专利名称：用于制备和分析多种细胞悬浮液的自动方法和自动设备的制作方法
用于制备和分析多种细胞悬浮液的自动方法和自动设备本发明涉及一种用于制备和分析多种细胞悬浮液的方法，该方法包括至少下述连续的步骤(a)将多个瓶安装到装载板上，每个瓶都装有待分析的细胞悬浮液；(b)将多个分析容器安装到装载板上；以及(C)从瓶内取出细胞悬浮液的样本，并且将该样本放置到分析容器中；对每个待分析的瓶重复步骤(C)。本发明也涉及一种实施所述方法的自动的制备和分析设备。细胞悬浮液和例如不易挥发的细胞学涂片的分析是一项极其精细的操作。细胞学诊断包含基于细胞的形态学检查的诊断技术。它非常适用于甄别癌和癌前期病变，尤其是 对于子宫颈癌和癌前期病变。该分析的目的是对病变细胞进行甄别，因此必须获得感兴趣区域的有代表性的完全清晰的细胞沉积，以避免诊断错误。为允许对大量样本的分析并且以很快的处理速度进行，需要自动地进行待分析的样本的制备和实际的分析过程。为此，公知地，自动设备能够制备样本的分析载玻片，例如
冷片坐
/ I 寸 O例如在文件US 2009/0233331中，描述了上述类型的自动设备。但是，这种自动设备不一定使细胞沉积的制备得到令人满意的分析和可靠的诊断。这种自动设备使用产生一定数量的人工制品的设备，该人工制品特别用于过滤管理、细胞形态变化的压力问题和过滤网被残渣堵塞的问题。此外，处理操作随样本的类型的不同而不同例如，在将细胞收集到过滤器之前首先可能必须去除红细胞或黏液。因此，不可能实施一种适用于所有类型的妇科学的和非妇科学的细胞样本的标准方法，这对操作者的动作的限制极小。本发明的一个目的是通过以可靠的、再生的、标准的方式并且以快的速度使多个细胞悬浮液的制备和分析完全自动，以克服这些缺点。不论细胞是什么类型，其制备方法是相似的。为此，本发明的主题为一种用于采样和分析多个细胞悬浮液的方法，从而从瓶内取出细胞悬浮液的样本，并且将该样本放置到分析容器内的步骤(C)包括至少一个通过移液-分液装置分解细胞簇的步骤。根据所述方法的其他特征-从瓶中提取所述细胞悬浮液的样本，并且将该样本放置到所述分析容器中的步骤(C)包括至少一个在瓶中混合并过滤所述细胞悬浮液的步骤。-从瓶内取出细胞悬浮液的样本，并且将该样本放置到分析容器内的步骤(C)还包括至少下列步骤(d)替换悬浮液中的样本；(e)通过差分漢析(differential decanting)选择相关的细胞；(f)使用移液装置吸出由差分滗析而得到的体积，该体积包含待分析的样本；
( g)替换移液装置中的均质悬浮液中的包含待分析样本的体积；(h)将移液装置移至分析容器的上方；(i)将待分析样本分配到分析容器中。-每个分析容器包括滗析井和设置为朝向所述滗析井的分析载玻片，并且所述方法包括至少下列连续步骤(j)在装载板上设置吸收片，以使每个分析载玻片设置在装载板和吸收片之间；(k)在压机中安装多个滗析井，并且将该压机设置在板的上方，以使每个滗析井设置为在分析载玻片上方且朝向分析载玻片；以及
(I)在分析载玻片上展开细胞涂片，该细胞涂片通过滗析井中的样本的沉积获得;步骤(j)和步骤(k)在安装多个分析容器的步骤(b)之后且在取细胞悬浮液的样本的步骤(C)之前实施，并且步骤(I)在取细胞悬浮液的样本的步骤(C)之后实施。-包括通过测量分析载玻片上的细胞密度来分析在滗析井的底部的细胞沉积；-包括自动着色和标记的步骤；-预先包括绝对地密封装有待分析的细胞悬浮液的所述瓶的步骤，所述方法实施之后不必打开瓶；以及-每个分析容器包括采样管或等分管。