专利名称：利用hrm技术在非细胞体系中进行基因突变检测的方法
技术领域：
本发明涉及生物技术和医学领域，具体涉及肿瘤诊断中间信息相关的基因的快速 检测，以及对需求的检测样本的替代，通过检测非细胞体系的微量DNA实现基因的快速检 测。
背景技术：
高分辨熔解曲线分析技术(high-resolution melting analysis, HRM)是近年国 外兴起的一种全新的突变扫描和基因分型的遗传分析方法。基于高效稳健的PCR技术，HRM 不受突变碱基位点与类型局限，无需序列特异性探针，在PCR结束后直接运行高分辨熔解， 即可完成对样品突变、单核苷酸多态性-SNP、甲基化、HLA配型等的分析。HRM的主要原理 是根据DNA序列的长度，GC含量以及碱基互补性差异，应用高分辨率的熔解曲线对样品进 行分析，极高的温度均一性和温度分辨率使分辨精度达到对单个碱基差异的区分。HRM技术 对DNA样本的质量要求很高，所以常用于研究细胞体系的研究。HRM技术应用于基因突变检测依据于饱和性荧光染料的，根据荧光信号强度的微 妙变化来判断基因类别，故HRM技术有着很高的灵敏度和准确度。基因指导下个体化疗与个体化分子靶向治疗是近年兴起的一种肿瘤药物治疗选 择方式，目的是提高肿瘤药物治疗的精确性，减少预期无效的治疗。美国食品和药品管理局 (FDA)明确支持应用靶向药物前进行如EGFR、K-raS、B-raf等基因突变检测，以决定对应药 物是否有效，而先前欧洲药品管理局(EMEA)已经宣布了这个决定。作为世界上最权威和最 严格的药品审批机构，FDA这个决定无疑标志着“个性化治疗的时代”的来临。靶向治疗药物与基因信息相关性如下(1)《09年NCCN非小细胞肺癌临床实践指南》明确指出通常如EGFR 19外显子 和21外显子突变或缺失的患者对这些药物治疗有效，无突变者预后不良。《09年NCCN非小 细胞肺癌临床实践指南》明确指出当K-ras基因如果发生了突变，则不建议病人使用特罗 凯(Tarceva/Erlotinib)进行分子靶向治疗。NSCLC患者使用易瑞沙或特罗凯时，应同时检测EGFR和K_ras突变。(2)K_raS是公认的癌基因，参与表皮生长因子受体(EGFR)信号传导过程，与EGFR 抑制剂类靶向药物的疗效密切相关。《美国国立癌症综合网络(NCCN)结直肠癌临床实践指 南》明确指出一是所有转移性结直肠癌患者都应检测K-ras基因状态；二是只有K-ras野 生型患者才建议接受EGFR抑制剂如西妥昔单抗(Cetuximab)和帕尼单抗(panitumumab) 的治疗。(3)B-raf基因的突变检测可协助医生筛选西妥昔单抗(Cetuximab)和帕尼单抗 (panitumumab)等药物治疗的有效人群。建议B-raf野生型患者接受该类EGFR抑制剂的治疗。(4)其他相关基因等。为了提高肿瘤药物治疗的精准性，相关基因的检测成为了用药前的必检项目，以减少预期无效的治疗。由于以往技术的局限，对DNA序列信息的检测也存在一定的局限性， 所以对检测的样本需求也是存在一定的局限性。由于基因突变的比例在人体整个机体中是 微量的，只有在肿瘤组织中的突变比例较高，所以以往的样本需求肿瘤组织样本进行基因 的突变检测，而对于血浆，血清等非细胞体系中的游离DNA的检测是无法完成的。目前普遍应用的基因突变检测方法为限制小片段长度多态性分析法(RFIi^i)和 DNA直接测序法。RFLP法是将PCR与限制性酶切相结合的方法。但是该方法存在以下缺点 RFLP实验操作繁琐，检测周期长，成本高昂，以及存在第一轮酶切不完全导致的假阳性DNA直接测序的原理是DNA序列测定分手工测序和自动测序，手工测序包括 Sanger双脱氧链终止法和Maxam-Gilbert化学降解法。自动化测序可使用美国PE ABI公 司已生产出310型等DNA测序仪，ABI PRISM 310型基因分析仪(即DNA测序仪)，采用 毛细管电泳技术取代传统的聚丙烯酰胺平板电泳，应用该公司专利的四色荧光染料标记的 ddNTP (标记终止物法)，因此通过单引物PCR测序反应，生成的PCR产物则是相差1个碱基 的3 ’末端为4种不同荧光染料的单链DNA混合物，使得四种荧光染料的测序PCR产物可在 一根毛细管内电泳，从而避免了泳道间迁移率差异的影响，大大提高了测序的精确度。由于 分子大小不同，在毛细管电泳中的迁移率也不同，当其通过毛细管读数窗口段时，激光检测 器窗口中的CCD (charge-coupled device)摄影机检测器就可对荧光分子逐个进行检测，激 发的荧光经光栅分光，以区分代表不同碱基信息的不同颜色的荧光，并在CCD摄影机上同 步成像，分析软件可自动将不同荧光转变为DNA序列，从而达到DNA测序的目的。分析结果 能以凝胶电泳图谱、荧光吸收峰图或碱基排列顺序等多种形式输出。该方法存在以下缺点在于花费昂贵，对一些较大的，外显子较多的基因不宜用测 序法直接检测突变；另外不适用于临床对大量的标本进行检测。DNA直接测序也不能被当 成是突变检测的金标准，杂合突变、胶压缩、GC富集区的存在等问题使得很难通过一次测序 获得精确的数据。测序的方法不仅有以上的限制，而且测序需要一定的精度，对于微量突变时很难 检测出来的，所以该类方法对样本的要求很高，一般选择肿瘤组织DNA作为检测模板，对于 非细胞体系的游离DNA是无法检测的，在加上游离片段DNA的特殊状态，开始的PCR扩增都 有一定的难度。本发明由此而来。

