培养未成熟睾丸生殖系细胞。
7.根据权利要求1的方法，其中所述培养包括在存在选自由促卵泡激素、干细胞因子和维甲酸组成的组的至少一种成熟-诱导因子的情况下培养未成熟睾丸生殖系细胞。
8.根据权利要求1的方法，其中所述人工生精小管包括涂覆有细胞外基质的生物相容性管。
9.根据权利要求8的方法，其中所述细胞外基质是睾丸细胞外基质。
10.根据权利要求9的方法，其中所述睾丸细胞外基质就所述睾丸生殖系细胞而言是自体的。
11.根据权利要求1的方法，其中所述培养包括在存在颗粒细胞和纤维蛋白凝块的情况下培养未成熟的卵巢生殖系细胞。
12.根据权利要求1的方法，其中所述培养包括培养在存在包括胶质细胞源性生长因子、成纤维细胞生长因子、白血病抑制因子、表皮生长因子和生长激素的生长促进因子的情况下被培养的未成熟卵巢生殖系细胞。
12.根据权利要求1的方法，其中所述培养包括培养在存在包括促卵泡激素、干细胞因子和维甲酸的成熟诱导因子的情况下被培养的未成熟卵巢生殖系细胞。
13.根据权利要求11的方法，其中所述纤维蛋白凝块就所述所述卵巢生殖系细胞而言是自体的。
14.根据权利要求11的方法，其中所述颗粒细胞就所述卵巢生殖系细胞而言是自体的。
全文摘要
本发明提供了使未成熟生殖系细胞宿主外成熟为单倍体配子用于在需要其的患者中恢复生育力的方法。
文档编号G01N33/50GK103154730SQ201080060823
公开日2013年6月12日 申请日期2010年11月5日 优先权日2009年11月5日
发明者法里波茨·伊扎德亚尔, 周永强, 康斯坦斯·袁 申请人:普里梅真生物技术Dba瑞坡司铁有限责任公司, 周永强