专利名称：一种花生籽仁的石蜡切片方法
一种花生籽仁的石蜡切片方法技术领域：
本发明涉及石蜡切片技术领域，具体地说，是一种花生籽仁的石蜡切片方法。背景技术：
花生籽仁是花生收获的主要目标产物，决定着花生产量和品质的形成，但花生籽仁在生长过程中容易受到黄曲霉等病菌的侵染。研究表明，花生种皮的低渗透性、强韧性及耐破损等特征使花生对病害、虫害具被动抵制作用，因此花生种皮的完整性、强度对花生抗黄曲霉侵染等具有重要的屏障作用。
花生种皮结构是评价花生种质抗、感黄曲霉侵染能力的重要指标，普通显微观察表明抗病品种的种皮结构存在较大差异，抗病品种的种皮细胞壁较厚，表皮细胞间结合紧密，栅栏细胞层严密厚实，裂缝和气孔较少；感病品种的种皮细胞壁则相对较薄，细胞间结合较疏松，裂缝和气孔较大，种皮具有较厚蜡质层。但是由于花生籽仁油分和蛋白质含量高，制作普通切片时，存在粘刀、薄厚不均、不连续或不完整等问题，很难得到理想的切片。
石蜡切片法由于操作简单、价格低廉、可连续制片等特点，一直是观察细胞组织的形态结构及其动态变化的理想生物学研究技术。石蜡切片制作过程包括固定、脱水、透明、 透蜡、包埋、切片、贴片、脱蜡、染色、透明以及封片等步骤，在生物学的许多领域都得到了广泛的应用。但是由于花生籽仁油分和蛋白质含量非常高，其石蜡切片的效果一直不尽人意。
因此为便于观察花生细胞组织结构及动态变化，深入分析黄曲霉侵染花生的细胞学机理，明确抗、感黄曲霉花生种质的细胞学差异，筛选抗黄曲霉花生种质用于生产实践， 亟需一种可获得理想切片的花生籽仁的石蜡切片方法，但是目前关于这类该切片方法尚未见报道。
发明内容
本发明的目的是针对现有技术中的不足，提供一种花生籽仁的石蜡切片方法。
为实现上述目的，本发明采取的技术方案是
一种花生籽仁的石蜡切片方法，包括以下步骤
I)取材；
2)固定采用体积浓度为5°/Γ Ο%戊二醛固定；
3)脱水80%乙醇50min,95%乙醇45min, 100%乙醇45min,每梯度至少2次脱水过程；
4)透明体积比1:1 二甲苯100%乙醇处理20 30min，二甲苯处理15 25min，二甲苯处理15 25min ；
5)透蜡、包埋和切片采用熔点为54 56°C的切片石蜡的直接透蜡2次，每次 1.5 2h，透蜡后包埋，切片；
6)脱腊、染色和封片
脱蜡二甲苯3(T40min，重复I次；
复水100%乙醇2 3min,重复I次；95%乙醇2 3min,重复I次；80%乙醇2 3min, 重复I次；50%乙醇2 3min ;蒸懼水2 3min ；
复染苏木素染液6 8min,蒸懼水冲洗5 7min,曙红染液染色3minl5s 4min ；
脱水95%乙醇2 3min，重复I次，100%乙醇2 3min，重复I次；
透明二甲苯2 3min，重复3次；
封片。
优选的，所述的花生籽仁的石蜡切片方法包括以下步骤
I)取材；
2)固定采用体积浓度为5%戊二醛固定；
3)脱水80%乙醇50min,95%乙醇45min, 100%乙醇45min,每梯度至少2次脱水过程；
4)透明体积比1:1 二甲苯100%乙醇处理20min, 二甲苯处理15min, 二甲苯处理 15min ；
5)透蜡、包埋和切片采用熔点为54 56°C的切片石蜡直接透蜡2次，每次I. 5h， 透蜡后包埋，切片；
6)脱蜡、染色和封片
脱蜡二甲苯30min，重复I次；
复水100%乙醇2min,重复I次；95%乙醇2min,重复I次；80%乙醇2min,重复I 次；50%乙醇2min ;蒸懼水2min ；
