专利名称：快速确定产乳酸枯草芽孢杆菌液体培养物中细菌数量的方法
技术领域：
本发明属于生物领域，特别涉及细菌的技术方法。
背景技术：
随着国民经济的快速发展和人民生活水平的日益提高，人们对养殖环境及安全、健康的动物产品提出了更高、更新的要求。而近些年来，频频曝光的动物食品安全事件，如“瘦肉精事件”、“三聚氰胺奶事件”等等，无一不对动物养殖业造成了沉重地打击，引发了严重的信任危机。中国作为世界第一动物养殖大国，动物产品出口在国民经济中举足轻重，但近年来欧洲、日本等一些国家以食品安全问题为壁垒，拒绝中国动物产品的部分进入，给我国经济造成不应有的损失。这一系列的问题都是“动物产品安全”问题所致，已成为制约中国养殖业科学健康和可持续发展的瓶颈。 近年来我国生态养殖和调控已取得了不少的进步，国际上目前普遍认为，微生态制剂在未来的动物养殖中将有巨大的应用前景，对解决动物产品安全性将起到较大的作用。我国虽然在微生态制剂的研究和开发方面比欧美起步晚，但近20年来发展相当迅速。生产微生态制剂的厂家由2000年的十几家发展到2004年的1600家。据不完全统计，到2004年止，我国的各种微生态制剂的产量已达到15万吨。产业化程度高、规模较大的有四川何明清用芽孢杆菌研制的8501、8701、8801、8901、901系列，分别用于仔猪、育肥猪、鱼、禽、肉鸡。大连医学院研制剂的“促菌生”，南京农大研的“促康生”，松江制药厂生产的DM423菌粉，黑龙江兽医研究所生产的“痢康粉剂”，北京营养研究所生产的“增菌素”，杭州商学院生产的乳酸菌复合剂等等。市场上应用较多、效果较好的大多是以芽孢杆菌和乳酸杆菌为主的复合益生菌口服制剂。对产乳酸枯草芽孢杆菌进行发酵生产，综合枯草芽孢杆菌和乳酸杆菌的优点，可以使微生态制剂性能得到质的飞跃，达到更新换代的目的。大规模发酵生产乳酸枯草芽孢杆菌菌液是新型微生态制剂生产的基础和关键之一，也是未来微生态制剂的发展方向。近来有关乳酸枯草芽孢杆菌的研究引起了越来越多的关注。其中乳酸枯草芽孢杆菌的细菌计数是微生态制剂有关研究的基础，如研究乳酸枯草芽孢杆菌的培养条件、增殖特性、使用剂量、制剂含菌量等等均离不开乳酸枯草芽孢杆菌的细菌计数。细菌计数的方法有计数器测定法、电子计数器计数法、平板菌落计数法、比浊法、测定细胞重量法、测定细胞总氮量或总碳量、颜色改变单位法等，其中比浊法和菌落计数法可满足绝大多数细菌的计数且也是最常用的方法。菌落计数法是根据每个活的细菌能培养长出一个菌落的原理设计的，不需要特殊仪器，操作简单，测定时取一定容量的菌悬液作一系列的倍比稀释，然后将定量的稀释液进行平板培养，根据培养出的菌落数，可算出培养物中的活菌数，此法灵敏度高，是一种检测活菌数的好方法，但该法费时，至少需24小时才能出结果，且需判断选择好适宜的稀释度(一般选取菌落数在30-300之间的平板进行计数，过多或过少均不准确)，因此其操作的复杂性、花费及时间等均增大。比浊法是根据菌悬液的透光量间接地测定细菌的数量。细菌悬浮液的浓度在一定范围内与透光度成反比，与光密度成正比，所以，可用光电比色计测定菌液，用光密度(0D值)表示样品菌液浓度。但光密度或透光度除了受菌体浓度影响之外，还受细胞大小、形态、培养液成分以及所采用的光波长等因素的影响，且通常只能检测含有大量细菌的悬浮液，得出相对的细菌数目，对颜色太深的样品或组织样品等，不能用此法测定，但此法简便快捷。比浊法测定细菌的数量主要的关键是如何排除样品中的干扰物、所采用的光波波长的确定和测定的OD值与细菌数量间对应关系，否则只能判断出相对的细菌数目而不能确定出准确的细菌数目。目前，利用紫外分光光度计来测定产乳酸枯草芽孢杆菌数量还需摸索
发明内容