本发明的另一个主题为一种用于采样和分析至少一种细胞悬浮液的自动设备，该设备包括-至少一个装有待分析细胞悬浮液的瓶；-至少一个装载板，所述瓶固定且精确地设置和保持在该装载板上；-至少一个细胞悬浮液滗析井；所述滗析井固定而精确地设置和保持在原位；-分析系统，该分析系统包括至少一个用于接收/容纳细胞悬浮液的样本的分析载玻片，所述样本为含有待分析的感兴趣的成分的细胞悬浮液的体积部分，该分析载玻片固定且精确地设置和保持于所述板上、并且位于滗析井下方并朝向滗析井；自动设备包括移液装置，该移液装置能够从瓶中取出细胞悬浮液的样本并且能够将该样本分配到分析系统的分析载玻片上的滗析井内，这些移液装置设置为使得细胞簇分散。根据自动设备的其他特征-包括第一可移动臂，移液装置连接于第一可移动臂，所述第一可移动臂至少在保持瓶、滗析井和分析载玻片的装载板的上方移动。-包括标记或着色溶液,该标记或着色溶液能够通过移液装置与细胞溶液混合。-每个瓶和每个分析载玻片包括视觉标记，并且自动设备包括用于读取所述视觉标记的装置。-读取装置包括相机，读取装置由第二可移动臂支撑，所述第二可移动臂至少在保持瓶、滗析井和分析载玻片的装载板的上方移动。-瓶包括设置在滗析椎体上方的过滤装置，移液装置设置为能够在过滤装置的下面提取细胞悬浮液的一部分并且将该部分重新注入到滗析椎体上以混合细胞悬浮液并且促使悬浮液的一部分至少穿过过滤装置一次以便分散尺寸大于过滤装置的筛孔尺寸的细胞簇。-样本分析系统包括用于在分析载玻片上分析位于滗析井的底部的细胞沉积的细胞密度的装置。-用于在分析载玻片上分析位于滗析井的底部的细胞沉积的细胞密度的装置包括相机。-样本的分析系统包括用于形成样本的虚拟载玻片的设备。-用于形成样本的虚拟载玻片的设备包括相机。-自动设备包括单个相机，该单个相机形成读取装置、细胞密度分析装置以及用于形成虚拟载玻片的设备。-所述自动设备包括支架和按钮，支架包括用于至少定位保持板(holderplate) 的装置，该装置能够固定而精确地维持板的装置，按钮至少能够确认板的位置。-所述自动设备设置为实施上述过程；-细胞悬浮液为细胞学的悬浮液；-细胞的悬浮液包括体积百分比为80%和95%之间的以下固定溶液-590ml的生理盐水，-IOml 的 PEG，-203ml 的异丙醇，-193ml 的纯乙醇；-体积百分比为O.01%的叠氮化钠；-以及体积百分比为20%和5%之间的浓度为4%的甲醛缓冲液。参考附图
，通过阅读下述仅作为一个实例的描述，将更好地理解本发明，在附图中图I是根据本发明的自动采样和分析设备的示意性剖视图；图2是图I中显示的自动设备的示意性透视图；图3是用于制备和分析接自动设备的装载板的示意性顶视图，该装载板接收瓶，每个瓶都装有细胞悬浮液；图4是将被收容在自动设备内的瓶的剖视图；图5是将被收容在自动设备内的漢析井(decanting well)的剖视图；图6是图I和图2中的自动设备的分析装置的示意性透视图；以及图7是在用于制备和分析细胞悬浮液的方法的混合步骤中的瓶的剖视图。参考附图对自动设备2进行描述，该自动设备2用于制备和分析细胞悬浮液，并且能够自动地进行该制备和分析。图I和图2显示用于制备和分析至少一个装有待分析的细胞悬浮液5 (例如不易挥发的细胞溶液)瓶4的自动设备2。所述细胞学的悬浮液5可以来自于子宫颈的涂片，例如使用采样刷(未示出)来操作。该细胞溶液特别地包括细胞。随后将刷浸入到装有固定溶液(fixing solution)的瓶4内，并且摩擦过滤器以提取和收集细胞，从而形成细胞悬浮液5。固定器(fixer)或固定溶液用于保存和贮存包含细胞的细胞学样本或样品，以供细胞学者之后对其的研究。