专利名称：基于介质微球的荧光相关谱分析方法和装置的制作方法
技术领域：
本发明属于光学计量及超分辨成像领域，具体涉及一种基于介质微球的荧光相关谱分析方法和装置。
背景技术：
科学技术的发展使得人们极大地扩展了自己的视野。随着研究的深入，人们对于微观领域产生了越来越浓厚的兴趣。在化学、生物、医学等诸多领域，为了可以更加准确地掌握研究对象的性质，对单分子的探测与分析成为一种必不可少的研究手段。为了满足上述要求，相应的仪器设备被大量开发出来，荧光相关谱分析装置(Fluorescence Correlation Spectroscopy,FCS)正是其中之一。通过动态地记录收集到的荧光信号的强弱，并进行自(互)相关数字信号处理，FCS可以有效地对活体细胞内的生化反应速率、分子流动速度和分子扩散等信息进行实时测量，从而成为生物化学研究中使用最为广泛的分析装置之一。然而，作为一种光学共焦成像系统，FCS的分辨能力也不可避免地受到了光学远场衍射极限的限制。因此当测试样品中荧光分子浓度过大时，往往不能有效地进行单分子测量而对最终的测试结果产生干扰。解决这个问题最直接的办法是对测试样品进行稀释，然而，鉴于许多的生化反应必须在高浓度浸润环境下才可以完成，采用稀释的办法得到的测试数据并不可靠，甚至可能由于反应无法进行而造成测试失败的结果。

发明内容
本发明提供了一种基于介质微球的荧光相关谱分析方法和装置，使用径向偏振光和切向偏振光分别作为荧光激发光束和荧光抑制光束，通过介质微球的纳米喷射，突破光学远场衍射极限的限制，提高分辨率，并且有效减小了荧光相关谱分析装置(Fluorescence Correlation Spectroscopy, FCS)中的有效激发面积，可以有效应用于高浓度荧光分子样品中。一种基于介质微球的荧光相关谱分析方法，包括以下步骤(1)使用径向偏振光作为荧光激发光束，切向偏振光作为荧光抑制光束，将所述的荧光激发光束和荧光抑制光束同轴平行入射到显微物镜中，并被所述的显微物镜同时聚焦在介质微球上；所述的介质微球位于所述的显微物镜的物方焦平面上，所述的介质微球直径为1 10um，折射率为1. 4 2 ；(2)所述的介质微球对经步骤(1)中显微物镜聚焦后的荧光激发光束和荧光抑制光束进行再次聚焦，在所述的介质微球下表面产生纳米喷射(Nanojet)；所述的纳米喷射 (Nanojet)包括由经步骤(1)中显微物镜聚焦后的荧光激发光束产生的纳米喷射和由经步骤(1)中显微物镜聚焦后的荧光抑制光束产生的纳米喷射，其中，由经步骤(1)中显微物镜聚焦后的荧光激发光束产生的纳米喷射为实心亮斑，由经步骤(1)中显微物镜聚焦后的荧光抑制光束产生的纳米喷射为中空的暗斑；
(3)将步骤(2)所产生的纳米喷射作用于荧光样品并激发荧光信号；换言之，由所述的荧光激发光束产生的纳米喷射和荧光抑制光束产生的纳米喷射共同作用于荧光样品并激发荧光信号；(4)收集步骤( 所激发的荧光信号并进行分析处理，得到荧光相关谱。其中，步骤⑴所述的径向偏振光和切向偏振光，可以是作为工作光束直接入射； 也可以由激光器发出的工作光束转换而来，所述的转换可以通过偏振转换器实现，也可以通过现有技术中其他方法实现。其中，步骤(1)所述的显微物镜，优选为大数值孔径显微物镜，可以为非浸没式或浸没式，其中非浸没式大数值孔径显微物镜的数值孔径为0. 8 0. 95，浸没式大数值孔径显微物镜的数值孔径为1. 0 1. 4，放大倍率为80 100倍。其中，步骤(4)中可以通过显微物镜来收集步骤(3)所激发的荧光信号，也可以通过现有技术中其他方法实现。当通过显微物镜收集所述的荧光信号时，该显微物镜可以是与步骤(1)所述的显微物镜为同一显微物镜，此时收集反射回来的荧光信号，构成“反射模式”；也可以是与步骤(1)所述的显微物镜的参数完全相同并在位置上构成共焦关系的显微物镜，此时收集透射回来的荧光信号，构成“透射模式”。