复染苏木素染液6min,蒸懼水冲洗5min,曙红染液染色3minl5s ；
脱水95%乙醇2min，重复I次，100%乙醇2min，重复I次；
透明二甲苯2min，重复3次；
封片。
所述的苏木素染液为每升蒸馏水中含有苏木素lg、碘酸钠O. 2g、钾明矾90g、柠檬酸lg、水合氯醒50g。
所述的曙红染液由以下物质组成质量分数为1%的曙红Y水溶液、95%乙醇和冰醋酸，其体积比依次为100:780:4。
本发明的改进之处具体如下
I、固定步骤常用的单一或混合固定剂如乙醇、甲醛、醋酸、FAA以及瓦纳兴等，对于花生籽仁样品的的固定效果并不理想，在切片过程中常出现切片不连续、有空洞等现象。 本发明采用电镜样品固定常用的戊二醛，其体积浓度为59TlO%，取得了良好的固定效果，切片连续，破裂情况大大减少，易着色，且无空洞现象出现。为了保证固定效果，固定过程中可更换固定液3 4次，以保证戊二醛固定液的体积浓度稳定在59TlO%。
2、脱水步骤花生种子由于蛋白质和脂肪含量高，脱水很难彻底，导致石蜡难以全面渗透。因此，本发明适当延长了脱水时间，具体是80%乙醇50min，95%乙醇45min，100% 乙醇45min，每步骤重复一次，可保证脱水效果。
3、透明步骤蛋白质对水分有很强的亲和力，而花生籽仁中蛋白质含量极其丰富， 导致脱水剂很难置换出来。为此，本发明采用了体积比1:1的二甲苯乙醇过度方法，具体透明过程如下11 二甲苯100%乙醇20 30min，二甲苯15 25min，二甲苯15 25min。4
4、透蜡步骤由于花生蛋白质含量高，为避免其吸涨作用，本发明采用了直接透蜡法。同时，由于花生籽仁中的蛋白质和脂肪对石蜡渗入的阻挡作用很强，本发明适当延长了透蜡时间，所用石蜡为熔点54 56°C的切片石蜡，达到了很好的效果，透蜡完全，切片完整。
5、染色步骤由于戊二醛固定液会使切片染色浅，分色不明显，因此，复水后的切片采用了苏木素_曙红复染，并适当延长了染色时间，结果表明，戊二醛固定液对染色没有明显的影响，切片染色效果良好，染色深度合适，分色明显。
总之，本发明具备以下优点
I、本发明能较好的固定花生籽仁细胞组织，克服了普通显微观察中由于花生籽仁油分和蛋白质含量过高导致的切片粘刀、薄厚不均、不连续或不完整等缺点。
2、本发明克服了花生籽仁石蜡切片过程中存在的切片不完整、不连续、存在空洞等技术问题，切片厚度可达7 μ m。
3、本发明方法操作简单，适用于所有花生品种，便于推广应用。

附图I是实施例I制作的抗黄曲霉侵染的Jll和感黄曲霉侵染的金花1012花生籽仁石蜡切片的显微图。
附图2是实施例I和对比例分别制作的抗黄曲霉侵染的Jll的花生籽仁石蜡切片显微图。
具体实施方式
下面结合附图对本发明提供的具体实施方式
作详细说明。
本文中，所述的乙醇溶液，其浓度均指体积浓度，如“80%乙醇”即体积分数为80% 的乙醇溶液。
实施例I
I、取材取黄曲霉侵染后8d (天)的抗、感花生品种Jll和金花1012的花生籽仁， 分开两片子叶，再横切。
2、固定采用电镜样品固定常用的戊二醛，戊二醛的体积浓度为5%，以双蒸水作为溶剂，将花生籽仁切片放入固定剂中，固定过程中更换固定液3次。
3、脱水样品采用乙醇脱水，具体脱水程序为80%乙醇50min，95%乙醇45min， 100%乙醇45min，每梯度2次脱水过程，样品脱水前用54 56°C的切片石蜡将样品包埋定位， 方便以后的操作。