发明内容
本发明的主要目的在于提供一种利用HRM技术在非细胞体系中进行基因突变检 测的方法，应用HRM技术检测非细胞体系中微量游离DNA，以放大基因检测的样本来源，实 现更加精确，灵敏的基因检测，解决了现有检测方法对于组织样本取样麻烦的现状。为了解决现有技术中的这些问题，本发明提供的技术方案是一种利用HRM技术在非细胞体系中进行基因突变检测的方法，其特征在于所述方 法包括以下步骤(1)设计并选取含有目的基因的靶向区域中至少15个连续的核苷酸构成连续核 苷酸序列的若干个引物对；(2)从非细胞体系中提取DNA，利用若干个预先筛选的引物对对目的基因靶向序 列进行特异性扩增；
(3)根据高分辨率熔解曲线法对扩增后的基因序列进行突变位点检测。优选的，所述非细胞体系选自外周血细胞、外周血血清或血浆、体液、腔道的脱落 物、病变新鲜组织、冰冻病变切片、石蜡病变切片。优选的，所述目的基因选自EGFR、KRAS, BRAF, C-KIT、PI3K 和 PDGFRA。优选的，所述特异性扩增在PCR反应体系中进行，所述PCR反应成分包括PCR缓冲 液、dNTPs、荧光染料、MgCl2, TaqDNA聚合酶、模板DNA和水，所述PCR反应体系终浓度组成 为PCR缓冲液 终浓度1 IOX ；dNTPs0. 1 ImM ；引物序列终浓度为0. 1 1 μ M ；模板 DNA0. 05 2ng/ μ L ；TaqDNA 聚合酶0. 01 0. IOU/ μ L ；MgCl2终浓度为 1 5mM ；荧光染料1 3X。优选的，所述PCR反应体系终浓度组成为PCR缓冲液 终浓度1 5X;dNTPs0. 1 0. 5mM ；引物序列 终浓度为0. 1 0. 5 μ M ；模板 DNA0. 05 1. 5ng/ μ L ；TaqDNA 聚合酶 0. 01 0. IOU/ μ L ；MgCl2终浓度为 1 3mM ；荧光染料1 2X。优选的，所述荧光染料选自DNA饱和性染料包括EvaGreen染料、LC Green PLUS 染料、ResoLight 染料、SYTO 9 染料；所述 dNTP 混合液包括 IOmM dATPUOmM dCTPUOmM dTTPUOmM dGTP的混合液；所述PCR缓冲液包括Tris · cl，氯化钾，硫酸铵，氯化镁；_20°C TpH 值在 8. 0-9.0 间。优选的，进行PCR扩增反应的条件为92 97°C预变性4 15min ；92 97°C变性 10 30s，50 65°C退火10 30s，70 75°C延伸10 30s，35-55个循环。优选的，所述高分辨率熔解曲线法的条件为92 97°C变性1分钟；40°C复性1 分钟；然后初始熔解温度60°C开始程序升温熔解至95°C，并在熔解过程中实时检测荧光信 号，30 50次每秒。优选的，所述方法中为集成程序化方法，进行PCR扩增反应的条件为95°C预变性 5min ；95°C变性10s，60°C退火15s，72°C延伸25s，50个循环；所述高分辨率熔解曲线法的 条件为95°C变性1分钟；40°C复性1分钟；然后初始熔解温度65°C开始程序升温熔解至 95°C，并在熔解过程中实时检测荧光信号，40次每秒。优选的，所述从非细胞体系中提取DNA选自使用QIAGEN Blood Mini kitt试剂盒 或TIANGEN Blood Mini kit试剂盒提取或使用传统酚氯仿法提取。所述基因检测方法具体包括以下步骤(1)设计并选取含有目的基因的靶向区域中至少15个连续的核苷酸构成连续核苷酸序列的若干个引物对；(2)按照设计原则和非细胞体系DNA质量情况筛选引物对，利用集成化体系反应 条件，从若干引物对中选出适合非细胞体系的最优引物对，以及相关的优化参数。(3)提取模板DNA，利用步骤⑵得到的引物对对模板DNA中靶向基因序列进行 PCR扩增；(4)根据高分辨率熔解曲线法对扩增后的基因序列进行突变位点检测。由于现有技术中进行肿瘤组织中DNA的检测需要相关癌症的检测样本，这给基因 的检测带来一定的限制；本发明提供肿瘤组织样品的替代品，以方便基因的相关检测。