其中，步骤中对于收集到的荧光信号进行分析处理采用现有技术中通用方式来实现，通常是采用计算机来进行分析处理。本发明还提供了用于实现上述的基于介质微球的荧光相关谱分析方法的装置，依次包括光源、第一显微物镜、介质微球、样品架和第二显微物镜，还包括与第二显微物镜连接的荧光信号分析处理装置；其中，所述的光源，用于产生平行入射的同轴的径向偏振光和切向偏振光；所述的第一显微物镜，用于对所述的径向偏振光和切向偏振光进行聚焦；所述的介质微球，用于对经第一显微物镜聚焦后的径向偏振光和切向偏振光进行再次聚焦，产生纳米喷射；所述的样品架，用于放置待观察的荧光样品，所述的荧光样品在所述的纳米喷射的作用下激发产生荧光信号；所述的第二显微物镜，用于收集所述的荧光信号；所述的荧光信号分析处理装置， 用于分析和处理所收集到的荧光信号；所述的第一显微物镜、介质微球、放置在样品架上的待观察的荧光样品和第二显微物镜均位于所述的径向偏振光和切向偏振光的同轴光路上，所述的介质微球位于所述的第一显微物镜的物方焦平面上，所述的介质微球直径为1 10um，折射率为1. 4 2。其中，所述的光源，可以为直接发出径向偏振光和切向偏振光的光源；也可以为激光光源和偏振转换器的组合，即，由激光光源发出线偏光并经偏振转换器转换得到径向偏振光和切向偏振光。所述的偏振转换器可以为现有技术中实现圆柱形偏振光的转换的任何器件与装置，优选为瑞典ARCoptix公司的偏振转换器feidial-Azimuthal Polarization Converter。其中，所述的第一显微物镜和第二显微物镜，优选为大数值孔径显微物镜，可以为非浸没式或浸没式，其中非浸没式大数值孔径显微物镜的数值孔径为0. 8 0. 95，浸没式大数值孔径显微物镜的数值孔径为1. 0 1. 4，放大倍率为80 100倍。所述的第二显微物镜可以与所述的第一显微物镜为同一显微物镜，此时收集反射回来的荧光信号，构成“反射模式”；所述的第二显微物镜也可以与所述的第一显微物镜的参数完全相同，并在位置上构成共焦关系，此时收集透射回来的荧光信号，构成“透射模式”。所述的荧光信号分析处理装置，通常为计算机。本发明的工作原理如下使用径向偏振光作为荧光激发光束，切向偏振光作为荧光抑制光束，两光束同轴平行入射到大数值孔径显微物镜中。两光束通过大数值孔径显微物镜后，在大数值孔径显微物镜的物方焦点附近产生聚焦光场。由于介质微球位于大数值孔径显微物镜的物方焦点上，因此荧光激发光束和荧光抑制光束将通过介质微球的再次聚焦作用，在介质微球下表面产生纳米喷射现象，由于两光束偏振状态不一致，荧光激发光束产生的纳米喷射为实心亮斑，荧光抑制光束产生的纳米喷射为中空的暗斑。由于介质微球的场限制效应，两种纳米喷射的尺寸在径向和轴向上都将小于一般的光学远场衍射极限。同时，根据STED原理，FCS 系统的有效激发面积将在径向上被进一步限制，这种限制效应随着荧光抑制光束光强的增加而不断加强。有效激发面积的减小使得在同一时刻，只有来自单分子的荧光可能被FCS 系统观察到，从而使高浓度荧光分子样品的单分子观察成为可能，提高了观察的准确性。位于有效激发面积内的分子将被激发产生荧光信号，进一步通过大数值孔径显微物镜进行收集并分析处理，得到荧光相关谱。相比于现有技术，本发明具有以下有益的技术效果(1)本发明装置的结构简单，实现方法和原理容易；(2)打破了光学远场衍射极限限制，提高了分辨率；(3)观察准确度高，使用范围有所扩大，可在不对样品进行稀释的前提下对高浓度荧光分子样品进行单分子观察；(4)成本低廉。


