专利名称：生物体液中丹酚酸b浓度测定样品的预处理方法
技术领域：
本发明涉及中药的药物代谢动力学研究领域，尤其涉及丹酚酸B及含丹酚酸B中药的药物代谢动力学研究领域，特别是生物体液中丹酚酸B浓度测定样品的预处理方法。
背景技术：
丹参是最常用的中药材之一，研究结果表明，起活血化瘀作用的主要是水溶性成分，而丹酚酸B是水溶性成分中含量最高、活血化瘀活性最强的一种。国家药典委员会于2002年3月将丹酚酸B定为丹参片的质控指标，进一步，丹酚酸B可能会成为丹参制剂的质控指标。
药理研究表明丹酚酸B具有治疗心脑血管疾病、肝病及病毒性疾病和肿瘤等，处于新药研发阶段。
到目前为止，有关含丹酚酸B生物体液样品预处理方法研究仅见1篇报道，如hang J，Yu H，Sheng Y，et al.HPLC determination and pharmacokinetic studiesof salvianolic acid B in rat plasma after oral administration of Radix SalviaeMiltiorrhizae extract.Biomed Chromatogr 2005；19(1)15-8。但该研究中采用的是传统的液-液萃取方法进行样品预处理，其先用10％盐酸将血浆调至pH 2，再用乙酸乙酯萃取3次，使浓度测定方法的灵敏度较低，并且研究结果反映的丹酚酸B药代动力学规律具有偏面性。因此，对于丹酚酸B及丹参制剂中丹酚酸B在体内的药代动力学规律的认识不足，无法为丹酚酸B新药研制及指导临床合理用药提供依据。
另外由于丹酚酸B为水溶性成分，样品中浓度较低时，传统的液-液萃取方法难以充分将样品中的丹酚酸B萃取出来。因此，现有技术采用的方法，检测的灵敏度低，在药代动力学研究中无法检测到低浓度时的血药浓度。
因此由于丹酚酸B化学性质的特殊性，如果采用的预处理方法不合适，会使浓度测定方法的灵敏度不足。

发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种生物体液中丹酚酸B浓度测定样品的预处理方法，采用新的样品预处理方法后，使生物体液中丹酚酸B浓度测定方法更加灵敏，可用于丹酚酸B的药代动力学研究，有助于全面阐明丹酚酸B的药代动力学规律。
本发明解决的技术问题可以通过以下技术方案来实现。
一种生物体液中丹酚酸B浓度测定样品的预处理方法，其特征在于将含有丹酚酸B浓度的生物样品加入已用甲醇和水活化后的Waters Oasis HLB小柱，经淋洗和洗脱后，洗脱液挥干富集，用流动相复溶后即可用高效液相色谱法进行检测；其中淋洗条件为水和甲醇，洗脱条件为氨水甲醇。
本发明采用高效液相色谱法的色谱条件为分析柱为ThermoHypersil-Keystone ODS Hypersil C18柱，流动相为1％三氟乙酸∶甲醇∶乙腈，流速为1ml·min-1，柱温为30℃，检测波长为315nm。
本发明采用固相萃取技术对含有丹酚酸B浓度的生物样品进行预处理，处理的含有丹酚酸B浓度的生物样品，比现有的方法处理的含有丹酚酸B浓度的生物样品，其丹酚酸B浓度的最低定量限低300多倍，灵敏度明显提高；本发明的准确度103.7％、日内精密度12.6％、日间精密度13.0％，符合生物样品分析的要求，可灵敏地测定生物体液中丹酚酸B浓度，适合用于丹酚酸B药代动力学研究。
下表为本发明与上述文献在线性范围和最低定量限的比较

具体实施方式
一种生物体液中丹酚酸B浓度测定样品的预处理方法，是将含有丹酚酸B浓度的生物样品(包括血浆、尿、组织匀浆上清液等)先加2.17mol/L磷酸混匀后，生物样品与磷酸之间的体积比为1∶2-3；再加入已用甲醇和水活化后的Waters Oasis HLB小柱，经淋洗和洗脱后，洗脱液在25℃条件下挥干富集，用1％三氟乙酸∶甲醇∶乙腈(70∶10∶20，v∶v∶v)的流动相复溶后即可用高效液相色谱法(色谱条件为分析柱为Thermo Hypersil-Keystone ODSHypersil C18柱，流动相为1％三氟乙酸∶甲醇∶乙腈(70∶10∶20，v∶v∶v)，流速为1m1·min-1，柱温为30℃，检测波长为315nm)进行检测；其中淋洗条件为第一步用水，第二步用80-100％甲醇，洗脱条件为0.2-1％氨水甲醇。
测定结果标准曲线在丹酚酸B血浆浓度0.035-1.400μg/ml范围内，y＝-2.5906+261.499x，r＝0.9992，最低定量限为0.035μg/ml。在丹酚酸B血浆浓度0.035、0.140、1.400μg/ml，准确度分别为106.7％、95.3％、109.1％，日内精密度10.9％、14.9％、11.9％，日间精密度9.8％、14.7％、14.5％。
权利要求
1.一种生物体液中丹酚酸B浓度测定样品的预处理方法，其特征在于将含有丹酚酸B浓度的生物样品加入活化后的Waters Oasis HLB小柱，经淋洗和洗脱后，洗脱液挥干富集，用流动相复溶后即可用高效液相色谱法进行检测；其中淋洗条件为水和甲醇，洗脱条件为氨水甲醇。
2.根据权利要求1所述的预处理方法，其特征在于所述Waters Oasis HLB小柱用甲醇和水进行活化。
3.根据权利要求1所述的预处理方法，其特征在于含有丹酚酸B浓度的生物样品在加入活化后的Waters Oasis HLB小柱前先加入2.17mol/L磷酸混匀后，生物样品与磷酸之间的体积比为1∶2-3。
4.根据权利要求3所述的预处理方法，其特征在于生物样品与磷酸之间的体积比为1∶2.5。
5.根据权利要求1所述的预处理方法，其特征在于所述流动相为1％三氟乙酸∶甲醇∶乙腈，三者之间的体积比为70∶10∶20。
6.根据权利要求1所述的预处理方法，其特征在于淋洗条件为水和甲醇，洗脱条件为氨水甲醇。
7.根据权利要求6所述的预处理方法，其特征在于淋洗条件为第一步用水，第二步用80-100％甲醇，洗脱条件为0.2-1％氨水甲醇。
全文摘要
本发明公开的一种生物体液中丹酚酸B浓度测定样品的预处理方法，其特征在于将含有丹酚酸B浓度的生物样品加入用甲醇和水活化后的Waters Oasis HLB小柱，经淋洗和洗脱后，洗脱液挥干富集，用1％三氟乙酸∶甲醇∶乙腈流动相复溶后即可用高效液相色谱法进行检测；其中淋洗条件为水和甲醇，洗脱条件为氨水甲醇。本发明采用固相萃取技术对含有丹酚酸B浓度的生物样品进行预处理，处理的含有丹酚酸B浓度的生物样品，比现有的方法处理的含有丹酚酸B浓度的生物样品，其丹酚酸B浓度的最低定量限低300多倍，灵敏度明显提高；符合生物样品分析的要求，可灵敏地测定生物体液中丹酚酸B浓度，适合用于丹酚酸B药代动力学研究。
文档编号G01N30/02GK1959409SQ200510030939
公开日2007年5月9日 申请日期2005年11月1日 优先权日2005年11月1日
发明者马越鸣, 王天明 申请人:上海中医药大学