本发明的目的在于提供一种细菌计数的方法，该方法快速简单，使用于乳酸枯草芽孢杆菌液体培养液中细菌的技术。为实现上述目的，本发明的技术方案为快速确定产乳酸枯草芽孢杆菌液体培养物中细菌数量的方法，具体步骤为取样品并洗涤，所取的样品指产乳酸枯草芽孢杆菌液体培养物，也可以是其他培养物，或形状和产乳酸枯草芽孢杆菌液体培养物相似的样品；洗涤的目的在于去除其它杂物，避免后期读取0D_值时受其他杂物影响而产生误差，将洗涤干净的样品用稀释液稀释至OD6tltl值不大于0. 8得稀释菌液，记录稀释倍数，所述稀释倍数是指所述稀释菌液相对于所述样品的体积稀释倍数；通过多次试验和计算，细菌数量总数=OD6tltl值X稀释倍数X2.2X IO9CFU/mL。公式中的系数“2. 2”是经过多次实验得到的经验系数，具体思路是将经具体确认细菌(乳酸枯草芽孢杆菌)数量的样品与该样品的0D_值统计分析得到的系数。当公式采用其它系数，会出现细菌计数误差。作为优选，洗涤选用离心的方式进行。离心的条件不限，只要能够实现洗涤干净的样品用稀释液稀释至0D_值不大于0.8即可。但是，为了尽可能的缩短整个试验时间，作为优选，所述离心的条件是以3000-5000转/分钟离心5-10分钟后，用生理盐水连续离心洗涤不少于3次。除了离心，也可以选择其它洗涤方式，其目的在于读取0D_值无干扰。作为优选，将洗涤干净的样品用稀释液稀释至0D_值不大于0. 1-0. 8，仅在上述范围内，0D_值与细菌数量才存在线性关系。超出上述范围，将导致计数出现误差或错误。其中，所述样品进一步限定为液体培养物或菌液。所述细菌为产乳酸枯草芽孢杆菌。本发明的有益效果在于一、实现了利用仪器自动化检测和计数。传统的细菌培养计数是人工操作，因此结果的可靠性与检测人员的经验有较大的影响，仪器自动化检测表明了检测方法的进步。二、简便。传统的细菌计数涉及培养试剂选择与准备、培养基的制备、培养条件的准备、多步骤的人工操作等，因此操作复杂，需要具有微生物学知识特别是要掌握产乳酸枯草芽孢杆菌的培养特性。本发明操作简便，无微生物学和产乳酸枯草芽孢杆菌知识的人员根据操作步骤即可测定。三、快速。传统的细菌培养计数不仅操作复杂，且培养时间需24-72小时，而本发明可在0. 5-1小时出结果，大大地缩短了检测时间四、确定了检测所采用的光波波长和所测定的OD值与产乳酸枯草芽孢杆菌数量间的对应关系，结果准确。
本发明根据菌悬液的透光量可反映测定样品中的细菌的数量，对比浊法测定细菌的数量的两个主要的关键一测定所采用的光波波长和所测定的OD值与产乳酸枯草芽孢杆菌数量间对应关系进行了摸索，确定了 OD值与产乳酸枯草芽孢杆菌数量间对应关系，同时，本发明通过用生理盐水连续离心洗涤所测定的菌液，除去样品中的干扰物，结果准确。因此利用该方法可准确、快速地测定出产乳酸枯草芽孢杆菌培养物中产乳酸枯草芽孢杆菌的细菌数，填补了利用紫外分光光度计准确测定产乳酸枯草芽孢杆菌的细菌数这一空白。
具体实施例方式以下结合具体实施例，对本发明进行详细说明。实施例I样品为产乳酸枯草芽孢杆菌CSY1-3-10-1株用10%果寡糖合成培养基35_40°C通气发酵24小时后，检测发酵液中产乳酸枯草芽孢杆菌的含菌数。取发酵菌液Iml作为样品。方法I计数器计数法取上述样品，用血细胞计数器进行计数。取Iml该样品，置于血细胞计数器的计数室内，三名技术员各用显微镜计数三次，以降低主观错误的可能。每毫升该发酵液中产乳酸枯草芽孢杆菌的含菌数为2. 2799X 101(lCFU/ml，约为228亿个。方法2取上述样品进行离心。对于上述样品，分别设置两种条件离心，条件I为以3000转/分钟离心10分钟样品后，在离心的样品中添加生理盐水，连续离心5000转/分钟，5分钟，洗涤3次；条件2为以5000转/分钟离心5分钟，在离心的样品中添加生理盐水，连续离心3000转/分钟，10分钟，洗涤3次。每次离心后，均去除上清液，取沉淀物。将沉淀物用生理盐水作20倍体积的稀释，得稀释菌液，记录稀释倍数，所述稀释倍数是指所述稀释菌液相对于所述样品的体积稀释倍数；于紫外分光光度计下测定600nm处OD值(注意用生理盐水调0)，测得OD6tltlnm值为0.518。根据以下公式计算出菌液含菌量，含菌总数(CFU/ml) = OD600nm 值 X20X2. 