由于HRM技术应用于非细胞体系的出现，给样本的取样带来极大的方便，也便于 诊断过程的实时监控，结合HRM技术的精度，灵敏度，准确度以及方便快捷等优点，满足了 临床用药和检测诊断方面的时效性要求，为该类基因检测带来崭新的前景。本发明还提供了一种HRM基因分型技术在非细胞体系中基因突变检测的新型应 用，其特征在于其包括的特异性扩增目的基因靶向序列的若干个引物对，所述目的基因含 有EGFR，KRAS, BRAF, C-KIT，PI3K和PDGFRA等，所述引物对为目的基因靶向区域至少15个 连续的核苷酸构成的连续核苷酸序列。严格控制摸索的PCR反应条件，所述扩增条件包括 非细胞体系的DNA提取，加样的试剂成分，各个成分的反应浓度以及PCR上机扩增和熔解的 温度条件。所述PCR反应成分包括PCR缓冲液、dNTPs、荧光染料、MgC12、TaqDNA聚合酶、模板 DNA和水，所述PCR反应体系终浓度组成可以为PCR缓冲液 终浓度1 5X;dNTPs0. 1 ImM ；引物序列 终浓度为0. 1 1 μ M ；模板 DNA 0. 05 2ng/ μ L ；TaqDNA 聚合酶 0. 01 0. IOU/ μ L ；MgCl2终浓度为 1 5mM ；荧光染料 1 3X。 所述的模板DNA从选自外周血细胞、外周血血清或血浆、体液、腔道的脱落物、病 变新鲜组织、冰冻病变切片、石蜡病变切片中提取。非细胞体系的DNA提取选自以下方法
QIAGEN BloodTIANGEN Blood传统Mini kittMini kit酚氯仿法较为优选的，所选DNA提取方法如下QIAGEN Blood Mini kit。所述PCR扩增条件选自以下条件范围
过程温度时间循环数cycles预变性92-97 0C4-15 min1PCR92-97 0C10-30 s50-65 0C10-30 s35-5570-75 0C10-30 sHRM95-97 0Cl_2min40 0Cl_2min50-65 °CIs195-97 0C每秒检测荧光 30-50 次冷却40 0C10-30 s1 更优选的所选扩增条件选自以下条件
过程温度时间循环数cycles预变性95。C5min1PCR95 0C10 s60 0C15s5072 0C25sHRM95 °CImin40 0CImin165 0CIs95 0C每秒检测荧光40次冷却40 0CIOs1本发明在原有样本检测基础上进行改变，运用精细参数设置完成对样本的替换， 其所述非细胞体系包括血清，血浆，尿液，体液，羊水，粪便等。优选的，检测的DNA是微量的 游离DNA。相对于现有技术中的方案，本发明的优点是在HRM技术优势的基础上，通过调整参数使其技术可以应用于非细胞体 系上，进行基因的突变检测。新型突变研究技术——高分辨率熔点曲线分析(High ResolutionMelting Analysis, HRM)，无需序列特异性探针，无需测序，也不受突变碱基位 点与类型的局限，应用带HRM模块的荧光定量PCR仪分析，参照阴性对照，即可完成对样品 基因型的判断，完成微量游离DNA的检测。高灵敏度和准确度是HRM技术的优点，应用于非 细胞体系是对该技术的更深的诠释。本发明应用是HRM技术运用于非细胞体系的新型应用及检查方法阐述，其特征是 在原有的技术基础上进行技术优化，实施应用于非细胞体系，并达到优质的实验结果，对样 本进行准确的实验研究。非细胞体系主要就是针对血浆，血清，体液，尿液等，其内容包含 若干基因的若干个引物对，通过HRM技术无需序列特异性探针，无需测序，也不受突变碱基 位点与类型的局限，即可完成对样品基因型的判断，因此对于非细胞体系的应用技术研究 对相关疾病的检测及治疗提供了更加广泛的可选样本，并显著的降低了对病人的侵袭性伤 害。因此为这类的研究应用提供很大方便。


下面结合附图及实施例对本发明作进一步描述图1为本发明实施例不同片段大小的引物进行PCR扩增得到的电泳图；图2为本发明实施例进行引物验证得到的电泳图；图3为本发明实施例阴性对照DNA的测序图；图4为本发明实施例肿瘤组织DNA的电泳图；图5为本发明实施例石蜡组织DNA的电泳图；图6为本发明实施例血浆、血清DNA扩增产物的电泳图；图7为本发明实施例不同活性的酶进行PCR扩增的电泳图；图8为本发明实施例不同荧光染料进行HRM的溶解曲线图；图9为本发明实施例不同MgCl2终浓度进行PCR-HRM的溶解曲线图和荧光循环次 数曲线；图9A为KRAS-EX0N2的荧光次数优化曲线；图9B为KRAS-EX0N2的溶解曲线；图9C 为KRAS-EX0N3的溶解曲线；图9D为KRAS-EX0N3的荧光次数优化曲线；图10为本发明实施例不同MgCl2终浓度进行PCR条件优化时得到的PCR产物电 泳图；所述图9、10以BRAF基因为例；图11为本发明实施例不同标本DNA模板进行检测的溶解曲线图；图IlA E分别 为外周血血浆、口腔、组织、石蜡切片、外周血血清的溶解曲线图；图12为本发明实施例不同突变率的灵敏度实验的熔解曲线分型图；图13为本发明实施例大样本进行准确度验证的熔解曲线分型图；图14为本发明应用例正常人血液标本模板DNA进行扩增后检测的溶解曲线图；图15为本发明应用例结肠患者血液标本模板DNA进行扩增后检测的溶解曲线 图；图16为本发明应用例结肠患者石蜡切片模板DNA进行扩增后检测的溶解曲线图。图17为本发明应用例结肠患者血清标本模板DNA进行扩增后检测的溶解曲线图。