4、透明采用1:1 (体积比)的二甲苯乙醇过度方法，具体透明过程如下1:1 二甲苯:100% 乙醇 20min, 二甲苯 15min, 二甲苯 15min。
5、透蜡、包埋和切片透蜡采用熔点为54 56°C的切片石蜡，透蜡程序如下透蜡2 次，每次I. 5h，透蜡后由包埋机完成包埋，仍为54 56°C的切片石蜡；采用普通生物切片机切片，切片厚度为7 μ m ;用恒温水浴展片，中性树胶封片，由自动封片机完成。
6、脱蜡、染色和封片脱蜡采用二甲苯脱蜡，具体程序如下二甲苯30min，重复I 次，然后进行复水，具体程序如下100%乙醇2min，重复I次；95%乙醇2min，重复I次；80% 乙醇2min,重复I次；50%乙醇2min ;蒸懼水2min。5CN 102914461 A书明说4/6页
复水后的切片采用了苏木素-曙红复染。苏木素染液配方如下4(T50°C热蒸馏水 2000ml,苏木素2g,碘酸钠O. 4g,钾明帆180g,朽1檬酸2g,水合氯醒IOOg ;曙红染液配方如下质量分数为1%的曙红Y水溶液100ml，95%乙醇780ml，冰醋酸4ml。具体程序如下苏木素6min,蒸懼水冲洗5min,曙红染色3minl5s,结果表明，戍二醒固定液对染色没有明显的影响，切片染色效果良好，染色深度合适，分色明显。
染色后的切片用乙醇脱水、二甲苯透明，具体程序如下95%乙醇2min，重复I次， 100%乙醇2min，重复I次；二甲苯透明2min，重复3次。中性树胶封片，由自动封片机完成。
制作的切片如图I所示，图I中，左图为黄曲霉侵染后8d的抗黄曲霉侵染Jll花生籽仁切片，右图为黄曲霉侵染后8d的感黄曲霉侵染金花1012花生籽仁切片。由图I可以看出，本发明的石蜡切片方法可以获得良好的切片和染色质量，切片连续、完整，切片中的细胞膜、脂肪粒等细微结构清晰可见；黄曲霉侵染后抗病品种种皮和籽仁的细胞结构比较完整，脂肪粒聚集存在；感病品种的细胞膜严重裂解，脂肪粒大量流失，因此，黄曲霉侵染花生后种皮及籽仁的细胞组织的动态变化可作为评价花生种质抗、感黄曲霉侵染的重要参考指标。
实施例2
I、取材取黄曲霉侵染后2d、4d、6d、8d、10d的抗、感花生品种Jll和金花1012的 花生籽仁，分开两片子叶，再横切。
2、固定采用电镜样品固定常用的戊二醛，戊二醛的体积浓度为5%，以双蒸水作为溶剂，将花生籽仁切片放入固定剂中，固定过程中更换固定液3次。
3、脱水样品采用乙醇脱水，具体脱水程序为80%乙醇50min，95%乙醇45min， 100%乙醇45min，每梯度2次脱水过程，样品脱水前用54 56°C的切片石蜡将样品包埋定位， 方便以后的操作。
4、透明采用1:1 (体积比)的二甲苯乙醇过度方法，具体透明过程如下1:1 二甲苯100% 乙醇 20min，二甲苯 25min，二甲苯 15min。
5、透蜡、包埋和切片透蜡采用熔点为54 56°C的切片石蜡，透蜡程序如下透蜡2 次，每次I. 5h，透蜡后由包埋机完成包埋，仍为54 56°C的切片石蜡；采用普通生物切片机切片，切片厚度为7 μ m ;用恒温水浴展片，中性树胶封片，由自动封片机完成。
6、脱蜡、染色和封片脱蜡采用二甲苯脱蜡，具体程序如下二甲苯30min，重复I 次，然后进行复水，具体程序如下100%乙醇3min，重复I次；95%乙醇2min，重复I次；80% 乙醇3min,重复I次；50%乙醇2min ;蒸懼水3min。
