专利名称：一种微量悬浮肿瘤细胞的计数方法
技术领域：
本发明涉及一种细胞学实验中的细胞计数方法，具体地说是一种微量悬浮肿瘤细胞的计数方法。
背景技术：
细胞计数是细胞学实验的一项基本技术，它是了解培养细胞生长状态，绘制生长曲线，测定培养基、血清、药物等物质生物学作用的重要手段。在动物细胞原代与传代培养、细胞冷冻与复苏等众多技术中需要进行细胞计数，植物细胞进行悬浮培养也需要测定细胞数目。常用的细胞计数方法有经典计数法、电子细胞计数仪计数法、MTT比色法等等。此外，还有一些针对某些特定标本进行改良的计数方法。经典法就是用血球计数板进行细胞计数的方法，其是先用酒精清洁计数板及专用盖玻片，随后用绸布拭干。上覆盖玻片，用吸管将待测的细胞液打均匀，中层吸取10μ1细胞液放于盖玻片边缘上，待毛细作用使液体进入盖片和玻片之间的空隙中，不要溢出盖玻片，也不要过少或带气泡，放置1～2分钟，用10X物镜观察计数板四角大方格中的细胞数。细胞压中线时，只计左侧和上方者，不计右侧和下方者。全部计数完后，用蒸馏水冲洗血细胞计数板和盖玻片，再用70％乙醇冲洗，用擦镜纸吸干。按下列公式计算肿瘤细胞数每ml原液中含有细胞数＝(4大格细胞数之和/4)×104×稀释倍数。到目前为止血球计数板计数法最为经典的计数技术，它可用于血细胞计数，培养的细胞及需要在显微镜下计数的各种样品。但是使用经典计数法时也有局限性，即计数时细胞浓度必须大于2×104个/ml，所以经典法不适合浓度小于2×104个/ml的细胞液计数。如在进行PCR操作时，最后的细胞液往往只有几微升，而且细胞液浓度又很低。

发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种快捷、有效的微量悬浮肿瘤细胞的计数方法，以适合各种试验研究的需要。
本发明所要解决的技术问题可以采用以下技术方案来实现。
一种微量悬浮肿瘤细胞的计数方法，其是用吸管充分打匀待测细胞液，在中层吸取1μl的细胞液；轻轻拭去枪头周围的液体；将薄壁EP管平放在桌面，枪头快速地在小管内加入1μl细胞悬液，使其成为一个小圆点状的液滴，盖上盖子；放置1～2分钟后，在倒置显微镜下直接计数液滴内的全部细胞。
本发明的方法对设备、试剂的要求很低，一般的实验室条件即可满足要求。另外，该方法还可将细胞按任意比例稀释，对各种浓度水平的细胞数均能准确计数，适合各种试验研究的需要。该方法还能在其他如临床检测肿瘤细胞、制备单克隆抗体、单细胞PCR扩增等许多实验室技术中得到应用。
具体实施例方式
以下结合经典法和本发明的微量悬浮肿瘤细胞的计数方法的比较来进一步说明本发明。
1 材料与方法1.1 材料选用中科院上海细胞所的K562肿瘤细胞，用含10％FCS的RPMI1640培养液，置于37℃，5％CO2饱和湿度培养箱中培养。实验时，按常规用血球计数板计数3次，取其平均值(以其作为标准浓度)。取5μl的细胞液用PBS平衡盐溶液稀释1∶5、1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30、1∶40、1∶50，得已知不同浓度肿瘤细胞的样品，用经典法和本发明的方法取以上样品计数细胞，每种方法平均测试3次，取其平均值。
1.2 仪器血球计数板、计数器、加样枪、无菌吸管、薄壁EP管、普通光学显微镜或倒置显微镜。