因此固定溶液必须将有核细胞和红细胞的整体性(特别是它们的形态)保持在它们被采样前的状态。固定溶液用于将细胞学样本保存在试管中，该细胞学样本包含生物细胞以供细胞学者研究。由Saccomanno et al公开且已经公知地，酒精固定溶液也可以包括聚乙二醇(Carbowax 或Polyethylene Glycol (PEG))。已公开且公知地，甲醒可以与脱I丐剂或抗凝聚剂(例如乙二胺四乙酸(EDTA)及其盐)结合。此外，已公开且公知地，溶粘蛋白剂(mucolytic agent)(例如二硫苏糖醇(DTT)或乙酰半胱氨酸(acetylcystein))可以被添加到包含黏液的样本中。甲醛用于保持红细胞和有核细胞而使它们不会发生细胞溶解，从而保证根据尺寸的参考，以使细胞学者做出更加准确的诊断。下述实例用于说明所述固定溶液而不限制固定溶液的范围
实施例溶液包含80%体积的-590ml的生理盐水，-IOml 的 PEG，-203ml 的异丙醇，-193ml 的纯乙醇， -O. 01%体积的叠氮化钠，以及20%体积的浓度为4%的甲醒缓冲液(4%buffered formaldehyde)。本发明的固定溶液不包含任何丙酮或酮族化合物或任何乙酸，因为这些物质导致红细胞的溶解，该红细胞破裂后释放与红细胞结合的血红蛋白。一些类型的染色法(例如巴氏染色法)，由于将多个有核染色剂与血红蛋白结合的染色剂的复杂性，使得细胞学分析，尤其是有核分析非常困难甚至是不可能的。同样，免疫化学的研究经常被血红蛋白的沉积所阻碍。根据本发明，通过利用巴氏染色法或免疫细胞化学研究来对固定于所述不包含任何丙酮或酮族化合物或乙酸的固定溶液中的样本进行研究，能够改进对样本的分析。因此，上述固定溶液能够使有核细胞和红细胞很好地保持完整性，以便对其进行分析。此外，上述包含PEG和/或甲醛的固定溶液的密度与传统的应用于细胞学的固定溶液(基本上是基于酒精的)的密度不同。申请人已经发现固定溶液由此允许以一种方式通过密度梯度筛选有兴趣的细胞，该方式比使用传统的应用于细胞学的固定溶液更有效。自动设备2还包括支架8和至少一个装载板6，装载板6至少支撑装有待分析的细胞悬浮液5的瓶4，装载板6安装在支架8上。装载板6用于支撑多个瓶4 (每个瓶4都装有细胞悬浮液5)，以快速而自动地制备多个待分析的细胞悬浮液5，全部或部分的悬浮液的制备采用同时或相继的方式进行。在申请人提交的专利申请EP-2111300中已经描述了所述装载板4，并且装载板4能够定位并且将瓶4精确且固定地保持在板6上。本领域的技术人员可以参考该文件，因此在这里不详细描述所述板。图3显示了所述板的示意性视图。支架8包括用于定位板6的装置，该装置能够固定而精确地支撑自动设备2中的板。这些定位装置包括用于装载板6的端部的装置9，当板6定位于自动设备2中时，板6被设置为紧靠所述装置9或在所述装置9内。此外，板6包括位于支架8上的定位装置。这些定位装置包括至少一个沿板的厚度方向挖空但未贯穿板的孔口 10，该孔口 10用于将板精确定位到自动设备2的支架8上。优选地，板6包括两个相同的孔口 10,该两个相同的孔口 10设置为与板6的最长的侧边正交。自动设备2的支架8包括与板6的定位装置相配合的定位装置。这些装置包括至少一个突起12，突起12的数量优选为和板6的孔口 10的数量一样多。突起12的形状与板的孔口 10的形状相配合，并且突起12的尺寸稍小于孔口 10的尺寸，以便当板6设置在支 架8上时突起12位于对应的孔口 10内。