复水后的切片采用了苏木素-曙红复染。苏木素染液配方、曙红染液配方同实施例I。具体程序如下苏木素6min,蒸懼水冲洗7min,曙红染色3minl5s,结果表明，戍二醒固定液对染色没有明显的影响，切片染色效果良好，染色深度合适，分色明显。
染色后的切片用乙醇脱水、二甲苯透明，具体程序如下95%乙醇3min，重复I次， 100%乙醇2min，重复I次；二甲苯透明3min，重复3次。中性树胶封片，由自动封片机完成。
制作的切片经电镜观察，可见切片连续、完整，切片中的细胞膜、脂肪粒等细微结构清晰可见；黄曲霉侵染后抗病品种种皮和籽仁的细胞结构比较完整，脂肪粒聚集存在； 感病品种的细胞膜严重裂解，脂肪粒大量流失。
实施例36
I、取材取黄曲霉侵染后2d、4d、6d、8d、10d的抗、感花生品种Jll和金花1012的花生籽仁，分开两片子叶，再横切。
2、固定采用电镜样品固定常用的戊二醛，戊二醛的体积浓度为10%，以双蒸水作为溶剂，将花生籽仁切片放入固定剂中，固定过程中更换固定液4次。
3、脱水样品采用乙醇脱水，具体脱水程序为80%乙醇50min，95%乙醇45min， 100%乙醇45min，每梯度2次脱水过程，样品脱水前用54 56°C的切片石蜡将样品包埋定位， 方便以后的操作。
4、透明采用1:1 (体积比)的二甲苯乙醇过度方法，具体透明过程如下体积比 1:1 二甲苯100% 乙醇 30min，二甲苯 15min，二甲苯 25min。
5、透蜡、包埋和切片透蜡采用熔点为54 56°C的切片石蜡，透蜡程序如下透 蜡2 次，每次2h，透蜡后由包埋机完成包埋，仍为54 56°C的切片石蜡；采用普通生物切片机切片，切片厚度为7 μ m ;用恒温水浴展片，中性树胶封片，由自动封片机完成。
6、脱蜡、染色和封片脱蜡采用二甲苯脱蜡，具体程序如下二甲苯40min，重复I 次，然后进行复水，具体程序如下100%乙醇2min，重复I次；95%乙醇3min，重复I次；80% 乙醇2min,重复I次；50%乙醇3min ;蒸懼水2min。
复水后的切片采用了苏木素-曙红复染。苏木素染液配方、曙红染液配方同实施例I。具体程序如下苏木素8min,蒸懼水冲洗5min,曙红染色4min,结果表明，戍二醒固定液对染色没有明显的影响，切片染色效果良好，染色深度合适，分色明显。
染色后的切片用乙醇脱水、二甲苯透明，具体程序如下95%乙醇2min，重复I次， 100%乙醇3min，重复I次；二甲苯透明2min，重复3次。中性树胶封片，由自动封片机完成。
制作的切片经电镜观察，可见切片连续、完整，切片中的细胞膜、脂肪粒等细微结构清晰可见；黄曲霉侵染后抗病品种种皮和籽仁的细胞结构比较完整，脂肪粒聚集存在； 感病品种的细胞膜严重裂解，脂肪粒大量流失。
实施例4
I、取材取黄曲霉侵染后2d、4d、6d、8d、10d的抗、感花生品种Jll和金花1012的花生籽仁，分开两片子叶，再横切。
2、固定采用电镜样品固定常用的戊二醛，戊二醛的体积浓度为8%,以双蒸水作为溶剂，将花生籽仁切片放入固定剂中，固定过程中更换固定液4次。
3、脱水样品采用乙醇脱水，具体脱水程序为80%乙醇50min，95%乙醇45min， 100%乙醇45min，每梯度2次脱水过程，样品脱水前用54 56°C的切片石蜡将样品包埋定位， 方便以后的操作。
4、透明采用1:1 (体积比)的二甲苯乙醇过度方法，具体透明过程如下1:1 二甲苯100% 乙醇 25min，二甲苯 20min，二甲苯 20min。