图1为本发明的基于介质微球的荧光相关谱分析装置的第一种实施方式的示意图。图2为本发明的基于介质微球的荧光相关谱分析装置的第二种实施方式的示意图。图3为本发明中径向偏振光的示意图。图4为本发明中切向偏振光的示意图。图5为本发明中荧光激发光束经由介质微球产生的纳米喷射的光强分布示意图。图6为本发明中荧光抑制光束经由介质微球产生的纳米喷射的光强分布示意图。图7为本发明中荧光激发光束经由不同折射率的介质微球产生的纳米喷射沿径向(X方向)的光强分布曲线图。图8为本发明中荧光激发光束经由不同折射率的介质微球产生的纳米喷射沿轴向(Z方向)的光强分布曲线图。图9为本发明中荧光抑制光束经由不同折射率的介质微球产生的纳米喷射沿径向(X方向)的光强分布示意图。
具体实施例方式下面结合实施例和附图来详细说明本发明，但本发明并不仅限于此。实施例1如图1所示，一种基于介质微球的荧光相关谱分析装置，依次包括产生径向偏振光Rl和切向偏振光R2的光源、第一显微物镜1、介质微球2和样品架5，样品架5上放置有荧光样品3，第一显微物镜1还连接有用于分析和处理所收集到的荧光信号的计算机(在图 1中并未示出)。其中，径向偏振光Rl和切向偏振光R2同轴且平行入射，第一显微物镜1、 介质微球2和荧光样品3三者均处于径向偏振光Rl和切向偏振光R2的同轴光路上，且介质微球2位于第一显微物镜1的物方焦平面上。上述装置中，产生径向偏振光Rl和切向偏振光R2的光源，可以为直接发出径向偏振光和切向偏振光的光源；也可以为激光光源和偏振转换器的组合，即，由激光光源发出线偏光并经偏振转换器转换得到径向偏振光和切向偏振光。所述的偏振转换器可以为现有技术中实现圆柱形偏振光的转换的任何器件与装置，优选为瑞典ARCoptix公司的偏振转换器 Radial-Azimuthal Polarization Converter。上述装置中，第一显微物镜1为大数值孔径显微物镜，可以为非浸没式或浸没式， 其中非浸没式大数值孔径显微物镜的数值孔径为0. 8 0. 95，浸没式大数值孔径显微物镜的数值孔径为1. 0 1. 4，放大倍率为80 100倍。上述装置中，介质微球2的直径为1 10um，折射率为1. 4 2。采用上述装置进行荧光相关谱分析方法如下使用径向偏振光Rl作为荧光激发光束，切向偏振光R2作为荧光抑制光束，两光束 Rl和R2同轴平行入射到第一显微物镜1中。图3和图4分别为径向偏振光Rl和切向偏振光R2的示意图，可见，径向偏振光Rl 每点的偏振方向都是沿着径向方向，所有的偏振方向构成一个发散束；而切向偏振光R2每点的偏振方向都是沿着切线方向，所有点的偏振方向构成一个涡旋。两光束Rl和R2通过第一显微物镜1后，在第一显微物镜1的物方焦点附近产生聚焦光场。由于介质微球2位于第一显微物镜1的物方焦点上，因此，两光束Rl和R2被同时聚焦在介质微球2上；介质微球2对聚焦后的两光束Rl和R2再次聚焦，在介质微球2下表面产生纳米喷射现象，详细说明如下对于任意形式的入射光，经过介质微球2的光场分布都可以使用时域有限元差分 (Finite Difference Time Domain, FDTD)算法对其进行精确仿真模拟。对于荧光激发光束来说，由于它的偏振态为径向偏振光R1，计算结果表明它的纳米喷射现象呈现为一个实心亮斑，如图5所示。在径向(X方向)和轴向(Z方向)两个方向上，光斑的尺寸都小于光学远场衍射极限。进一步的计算表明，它的大小与介质微球2的折射率相关——当介质微球2的折射率处于1. 4 2区间时，随着介质微球2折射率的增加， 纳米喷射在径向(X方向)和轴向(Z方向)两个方向上都被进一步压缩。图7和图8清晰地描述了这种变化趋势。如图7所示为荧光激发光束经由不同折射率的介质微球2 (直径为3um)产生的纳米喷射沿径向(X方向)的光强分布曲线图；图8为荧光激发光束经由不同折射率的介质微球2 (直径为3um)产生的纳米喷射沿轴向(Z方向)的光强分布曲线图。