1.3 方法1.3.1 经典计数法先用酒精清洁计数板及专用盖玻片，随后用绸布拭干。上覆盖玻片，用吸管将待测的细胞液打均匀，中层吸取10μl细胞液放于盖玻片边缘上，待毛细作用使液体进入盖片和玻片之间的空隙中，不要溢出盖玻片，也不要过少或带气泡，放置1～2分钟，用10X物镜观察计数板四角大方格中的细胞数。细胞压中线时，只计左侧和上方者，不计右侧和下方者。全部计数完后，用蒸馏水冲洗血细胞计数板和盖玻片，再用70％乙醇冲洗，用擦镜纸吸干。按下列公式计算肿瘤细胞数每ml原液中含有细胞数＝(4大格细胞数之和/4)×104×稀释倍数。
1.3.2 本发明的微量悬浮肿瘤细胞的计数方法先用吸管充分打匀待测细胞液，快速在中层吸取1μl的细胞液。用绸布轻轻拭去枪头周围的液体。将0.2cm薄壁EP管平放在桌面，枪头快速地在小管内加入1μl细胞悬液，使其成为一个小圆点状的液滴，盖上盖子。放置1～2分钟后，在倒置显微镜下直接计数液滴内的全部细胞。
1.3.3 统计学方法，所得数据以(x±s)表示，前后数值差异比较用t检验、直线回归、相关分析。
2 结果2.1 未稀释细胞，经典法与本发明的微量悬浮肿瘤细胞的计数方法两种计数方法比较。其结果见表1。
表1 未稀释两种计数方法结果比较(单位×104个/ml)

※通过计算t＝2.138，查表得知t0.05＞t，P＞0.05，计数结果没有显著性差异。表明这两种方法计数结果一致。在某些情况下，可以用本发明的微量悬浮肿瘤细胞的计数方法替代经典法进行细胞计数。
2.2 稀释后的细胞，经典法与本发明的微量悬浮肿瘤细胞的计数方法(两种计数方法)比较。
未稀释标本中细胞浓度为67×104/ml，用经典法与本发明的微量悬浮肿瘤细胞的计数方法计数细胞的方法测定同一稀释倍数的标本，其结果见表2。
2.2.1 以经典计数法计数细胞浓度值为X，微量计数法计数结果值为Y，两者之间的线性关系为相关系数r＝0.998461。查表P＝0.01时，r0.01＜r，相关性极显著，为强直线相关。
2.2.2 分别以经典法与本发明的微量悬浮肿瘤细胞的计数方法计数的稀释倍数为自变量，对各浓度梯度进行线性回归分析，结果为(1)经典计数法 相关系数r＝-0.89462；结果表明稀释倍数与细胞浓度之间相关性较强，为负强直线相关。回归方程y＝124.0167-4.07476x；(2)微量计数法 相关系数r＝-0.80930；结果表明稀释倍数与细胞浓度之间相关性较强，为负强直线相关。回归方程y＝92.54143-2.03931x；
表2 稀释后，两种计数方法结果比较(单位个/μl)

从以上的数据可以看出两种方法计数结果相差不大，其结果显示经典计数法在细胞浓度＜2×104个/ml时，其实际测得值均为“0”。本发明的微量悬浮肿瘤细胞的计数方法在细胞浓度＜2×104个/ml时，其测定值与期望值相接近。
从以上结果可以得知，稀释操作不会影响本发明的微量悬浮肿瘤细胞的计数方法的结果。无论有没有稀释处理，微量法测定的结果都与经典计数法这种基本测定方法的结果相近。当细胞液浓度低于2×104个/ml时，经典法计数测得值均为“0”，而微量法计数的结果仍然与期望值相接近。
所以，虽然本发明的微量悬浮肿瘤细胞的计数方法的精确度没有经典法好，但是在细胞液浓度低于2×104个/ml时，可以使用微量法来替代经典计数法。在进行操作时，要注意尽量使细胞分散成单个细胞，取样计数前，应充分混匀细胞悬浮液，在连续取样计数时，尤应注意这一点，否则会影响细胞计数结果，使前后计数结果出现很大的误差。显微镜下计数时，遇到2个以上细胞组成的细胞团，应按单个细胞计算，如细胞团＞10％，说明分散不充分。
本发明的微量悬浮肿瘤细胞的计数方法计数的原理就是把一定体积的细胞液，在显微镜下直接计算其个数，利用所得出的结果推算出每毫升细胞液中的细胞数量。微量法测定和分析不仅仅局限于某一种单一的方法，其实微量法也可以应用于很多领域。