5、透蜡、包埋和切片透蜡采用熔点为54 56°C的切片石蜡，透蜡程序如下透蜡2 次，每次lh，透蜡后由包埋机完成包埋，仍为54 56°C的切片石蜡；采用普通生物切片机切片，切片厚度为7 μ m ;用恒温水浴展片，中性树胶封片，由自动封片机完成。
6、脱蜡、染色和封片脱蜡采用二甲苯脱蜡，具体程序如下二甲苯35min，重复I 次，然后进行复水，具体程序如下100%乙醇2. 5min,重复I次；95%乙醇2. 5min,重复I次； 80%乙醇2. 5min,重复I次；50%乙醇2. 5min ;蒸懼水2. 5min。7
复水后的切片采用了苏木素_曙红复染。苏木素染液、曙红染液配方同实施例I。 具体程序如下苏木素7min,蒸懼水冲洗6min,曙红染色4min,结果表明，戍二醒固定液对染色没有明显的影响，切片染色效果良好，染色深度合适，分色明显。
染色后的切片用乙醇脱水、二甲苯透明，具体程序如下95%乙醇2. 5min，重复I 次，100%乙醇2. 5min,重复I次；二甲苯透明2. 5min,重复3次。中性树胶封片，由自动封片机完成。
制作的切片经电镜观察，可见切片连续、完整，切片中的细胞膜、脂肪粒等细微结构清晰可见；黄曲霉侵染后抗病品种种皮和籽仁的细胞结构比较完整，脂肪粒聚集存在； 感病品种的细胞膜严重裂解，脂肪粒大量流失。
对比例I
I、取材取黄曲霉侵染后8d (天)的抗黄曲霉侵染的花生品种Jll籽仁，分开两片子叶，再横切。
2、固定采用石蜡切片固定常用的FAA固定液(包括1/3体积的95%乙醇，2/9体积的福尔马林，1/9体积的冰醋酸，1/3体积的蒸馏水)，将花生籽仁放入固定剂中，期间更换固定液4次。
3、脱水样品采用乙醇脱水，具体脱水程序为70%乙醇50min，80%乙醇40min， 95%乙醇35min，100%乙醇35min，样品脱水前用54 56°C的切片石蜡将样品包埋定位。
4、透明采用1:1的二甲苯100%乙醇过度方法，具体透明过程如下体积比1:1 的二甲苯100%乙醇2. 5h，二甲苯lh，二甲苯lh。
5、透蜡、包埋和切片透蜡采用熔点为54 56°C的切片石蜡的道生液(包括1/6的石蜡，1/3的二甲苯，1/2的100%乙醇)，透蜡I次，纯石蜡透蜡3次，每次O. 5 lh，透蜡后由包埋机完成包埋，仍为54 56°C的切片石蜡；采用普通生物切片机切片，切片厚度为7μπι ; 用恒温水浴展片，中性树胶封片，由自动封片机完成。
6、脱蜡、染色和封片脱蜡采用二甲苯脱蜡，具体程序如下二甲苯15min，二甲苯 25min，然后进行复水，具体程序如下100%乙醇5s，95%乙醇5s。
采用苯胺固绿-曙红复染，苯胺固绿染液配方如下固绿lg，95%乙醇40ml，苯胺 10ml，曙红染液配方如下1%曙红Y水溶液100ml，95%乙醇780ml，冰醋酸4ml。具体程序如下苯胺固绿染色3min,蒸懼水冲洗2min,曙红染色3min。
染色后的切片用乙醇脱水、二甲苯透明，具体程序如下95%乙醇4 5s，100%乙醇 5s, I: I的100%乙醇二甲苯4 5s, 二甲苯透明2min, 二甲苯透明4 5min。中性树胶封片， 由自动封片机完成。
将对比例I制作的切片与实施例I制作的切片进行比较，如图2所示，图2中，左图是利用本发明方法制作的黄曲霉侵染后8d的抗黄曲霉侵染Jll花生籽仁石蜡切片，右图是利用对比例I的方法，也即常规方法制作的黄曲霉侵染后8d的抗黄曲霉侵染Jll花生籽仁石蜡切片。由图2可以看出，利用本发明方法制作的切片易着色，很完整，利用常规植物石蜡切片方法制作的切片不易着色，有大的空洞出现。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明方法的前提下，还可以做出若干改进和补充，这些改进和补充也应视为本发明的保护范围。