对于荧光抑制光束来说，由于它的偏振态为切向偏振光R2，FDTD算法计算结果表明它的纳米喷射现象呈现为一个空心的暗斑，如图6所示。暗斑的大小也与介质微球2的折射率相关，但与荧光激发光束不同，当介质微球2的折射率处于1. 4 2区间时，暗斑的大小并没有呈现一直缩小的趋势，它的径向(X方向)尺寸在折射率等于1.8时达到极小值， 如图9所示。图9为荧光抑制光束经由不同折射率的介质微球2 (直径为3um)产生的纳米喷射沿径向(X方向)的光强分布示意图。荧光激发光束的主要作用是对荧光样品3中的荧光分子进行激发。事实上由于在上述装置中由荧光激发光束产生的纳米喷射大小已经小于光学远场衍射极限，仅仅使用荧光激发光束便可以得到比传统FCS更好的分辨率。尽管如此，此时的FCS有效激发区域在径向(X方向)和轴向(Z方向)上的大小仍达到百纳米量级，对于高浓度荧光分子样品来说进行单分子分析仍然不够，因此有必要对FCS有效激发面积进行进一步压缩。荧光抑制光束的主要作用是抑制照射区域的荧光激发现象，压制荧光信号的产生。由于荧光抑制光束通过介质微球2产生的纳米喷射为中空的暗斑，其与荧光激发光束产生的纳米喷射同时作用在荧光样品3上时，光斑中心点处的荧光激发不受影响但其周围区域的荧光激发将被压制，从而使荧光信号仅仅来自于光斑中心点，达到压缩FCS有效激发面积的目的。抑制作用随着荧光抑制光束光强的增加而增强，可以用公式表述为d = H{a-s[g)其中d为FCS有效激发面积的径向(X方向)尺寸，a为抛物线拟合系数，ζ为荧光抑制光束通过介质微球2产生纳米喷射的最大光强Isted与荧光激发光束过介质微球2产生纳米喷射的最大光强Is的比值，即ζ = Isted/Is通过上述公式可以计算FCS有效激发面积的径向(X方向)尺寸，如当介质微球2 的大小为3um、折射率为1.8时，径向尺寸d约等于50nm。FCS有效激发面积的轴向(Z方向)尺寸1与荧光激发光束通过介质微球2产生纳米喷射的轴向(Z方向)尺寸相等如当介质微球2的大小为3um、折射率为1. 8时，轴向尺寸1约等于lOOnm。通过两种纳米喷射的共同作用对荧光样品3进行观察并激发荧光信号，荧光信号通过反射再次经过第一显微物镜1，由第一显微物镜1收集并接入与第一显微物镜1连接的计算机进行分析处理，这一过程被称为“反射模式”。实施例2如图2所示，一种基于介质微球的荧光相关谱分析装置，依次包括产生径向偏振光Rl和切向偏振光R2的光源、第一显微物镜1、介质微球2、样品架5和第二显微物镜4，样品架5上放置有荧光样品3，第二显微物镜4还连接有用于分析和处理所收集到的荧光信号的计算机(在图2中并未示出)。其中，径向偏振光Rl和切向偏振光R2同轴且平行入射， 第一显微物镜1、介质微球2、荧光样品3和第二显微物镜4均处于径向偏振光Rl和切向偏振光R2的同轴光路上，且介质微球2位于第一显微物镜1的物方焦平面上。可见，与实施例1的装置相比，本实施例只是增加了一个第二显微物镜4，第二显微物镜4与第一显微物镜1参数完全相同。第二显微镜4的作用是收集由荧光样品3产生的荧光信号。因此，与实施例1的方法相比，仅仅是在收集荧光信号的步骤有所不同。本实施例中，荧光信号将不再通过反射再次进入第一显微物镜1，而是直接透过荧光样品3被第二显微物镜4收集，并接入第二显微物镜4连接的计算机进行分析处理，这一过程被称为 “透射模式”。为了达到最佳收集效果，第二显微物镜4与第一显微物镜1在位置上构成共焦关系。与实施例1中的“反射模式”相比，本实施例中的“透射模式”增加了一个显微物镜，因此提高了系统成本；并且，“透射模式”仅仅适用于荧光样品3为透明样品的情况，而 “反射模式”则无此限制。本发明方法和装置在不做任何改动的情况下，也可以适用于单分子双光子荧光相关谱分析的应用。
权利要求