具体实施例方式以下结合具体实施例对上述方案做进一步说明。应理解，这些实施例是用于说明 本发明而不限于限制本发明的范围。实施例中采用的实施条件可以根据具体厂家的条件做 进一步调整，未注明的实施条件通常为常规实验中的条件。本发明提供一种HRM基因分型技术在非细胞体系中基因突变检测的新型应用，包 括特异性扩增目的基因靶向序列的若干个引物对，所述目的基因含有EGFR，KRAS, BRAF, C-KIT，PI3K和PDGFRA等，所述引物对为目的基因靶向区域至少15个连续的核苷酸构成的 连续核苷酸序列。以KRAS基因为例，其序列如SEQ ID No :23所示，本发明采用的引物对含 有KRAS基因的第二外显子KRAS2或第三外显子KRAS3中至少15个连续的核苷酸构成的连 续核苷酸序列，所述KRAS2具有SEQ ID No 1的连续核苷酸序列；所述KRAS3具有SEQ ID No :2的连续核苷酸序列。优选的引物为SEQ IDNo :3 22序列之一的正向引物或反向引 物。本发明的方法先进行PCR扩增，然后对扩增产物进行HRM检测突变点；本发明的 PCR引物，为化学合成或PCR扩增获得的突变位点两端5-23个序列的模板，以及与之配对的反向序列，可以是下表序列
1Forward primers:SEQ ID No3Reverse primers:SEQ ID No42Forward primers:SEQ ID No5Reverse primers:SEQ ID No63Forward primers:SEQ ID No7Reverse primers:SEQ ID No84Forward primers:SEQ ID No9Reverse primers:SEQ ID No105Forward primers:SEQ ID No11Reverse primers:SEQ ID No126Forward primers:SEQ ID No13Reverse primers:SEQ ID No14 更为优选的，可以是下表序列
外显子引物引物序列KRAS2(KRAS -EX0N2)Forward primersSEQ ID No 15；Reverse primersSEQ ID No 16；KRAS3(KRAS -EX0N3)Forward primersSEQ ID No 17；Reverse primersSEQ ID No 18。所述的PCR反应体系，包括PCR缓冲液、dNTP混合液、荧光染料、MgCl2, Taq酶、 DNA模板。所述的PCR缓冲液，包括三羟甲基氨基甲烷盐(Tris化1)，氯化钾，硫酸铵，氯化 镁；酸碱度(ρΗ值)8. 0-9. 0 (200C )。所述的PCR缓冲液，，包括IOx缓冲液，终浓度15mM的 氯化镁，终 PH 8.7。所述的 dNTP 混合液，包括 IOmMdATPUOmM dCTPUOmM dTTPUOmM dGTP 的混合液。所述的荧光染料，包括EvaGreen饱和性染料、LC Green染料、ResoLight染料、 SYTO 9 染料。所述的 MgCl2 为 10-30mM MgCl2。所述的 MgCl2 为 25mM MgCl2。所述的Taq酶，包括浓度5units/ul，反应底物为dNTP，ddNTP,延伸速率2_4kb/ min at 72 °C，存储缓冲液 10_40mM Tris · cl，50_200mM 氯化钾(KCL)，0-5. OmM 二硫苏 糖醇(DTT)，0-1.0mM乙二胺四乙酸二钠钙(EDTA)，0-2. O % (V/V)乙基苯基聚乙二醇 (Nonidet) P-40,0-2. O % (V/V)吐温 20 (Tween 20) ,30-70% (ν/ν)甘油(glycerol)，稳定 剂(stabilizer) :pH 7. 0-10. 0(20°C )所述的存储缓冲液，包括终浓度为20mM Tris · cl、IOOmM KCLUmM DTT、0. ImM EDTA.O. 5% (V/V)Nonidet P-40,0. 5% (V/V)Tween 20,50% glycerol (v/v) 稳定剂的终 pH值为9.0。所述的DNA模板，用常规方法从患者组织中提取获得的DNA。所述的患者组织，包括外周血细胞、外周血血清或血浆、体液、腔道的脱落物、粪 便、病变组织、肿瘤组织，以及用这些组织制成的石蜡块、石蜡切片、冰冻切片等，本技术应 用主要放大了样本的选择范围，对于上述样本中非细胞体系的游离DNA也是可以检测的， 所述非细胞体系含有血浆、血清、体液、尿液、腔道的脱落物、粪便等样本。在进行检测时按以下程序进行PCR扩增以及熔解曲线分析