由此，板6被固定而精确地支撑在支架8上。同样，自动设备2的支架8包括钮14或按钮，该钮14或按钮用于确认板6在支架8上的适当的水平定位。当板6被适当地定位时，即当板的整个下侧与支架8接触时，由于突起12容纳于孔口 10内，按钮14被按进支架8里的空间16中(该空间16为此而设置)，从而确保板6的适当的位置并且允许自动设备2的运行。当按钮14没有被按下时，自动设备停止运行。此外，自动设备2包括移液-分液装置20 (以下称为移液或采样装置)，即允许细胞悬浮液5的样本的采样和/或分配和/或填充。这些移液装置20在装载板6的上方延伸。样本是细胞悬浮液5的精确的体积部分，该细胞悬浮液5包含待分析的感兴趣的成分(例如细胞)。这些移液装置20是可移动的，以使它们能够在每个瓶4的上方以图I中箭头所示的方向移动以采样和/或填充。移液装置20由至少一个移液管22或针组成，并且移液管优选为多个(例如4个或8个)，移液装置20平行设置，以使其能够同时从多个瓶4中采样，并且同时制备这些样本以便对它们进行分析。移液装置20连接于第一机械臂，该第一机械臂在自动设备2上是可移动的并且位于板6的上方。所述装置(孔口 10/突起12和按钮14)确保板的准确位置，该装置通过防止注射针或移液管22击打瓶4的边缘能够避免注射针或移液管22的损坏，如果板相对于移液装置20被错误定位，那么注射针或移液管22被破坏的情况将会发生。因此这避免了更换破损或变形的装置的技术整备的额外花费。同样，自动设备2包括制备和分析系统30，该制备和分析系统30包括至少一个分析支架，该分析支架用于容纳/包含通过移液装置20采样和分配到分析支架里或上的细胞悬浮液5的样本。例如，根据操作者所选择的分析模式而决定地，所述制备和分析系统20的分析支架可以包括涂片载玻片32、采样或等分管34、分析或滗析井36。分析支架32、34和36被准确而固定地支撑在板6上。下文将更加详细地描述所述制备和分析系统30。现在将结合图4详细地描述装有待分析的细胞悬浮液5的瓶4。
优选地，所述瓶4具有与文件EP-2111300中所描述的瓶一样的特征，从而能够将瓶4安装在装载板6上，并且所述瓶4具有文件W0-2006/058989中所描述的瓶的一些特征，从而能够制备和分析细胞悬浮液。参考图4,装有细胞悬浮液5的瓶4包括主体40 (例如大致呈圆柱形)。下边缘42和阻挡装置(blocking means)44从主体40上延伸，该阻挡装置44可以设置在主体的任意一侧上且从那里突出，以沿纵向和垂直方向阻挡如文件EP-2111300中所述的装载板6上的瓶4。阻挡装置44用于进行板6的轨迹的印记，以沿优选的方向阻塞瓶4。本领域的技术人员可以参考这份文件以理解具有装载板6的所述瓶4的功能。此外，瓶4还包括盖46，该盖46例如设置有隔膜48，该隔膜48为可穿透的且可自修复的以允许自动设备的移液装置10 (例如移液管)穿过。具体地，该可穿透且可自修复的部分48能够使得瓶接收细胞溶液的采样而不将盖46从瓶上移开，通过确保样本在被医生或实验室米集后被完全可罪地存，并且在制备和分析过程中始终存在S封瓶中，从而保持样本的完整。此外，这样完全避免了被实验技术的固定溶液的污染物或吸入物污染的风险。 每个瓶4的盖46还包括视觉标记50或标识，该视觉标记50或标识用于标记容纳在瓶4中的细胞悬浮液5。例如，该视觉标记50为条形码。在制备和分析期间，该标识50为样本序号的计算机化管理提供完全可追踪性。根据另一种实施方式，标识装置为不同的，例如包括携带数据的标签或属于射频识别芯片(其内容能够通过读取装置被远距离地读取)类型的电子标签。