1.一种基于介质微球的荧光相关谱分析方法，其特征在于，包括以下步骤(1)使用径向偏振光作为荧光激发光束，切向偏振光作为荧光抑制光束，将所述的荧光激发光束和荧光抑制光束同轴平行入射到显微物镜中，并被所述的显微物镜同时聚焦在介质微球上；所述的介质微球位于所述的显微物镜的物方焦平面上，所述的介质微球直径为 1 10um，折射率为1. 4 2 ；(2)所述的介质微球对经步骤(1)中显微物镜聚焦后的荧光激发光束和荧光抑制光束进行再次聚焦，在所述的介质微球下表面产生纳米喷射；(3)将步骤(2)所产生的纳米喷射作用于荧光样品并激发荧光信号；(4)收集步骤C3)所激发的荧光信号并进行分析处理，得到荧光相关谱。
2.如权利要求1所述的基于介质微球的荧光相关谱分析方法，其特征在于，步骤(1)所述的显微物镜为非浸没式大数值孔径显微物镜或浸没式大数值孔径显微物镜，所述的非浸没式大数值孔径显微物镜的数值孔径为0. 8 0. 95，所述的浸没式大数值孔径显微物镜的数值孔径为1. O 1. 4，放大倍率为80 100倍。
3.如权利要求1所述的基于介质微球的荧光相关谱分析方法，其特征在于，步骤(4) 中，通过显微物镜来收集步骤C3)所激发的荧光信号。
4.用于实现如权利要求1 3任一所述的基于介质微球的荧光相关谱分析方法的装置，其特征在于，依次包括光源、第一显微物镜、介质微球、样品架和第二显微物镜，还包括与第二显微物镜连接的荧光信号分析处理装置；其中，所述的光源，用于产生平行入射的同轴的径向偏振光和切向偏振光；所述的第一显微物镜，用于对所述的径向偏振光和切向偏振光进行聚焦；所述的介质微球，用于对经第一显微物镜聚焦后的径向偏振光和切向偏振光进行再次聚焦，产生纳米喷射；所述的样品架， 用于放置待观察的荧光样品，所述的荧光样品在所述的纳米喷射的作用下激发产生荧光信号；所述的第二显微物镜，用于收集所述的荧光信号；所述的荧光信号分析处理装置，用于分析和处理所收集到的荧光信号；所述的第一显微物镜、介质微球、放置在样品架上的待观察的荧光样品和第二显微物镜均位于所述的径向偏振光和切向偏振光的同轴光路上，所述的介质微球位于所述的第一显微物镜的物方焦平面上，所述的介质微球直径为1 lOum，折射率为1. 4 2。
5.如权利要求4所述的装置，其特征在于，所述的第一显微物镜为非浸没式大数值孔径显微物镜或浸没式大数值孔径显微物镜，所述的非浸没式大数值孔径显微物镜的数值孔径为0. 8 0. 95，所述的浸没式大数值孔径显微物镜的数值孔径为1. O 1. 4，放大倍率为 80 100倍。
6.如权利要求4所述的装置，其特征在于，所述的第二显微物镜为非浸没式大数值孔径显微物镜或浸没式大数值孔径显微物镜，所述的非浸没式大数值孔径显微物镜的数值孔径为0. 8 0. 95，所述的浸没式大数值孔径显微物镜的数值孔径为1. O 1. 4，放大倍率为 80 100倍。
7.如权利要求4所述的装置，其特征在于，所述的第二显微物镜与第一显微物镜为同一显微物镜。
8.如权利要求4所述的装置，其特征在于，所述的第二显微物镜与第一显微物镜的参数完全相同，并在位置上构成共焦关系。
全文摘要
本发明公开了一种基于介质微球的荧光相关谱分析方法和装置，该方法使用径向偏振光和切向偏振光分别作为荧光激发光束和荧光抑制光束，依次通过显微物镜的聚焦和介质微球的纳米喷射后，再作用于荧光样品并激发荧光信号，通过对荧光信号的收集和分析处理完成荧光相关谱分析。该装置依次包括产生径向偏振光和切向偏振光的光源、第一显微物镜、介质微球、放置有荧光样品的样品架和第二显微物镜，还包括与第二显微物镜连接的荧光信号分析处理装置。第一显微物镜、介质微球、荧光样品和第二显微物镜均处于径向偏振光和切向偏振光的同轴光路上，且介质微球位于第一显微物镜的物方焦平面上。本发明可以有效应用于高浓度荧光分子样品中。
文档编号G01N21/64GK102305782SQ20111022843
公开日2012年1月4日 申请日期2011年8月10日 优先权日2011年8月10日
发明者刘旭, 匡翠方, 王婷婷, 郝翔 申请人:浙江大学