过程温度时间循环数cycles预变性95 °C5min1PCR95 0CIOs60 0C15s5072。C25sHRM95 0CImin40 0CImin165 0CIs95 °C每秒检测荧光40次冷却40 0CIOs1根据本发明所述的反应条件，在荧光定量PCR仪上进行序列扩增，然后分析数据， 运行溶解曲线观察是否单峰，再运行Genescan自动分析程序，得到分型的图谱。所述的荧 光定量PCR仪，包括LightCyeler 480 (罗氏公司，巴塞尔，瑞士)、ABI 7500 FAST (美国应 用生物系统公司，纽约，美国)、ABI 7900 HT FAST(美国应用生物系统公司，纽约，美国)、 Qiagen Rotor-Gene 6000 (德国 Qiagen 公司，杜塞尔多夫，德国)、IdahoLightScanner (美 国Idaho公司，爱达荷州，美国)。在使用时，将待测样本稀释到同一浓度，同时放入阴性对 照，加入MIX，进行PCR反应，即可区分野生型与突变型。本发明应用对样本进行检测可以提供肿瘤诊断的中间信息，所述的肿瘤，包括结 肠癌、胃癌、头颈癌、非小细胞肺癌患者、胰腺癌、皮肤癌、肉瘤、骨肉瘤、血癌(即白血病)、 淋巴癌、腺癌、脑瘤、视网膜母细胞瘤、鼻腔有鼻癌、鼻窦癌、口腔有舌癌、牙龈癌、甲状腺癌、 肺癌、肝癌、食道癌、上皮细胞癌、肉瘤、腺癌、淋巴细胞癌。以下对本发明的一些专用术语进行解释说明在本发明应用中，术语“引物”是指一种寡核苷酸，可以是天然的也可以是合成，它 可以作为在一定条件下诱发DNA合成的起始点，在上述条件下可以诱发合成与核酸链相互 补的引物扩增产物，即在四种不同的三磷酸脱氧核糖核酸及一种聚合试剂(即DNA聚合酶 或逆转录酶)存在下，在一种合适的缓冲液并在合适的温度下进行上述合成。优选的引物 是单股寡脱氧核糖核苷酸。引物的合适长度取决于该引物的设计用途，但在一般在15 25 个核苷酸之间，较短的引物分子通常需要较低的温度，从而与模板形成充分稳定的杂交复 合物。引物不必反应模板的准确序列，但必须充分互补，已与模板杂交并引发DNA合成。引物设计一般遵循以下原则①引物应用核酸系列保守区内设计并具有特异性。 ②产物不能形成二级结构。③引物长度一般在15 30碱基之间。④G+C含量在40% 60%之间。⑤碱基要随机分布。⑥引物自身不能有连续4个碱基的互补。⑦引物之间不能 有连续4个碱基的互补。⑧引物5'端可以修饰。⑨引物3'端不可修饰。⑩引物3'端要 避开密码子的第3位。进行引物设计的软件有Primer 5，BeaconDesigner 7。本发明引物进行筛选，确定引物片段大小，最后确定最佳引物为18-28bp大小的 引物。本发明的引物采用亚磷酰胺三酯法进行合成；其原理是将DNA固定在固相载体上完 成DNA链的合成的，合成的方向是由待合成引物的3'端向5'端合成的，相邻的核苷酸通 过3' -5'磷酸二酯键连接。具体包括以下步骤1、将预先连接在固相载体CPG上的活性基团被保护的核苷酸与三氯乙酸反应，脱 去其5'-羟基的保护基团DMT，获得游离的5'-羟基。
2、合成DNA的原料，亚磷酰胺保护核苷酸单体，与活化剂四氮唑混合，得到核苷亚 磷酸活化中间体，它的3'端被活化，5'-羟基仍然被DMT保护，与溶液中游离的5'-羟 基发生缩合反应。3、带帽(capping)反应，缩合反应中可能有极少数5 ‘-羟基没有参加反应(少于 2% )，用乙酸酐和1-甲基咪唑终止其后继续发生反应，这种短片段可以在纯化时分离掉。4、在氧化剂碘的作用下，亚磷酰形式转变为更稳定的磷酸三酯。经过以上四个步骤，一个脱氧核苷酸被连接到固相载体的核苷酸上。再以三氯乙 酸脱去它的5'-羟基上的保护基团DMT，重复以上步骤，直到所有要求合成的碱基被接上 去。最后通过氨水高温处理，连接在CPG上的引物被切下来，通过OPC，PAGE等手段纯化引 物。实施例1引物的验证及筛选，以KRAS为例按照KRAS基因第二外显子和第三外显子的序列，进行引物设计。对引物的不同序 列长度进行扩增比较，筛选特异性好的引物。引物片段大小的引物进行PCR扩增的特异性 结果如下表和图1所示表1引物片段大小的引物进行PCR扩增的特异性结果