权利要求
1.一种花生籽仁的石蜡切片方法，其特征在于，包括以下步骤1)取材；2)固定采用体积浓度为59TlO%戊二醛固定；3)脱水80%乙醇50min，95%乙醇45min，100%乙醇45min，每梯度至少2次脱水过程；4)透明体积比I:I 二甲苯100%乙醇处理2(T30min，二甲苯处理15 25min，二甲苯处理15 25min ；5)透蜡、包埋和切片采用熔点为54 56°C的切片石蜡直接透蜡2次，每次I.5 2h，透腊后包埋、切片；6)脱蜡、染色和封片脱蜡二甲苯3(T40min，重复I次；复水100%乙醇2 3min，重复I次；95%乙醇2 3min，重复I次；80%乙醇2 3min，重复 I次；50%乙醇2 3min ;蒸懼水2 3min ；复染苏木素染液6 8min,蒸懼水冲洗5 7min,曙红染液染色3minl5s 4min ；脱水95%乙醇2 3min，重复I次，100%乙醇2 3min，重复I次；透明二甲苯2 3min，重复3次；封片。
2.根据权利要求I所述的花生籽仁的石蜡切片方法，其特征在于，它包括以下步骤 1)取材；2)固定采用体积浓度为5%戊二醛固定；3)脱水80%乙醇50min，95%乙醇45min，100%乙醇45min，每梯度至少2次脱水过程；4)透明体积比I:I 二甲苯100%乙醇处理20min, 二甲苯处理15min, 二甲苯处理 15min ；5)透蜡、包埋和切片采用熔点为54 56°C的切片石蜡直接透蜡2次，每次I.5h，透蜡后包埋，切片；6)脱蜡、染色和封片脱蜡二甲苯30min，重复I次；复水100%乙醇2min，重复I次；95%乙醇2min，重复I次；80%乙醇2min，重复I次； 50%乙醇2min ;蒸懼水2min ；复染苏木素染液6min,蒸懼水冲洗5min,曙红染液染色3minl5s ；脱水95%乙醇2min，重复I次，100%乙醇2min，重复I次；透明二甲苯2min，重复2次；封片。
3.根据权利要求I或2所述的花生籽仁的石蜡切片方法，其特征在于，所述的苏木素染液为每升蒸馏水中含有苏木素lg、碘酸钠O. 2g、钾明矾90g、柠檬酸lg、水合氯醛50g。
4.根据权利要求I或2所述的花生籽仁的石蜡切片方法，其特征在于，所述的曙红染液由以下物质组成质量分数为1%的曙红Y水溶液、95%乙醇和冰醋酸，其体积比依次为 100:780:4。
全文摘要
本发明提供一种花生籽仁的石蜡切片方法，其包括以下步骤1)取材；2)5%~10%戊二醛固定；3)脱水80%乙醇50min，95%乙醇45min，100%乙醇45min，每梯度重复1次；4)透明体积比1:1二甲苯100%乙醇20~30min，二甲苯15~25min，二甲苯15~25min；5)直接透蜡法透蜡，包埋，切片；6)脱蜡，复水，苏木素-曙红复染，脱水，透明，封片。本发明能较好的固定花生籽仁细胞组织，切片完整、连续、不存在空洞，切片厚度可达7μm，且操作简单，适用于所有花生品种，便于推广应用。
文档编号G01N1/28GK102914461SQ20121040850
公开日2013年2月6日 申请日期2012年10月24日 优先权日2012年10月24日
发明者单世华, 闫彩霞, 李春娟, 张廷婷, 许婷婷 申请人:山东省花生研究所