本发明的微量悬浮肿瘤细胞的计数方法可以应用于临床检测肿瘤细胞的数量。恶性肿瘤是目前威胁人类健康和生命的主要疾病之一，人们一直在探索肿瘤诊断治疗的新途径和新方法。肿瘤细胞不断分裂，形成新的肿瘤细胞，并由原发部位向周围组织浸润和它处转移，这种转移如无法控制，将进一步侵犯要害器官和引起衰竭，最后导致死亡。有实验表明，当小量瘤细胞转移时，可形成致死性肿瘤，而大量相同肿瘤细胞转移则大都被排斥。所以当只有少数的几个肿瘤细胞开始转移时，用一般的影像学诊断方法更是不可能发现，往往导致临床的错误判断，丧失治疗时机。我们可以考虑利用免疫组化和本发明的微量悬浮肿瘤细胞的计数方法检测肿瘤细胞的数量，然后获得单个肿瘤细胞进行研究。
具体做法是临床检测中，1μl血液中通常含有7000-10000个细胞。在1μl的血液中，加入抗体、抗原，通过抗体抗原结合反应，分离出的几个含有癌抗原的细胞，此时经典法肯定计数不出结果。在这种情况下，可以用本发明的微量悬浮肿瘤细胞的计数方法测定出管内癌抗细胞含量，推算出全身有几个癌抗细胞。这种方法测定的结果可以作为术后随访，监测肿瘤复发、转移的指标。
用本发明的微量悬浮肿瘤细胞的计数方法还可以从大量的细胞悬液中制取出一个细胞。按照经典的研究提示，体内的B细胞分泌抗体，每一个B细胞分泌一种类型的免疫球蛋白。自然界内存在的抗原达到108以上，人体为了生存应付这样复杂的环境，必须建立一个庞大的抗体库，因此每个B细胞产生的抗体我们可以用微量法来制备单克隆抗体。单克隆抗体的制备主要涉及动物免疫、细胞融合、选择培养、克隆化等技术。其中克隆化就是分离出单个细胞，使其通过分裂增殖而获得一个遗传性十分均一的细胞群体的全部过程。经过数次克隆化后，可建立单克隆细胞系。我们可以使用微量法来进行克隆化。将细胞悬液经过多次稀释，直至96孔培养板的每孔中可能只含有1个细胞的浓度，并使细胞增殖，从而获得单克隆抗体细胞系。
单细胞基因诊断是一项高新技术，随生物技术的发展，越来越多的新技术应用于这一领域，使更多的遗传疾病得以根治。同样地，可以使用本发明的微量悬浮肿瘤细胞的计数方法从大约106个/ml的细胞液中取出一个细胞进行单细胞PCR扩增。
权利要求
1.一种微量悬浮肿瘤细胞的计数方法，其是用吸管充分打匀待测细胞液，在中层吸取1μl的细胞液；轻轻拭去枪头周围的液体；将薄壁EP管平放在桌面，枪头快速地在小管内加入1μl细胞悬液，使其成为一个小圆点状的液滴，盖上盖子；放置1～2分钟后，在倒置显微镜下直接计数液滴内的全部细胞。
2.根据权利要求1所述的一种微量悬浮肿瘤细胞的计数方法，其特征在于显微镜下计数时，遇到2个以上细胞组成的细胞团，按单个细胞计算，如细胞团＞10％，说明分散不充分。
全文摘要
本发明公开了一种微量悬浮肿瘤细胞的计数方法，其是用吸管充分打匀待测细胞液，在中层吸取1μl的细胞液；轻轻拭去枪头周围的液体；将薄壁EP管平放在桌面，枪头快速地在小管内加入1μl细胞悬液，使其成为一个小圆点状的液滴，盖上盖子；放置1～2分钟后，在倒置显微镜下直接计数液滴内的全部细胞。本发明的方法对设备、试剂的要求很低，一般的实验室条件即可满足要求。另外，该方法还可将细胞按任意比例稀释，对各种浓度水平的细胞数均能准确计数，适合各种试验研究的需要。该方法还能在其他如临床检测肿瘤细胞、制备单克隆抗体、单细胞PCR扩增等许多实验室技术中得到应用。
文档编号G01N1/34GK1715867SQ20051002814
公开日2006年1月4日 申请日期2005年7月26日 优先权日2005年7月26日
发明者李兴玉, 陆颖, 丁焕平, 李静 申请人:上海师范大学