引物大 小(bp)5-913-1618-2324-2830-3739-45特异性特异性很 差特异性差特异性好特异性较 好特异性差特异性 很差 根据上表和图1所示，最后确定最佳引物为18_28bp大小的引物引物由上海英潍捷基(Invtrogen)公司按照亚磷酰胺三酯法负责合成。采用聚丙 烯酰胺凝胶电泳法进行引物验证，得到电泳图如图2所示。图2a为获得的Kras-eX0n2-F 电泳图；图2b为获得的Kras-exon2-R电泳图；图2c为获得的Kras-exon3_F电泳图；图2d 为获得的Kras-exon3-R电泳图。实施例2阴性对照DNA的提取采样1、抽取正常人外周血2.5ml于枸橼酸钠(1 9)抗凝管中。2、抗凝管中的血8000rpm离心5分钟，分离血浆和细胞。3、血浆小心移入另一无菌管子，注意不要吸到白细胞，-20度保存(1周)。DNA的提取按照如下步骤进行取正常人的混勻的抗凝全血2ml，然后使用 TIANamp Genomic DNA Kit(TIANGEN BIOTECH CO. ,LTD)基因组 DNA 提取试剂盒，按照试剂 盒操作说明，提取DNA。使用Nano 1000定量仪定量，测定DNA浓度。阴性对照DNA符合以下条件时可以视为合格1、符合OD值A260/A230 2. 0-2. 2 ； A260/A280 1.8-2.0之间；2、电泳条带主条带清晰(上样6ul，1. 0%琼脂糖凝胶，120V电 压，25分钟)；3、测序鉴定KRAS基因外显子2、3无任何异常突变存在。测序结果如图3所
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实施例3肿瘤组织DNA的提取样本采集按照如下步骤进行取新鲜组织块50 IOOmg以PBS或生理盐水清洗干 净，所用组织必须切至厚度在0. 5cm以下，放入装有1. 5ml体积RNAlater的冻存管中，充分 混勻(30分钟内完成)。室温下放置1-2小时，4°C冰箱过夜，第二天转至-20°C长期保存。DNA 提取按照如下步骤进行使用 TIANamp Genomic DNA Kit (TIANGENBIOTECH CO.，LTD)基因组DNA提取试剂盒，按照试剂盒操作说明，提取DNA。然后进行DNA纯化、检 测。若提取的DNA, OD值不在A260/A230 2. 0-2. 2 ；A260/A280 1. 8-2. 0，标准范围内，则需 要进行DNA纯化步骤。DNA纯化按照如下进行加入等体积的氯仿-异戊醇(25 1)，向下翻转离心管 5min以充分混勻，13000rpm离心IOmin小心吸出上清液至另一 1. 5ml离心管；加入1/10体 积的醋酸钠(PH5. 2，3M)，再加入两倍上清液体积的无水乙醇，轻轻摇勻，沉淀DNA13000rpm 离心3min，轻轻倒去上清液，加入70 %乙醇洗一次，13000rpm,离心3min，去上清液，倒置 5-10min (倒置时间视DNA块状沉淀大小以及DNA干燥的速度决定，注意DNA不可太干燥，否 则DNA将难以被溶解，但离心管管壁的乙醇一定要除去)；加入30-60ul消毒三蒸水，用吸 管吹打使DNA充分溶解。对提取的DNA进行检测时，需测定所提取的DNA在A260/280/230上的吸光度，符 合OD值A260/A230 2. 0-2. 2 ；A260/A280 1. 8-2. 0之间。其步骤可以是将提取的DNA稀 释到lOng/ul ；电泳鉴定主条带清晰(上样6ul，1. 0%琼脂糖凝胶，120V电压，25分钟)电 泳图如图4所示若符合以上条件，将DNA-20°C保存，留待作为PCR反应的模板DNA。实施例4血液中血浆DNA的提取先进行血液采样，抽取病人外周血2.5ml于枸橼酸纳(1 9)抗凝管中。抗凝管 中的血SOOOrpm离心5分钟，分离血浆和细胞。血浆小心移入另一无菌管子，注意不要吸到 白细胞，"20度保存(1周)，管身标示病人名字和编号，注明日期即可。然后进行DNA提取，可以按照如下步骤将抗凝血8000rpm离心5min，吸出上层的 血浆，用Blood Mini kit试剂盒(德国QIAGEN公司生产)进行血液的提取，提取步骤参见 试剂盒的说明书进行，其他涉及产品同样处理，提取的DNA-20。C保存。实施例5血液中血清DNA的提取抽取病人外周血l_2ml至无抗凝的收集管，8000rpm离心5分钟，吸取血清移入另 一无菌管子，注意不要吸到白细胞，"20度保存(1周)，管身标示病人名字和编号，注明日期 即可。然后进行DNA提取，可以按照如下步骤血清用Blood Mini kit试剂盒(德国 QIAGEN公司生产)进行血液的提取，提取步骤参见试剂盒的说明书进行，其他涉及产品同 样处理，提取的DNA-20 V保存。实施例6石蜡切片组织DNA的提取刮削5-10 μ m厚的切片1-5片(如果标本已暴露空气中，弃去最初的2_3层)。用 二甲苯脱蜡后用QIAamp DNA FFPE Tissue kit (德国QIAGEN公司生产)，按照试剂盒的操 作说明提取DNA，其他涉及产品同样处理，提取的DNA-20°C保存，石蜡DNA电泳图如图5所