2X 109CFU/mL = 0. 518X20X2. 2X 109CFU/ml =2. 2812X101(lCFU/mL。即每毫升该发酵液中产乳酸枯草芽孢杆菌的含菌数约为228亿个。公式中的系数“2. 2”是经过多次实验得到的经验系数，具体思路是将经具体确认细菌(产乳酸枯草芽孢杆菌)数量的样品与该样品的OD6tltl值统计分析得到的系数。当公式采用其它系数，会出现细菌计数误差。另外，平行设置其它稀释倍数组，所得稀释菌液的OD6tltlnm值在0. 1-0. 8内，带入上述公式计算，所得细菌(产乳酸枯草芽孢杆菌)数量与稀释体积呈线性关系。方法3取上述样品进行离心。对于上述样品，分别设置两种条件离心，条件I为以3000转/分钟离心10分钟样品后，在离心的样品中添加生理盐水，连续离心5000转/分钟，5分钟，洗涤3次；条件2为以5000转/分钟离心5分钟，在离心的样品中添加生理盐水，连续离心3000转/分钟，10分钟，洗涤3次。每次离心后，均去除上清液，取沉淀物。将沉淀物用生理盐水分别作5、6、7、8、9和10倍体积的稀释，得稀释菌液，记录稀释倍数，所述稀释倍数是指所述稀释菌液相对于所述样品的体积稀释倍数，于紫外分光光度计下测定600nm处OD值(注意用生理盐水调0)，5、6、7、8、9和10倍体积的稀释测得OD6tltol值大于0.8。根据以下公式计算出菌液含菌量，含菌总数(CFU/ml) = OD6tltlnm值X稀释倍数X2. 2X109CFU/mL，所计数的5组含菌总数(CFU/ml)与稀释体积不呈线性关系，不
予考虑。上述三种方法中，方法2与方法I计数结果一致。但是，方法I中，计数器计数法必须依赖于显微镜；而且计数器计数法是通过肉眼观察后进行计数，计数过程中由于主观原因产生的误差不易被察觉，必须通过多人计数来降低误差。所以，本方法有一定的优势。而方法3中，稀释倍数与检测结果缺少线性关系。最后说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的宗旨和范围，其均应涵盖在本 发明的权利要求范围当中。
权利要求
1.快速确定产乳酸枯草芽孢杆菌液体培养物中细菌数量的方法，其特征在于，具体步骤为取样品并洗涤，将洗涤干净的样品用稀释液稀释至0D_值不大于0. 8，得稀释菌液，记录稀释倍数，细菌数量总数=OD_值X稀释倍数X 2. 2X109CFU/mL，所述稀释倍数是指所述稀释菌液相对于所述样品的体积稀释倍数。
2.根据权利要求I所述的的方法，其特征在于，取样，用离心的方法洗涤。
3.根据权利要求2所述的的方法，其特征在于，所述离心的条件是以3000-5000转/分钟离心5-10分钟后，用生理盐 水连续离心洗涤不少于3次。
4.根据权利要求I所述的的方法，其特征在于，将洗涤干净的样品用稀释液稀释至OD600 值不大于 0. 1-0.8。
5.根据权利要求I所述的的方法，其特征在于，所述样品为液体培养物或菌液。
6.根据权利要求I所述的的方法，其特征在于，所述细菌为产乳酸枯草芽孢杆菌。
全文摘要
本发明属于生物领域，特别涉及细菌的计数方法，具体为一种快速确定产乳酸枯草芽孢杆菌液体培养物中细菌数量的方法，具体步骤为取样品并洗涤，将洗涤干净的样品用稀释液稀释至OD600值不大于0.8，记录稀释倍数，细菌数量总数＝OD600值×稀释倍数×2.2×109CFU/mL；本发明实现了利用仪器自动化检测和计数；传统的细菌培养计数是人工操作，因此结果的可靠性与检测人员的经验有较大的影响，仪器自动化检测表明了检测方法的进步；简便、快速；确定了检测所采用的光波波长和所测定的OD值与产乳酸枯草芽孢杆菌数量间的对应关系，结果准确。
文档编号G01N21/33GK102854165SQ20121032318
公开日2013年1月2日 申请日期2012年9月3日 优先权日2012年9月3日
发明者付利芝, 刘作华, 黄勇, 杨金龙, 郑华, 杨睿, 沈克飞, 张素辉 申请人:重庆市畜牧科学院