7J\ ο实施例7血浆、血清PCR扩增预实验
利用例4、5提取的血浆、血清DNA进行PCR预实验，按实施例7摸好的实验条件进 行实验，产物电泳图如图6所示。实施例8PCR和HRM条件的优化，以BRAF基因为例1)酶的选择确定用不同厂家的酶进行实验比较，选择活性比较高的酶。本发明实验后其酶活 性如下表和图7所示，图7中1、2、3、4分别为HotStarTaq酶、FastStartTaq酶、Taq CE DNAPolymerase、KAPA2G快速热启动DNA聚合酶的酶活性检测结果图，，最终确定 HotStarTaq酶和FastStartTaq酶的活性最高。
FastStartTaq g| ②
活性好
Taq CE DNA Polymerase ③ 活性较好
KAPA2G快速热启
动DNA聚合酶④ 活性较差
酶的类 HotStarTaq酶 型①
活性 活性好 2)荧光染料选择的确定
本发明人通过用不同厂家的酶进行实验，选择结合效果好的染料，这些荧光染料 的实验结果如下表和图8所示，图8中Green染料；2为LC Green ;3为SYBRGreen ； 4为DAPI ；5为Flamingo ；最后确定使用的最佳染料为Eva Green和LC Green。

荧光染料 Eva Green① LC Green②
结合效果 结合效果好
结合效果好
SYBRGreen
③
结合效果不 好，且会抑制
PCR反应
DAPI ④
Flamingo
⑤
结合效果不好结合效果不好
3) PCR条件的确定(以BRAF为例)
PCR条件优化在退火温度、MgCl2浓度两方面进行调整和优化，其中分别对 BRAF-463和BRAF-1799的PCR条件进行摸索和优化，确定PCR最佳条件为退火温度为60°C， MgCl2终浓度为2. 5Mm。PCR条件优化试验的结果如下PCR条件MgCL-终浓度
l.OmM1. 5mM2. OmM2. 5mM3. OmM3. 5Mm
退火驢55°C无扩增有非特有非特有非特有非特有非特
异性条异性条异性条异性条异性条
带带带带带
58°C无扩增二聚体二聚体二聚体二聚体二聚体
产生产生产生产生产生
60°C无扩增扩增效扩增正扩增正二聚体二聚体
率低常常产生产生 如图9和图10所示为进行PCR条件优化筛选时的溶解曲线图和PCR产物电泳 图。图9A为KRAS-EX0N2的荧光次数优化曲线；图9B为KRAS-EX0N2的溶解曲线；图9C为 KRAS-EX0N3的溶解曲线；图9D为KRAS-EX0N3的荧光次数优化曲线，图10为进行PCR条件 优化筛选时的PCR产物电泳图。其中箭头1、2分别对应KRAS-EX0N2、3PCR产物电泳结果。
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4) HRM条件的确定HRM条件的优化主要在溶解的起始温度、每秒钟监测荧光的次数两方面进行优化 调整。起始温度选择60°C、65°C、70°C三个条件，检测荧光次数(次)选择10、40、100次/ 秒三种。其结果如下
HRM条件检测荧光次数(次)1040100起始溶解温度 (0C)60无法分型结果较好曲线不平滑65无法分型结果较好曲线不平滑70无法分型染料结合不 充分，起始 荧光值低曲线不平滑 最后确定的最佳条件是
温度时间95 0CIminHRM条件40 0CImin65 Is95 0C每秒检测荧光40次5) DNA模板的确定分别从外周血、口腔拭子、组织、石蜡切片等样本中进行检测模板DNA，经实验证 实外周血(血清、血浆)、口腔拭子、组织、石蜡切片中的DNA均可检测，差异性不大。实验 结果如图11所示，图IlA E分别为外周血血浆、口腔、组织、石蜡切片、外周血血清的检测
结果，樹反IM来源夕卜周血(血菜)夕卜周血(血清)口腔拭子组织 石撒刀片检测效果 可以检测 可以检测 可以检测可以检测可以检测实施例9灵敏度实验通过在野生型样本中参入突变型样本，按以下比例进行参入，野生型突变型 100 OUOO UlOO 5,100 IOUOO 15。利用上面优化的条件进行检测PCR反应体系
反应体系组分加入的体积(UL)10XPCR Buffer (含 MgCl2)2. 0MgCl20. 4dNTP0. 5Eva-green1. 0IOum Primers1. 0
权利要求
一种利用HRM技术在非细胞体系中进行基因突变检测的方法，其特征在于所述方法包括以下步骤(1)设计并选取含有目的基因的靶向区域中至少15个连续的核苷酸构成连续核苷酸序列的若干个引物对；(2)从非细胞体系中提取DNA，利用若干个预先筛选的引物对对目的基因靶向序列进行特异性扩增；(3)根据高分辨率熔解曲线法对扩增后的基因序列进行突变位点检测。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述非细胞体系选自外周血细胞、外周血 血清或血浆、体液、腔道的脱落物、病变新鲜组织、冰冻病变切片、石蜡病变切片。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述目的基因选自EGFR、KRAS、BRAF, C-KIT、P13K 禾口 PDGFRA。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述特异性扩增在PCR反应体系中进行，所 述PCR反应成分包括PCR缓冲液、dNTPs、荧光染料、MgCl2, TaqDNA聚合酶、模板DNA和水， 所述PCR反应体系终浓度组成为PCR缓冲液 dNTPs 引物序列 模板DNA TaqDNA聚合酶 MgCl2 荧光染料终浓度1 IOX ； 0. 1 ImM ； 终浓度为0. 1 1 μ M ； 0. 05 2ng/ μ L ； 0. 01 0. IOU/ μ L ； 终浓度为1 5mM ； 1 3X。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于所述PCR反应体系终浓度组成为 PCR缓冲液终浓度1 5X;dNTPs0. 1 0. 5mM ；引物序列终浓度为0. 1 0. 5 μ M ；模板 DNA0. 05 1. 5ng/ μ L ；TaqDNA 聚合酶0. 01 0. IOU/ μ L ；MgCl2终浓度为1 3mM ；荧光染料1 2X。
6.根据权利要求4或5所述的方法，其特征在于所述荧光染料选自DNA饱和性染料包 括EvaGreen染料、LC Green PLUS染料、ResoLight染料、SYTO 9染料；所述dNTP混合液 包括 IOmM dATPUOmM dCTP、IOmMdTTP、IOmM dGTP 的混合液；所述PCR缓冲液包括Tris *cl， 氯化钾，硫酸铵，氯化镁；_20°C下pH值在8. 0-9. O间。
7.根据权利要求4所述的方法，其特征在于进行PCR扩增反应的条件为92 97°C预 变性4 15min ；92 97°C变性10 30s，50 65°C退火10 30s，70 75°C延伸10 30s, 35-55 个循环。
8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述高分辨率熔解曲线法的条件为92 97°C变性1分钟；40°C复性1分钟；然后初始熔解温度60 65°C开始程序升温熔解至 95°C，并在熔解过程中实时检测荧光信号，30 50次每秒。
9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述方法中为集成程序化方法，进行PCR扩 增反应的条件为95°C预变性5min ；95°C变性10s，60°C退火15s，72°C延伸25s，50个循环； 所述高分辨率熔解曲线法的条件为95°C变性1分钟；40°C复性1分钟；然后初始熔解温度 65°C开始程序升温熔解至95°C，并在熔解过程中实时检测荧光信号，40次每秒。
10.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述从非细胞体系中提取DNA选自使用 QIAGEN Blood Mini kitt试剂盒或TIANGEN Blood Mini kit试剂盒提取或使用传统酚氯 仿法提取。
全文摘要
本发明公开了一种利用HRM技术在非细胞体系中进行基因突变检测的方法，其特征在于所述方法包括以下步骤(1)设计并选取含有目的基因的靶向区域中至少15个连续的核苷酸构成连续核苷酸序列的若干个引物对；(2)从非细胞体系中提取DNA，利用若干个预先筛选的引物对对目的基因靶向序列进行特异性扩增；(3)根据高分辨率熔解曲线法对扩增后的基因序列进行突变位点检测。该方法对于非细胞体系的应用技术研究对相关疾病的检测及治疗提供了更加广泛的可选样本，并显著的降低了对病人的侵袭性伤害。
文档编号G01N21/64GK101955990SQ20101013422
公开日2011年1月26日 申请日期2010年3月29日 优先权日2010年3月29日
发明者时凯, 王弢, 秦勇, 陈菲 申请人:苏州工业园区为真生物医药科技有限公司