根据一种需要用采样刷制备细胞样本的实施方式，瓶4设置有如文件W0-2006/058989中所描述的过滤装置52，该过滤装置52至少部分地浸入悬浮液中。这些过滤装置52以过滤网的形式，该过滤网的材料为制作篮子的材料，例如过滤网的边缘连接于瓶的主体40并且过滤装置52的中部连接于管54,该管54沿瓶的开口方向延伸，该管54连接于将瓶保持在原位的装置并且适用于允许自动设备的细胞溶液采样装置20从过滤装置(尤其是抽吸悬浮液的移液管22)的下面通过。优选地，过滤材料的网为编织尼龙，当刷摩擦所述材料时，允许通过机械操作分离细胞而不损坏样本。此外，瓶4的下部包括滗析椎体56。同样，已知地，瓶4设置有开口，该开口用于接收可拆卸地连接在把手上的细胞采样刷。瓶的开口包括与刷对接的装置，以使刷能够被封锁在瓶中并且从把手上分离。本领域的技术人员可以通过参考这个文件了解这种瓶的更详细的资料，这里将不再进一步描述。使用所述瓶可以保存刷而不妨碍或阻断采样针。根据一种不需要使用采样刷制备细胞样本实施方式，例如活体检查类型或流体采集的样本，瓶4既没有安装中央管也没有安装过滤装置。现在将详细描述制备和分析系统30。参考图5，优选地，制备和分析系统30包括通过滗析将细胞沉积到分析载玻片上的装置60。在文件FR-2917165中已经描述了所述通过滗析将细胞沉积到分析载玻片上的装置60，本领域的技术人员可以参考该文件。所述装置60包括至少一个滗析井36，该滗析井36设置在分析载玻片32和吸收材料62的上方。分析载玻片32在端部包括标识装置50，例如条形码的视觉标记。使用移液装置20将悬浮液分配到位于分析载玻片32的上方的滗析井36的收集室64中，该收集室64的底部是开放的且紧接着分析载玻片32的细胞沉积区域延伸。收集室的底部与该保存或固定液体的吸收材料62流体连通，以逐渐吸收液体，并且允许通过将细胞滗析到分析载玻片32的细胞沉积区域得到均匀的沉积。以这种方式，在较短的滗析时间内就能获得均匀的细胞沉积。在收集室的底部和分析载玻片之间且围绕细胞沉积区域的位置，吸收材料被滗析压机(decanting press) 66部分地压缩。关于图5和图6,制备和分析系统30包括用于测量漢析室中的细胞沉积的装置70，以便形成分析载玻片32。文件FR 2922019中描述了所述细胞沉积测量装置70，本领域 的技术人员可以参考该文件。由此，细胞密度测量装置70包括设置为记录板6的影像(例如滗析室64的内容物和分析载玻片32的内容物)的相机72。 此外，细胞密度测量装置70包括围绕相机连接的套筒74，以便当相机72下降然后位于滗析室64的上方时，获得滗析室的内容物的影像，所述套筒74与滗析压机66接触从而形成不透光的暗室，以使获得的影像的质量最优化。细胞密度测量装置70还包括用于照明滗析室以使相机72能够执行细胞沉积测量的装置。这些照明装置包括光源76 (例如连接于相机72)。当相机72下降时，光源76尽可能向分析载玻片32靠近，从而获得最佳的光线传播。然后光源76将光线发散到分析载玻片32里。细胞沉积测量装置70连接于第二机械臂，该第二机械臂是可移动的且位于板6的瓶4的上方。根据一种变形，所述系统30的分析支架包括支架80和至少一个采样或等分管34，多个管34可以插入支架80中，以使它们能够被固定地保持在原位。等分管34的支架80可以精确地连接在板6上，以便移液装置20能够提取装在瓶4中的细胞溶液5的样本，并将这些样本分配到等分管34中，瓶和等分管固定在同一块板上。两种可能的设置一种与滗析井36相对应地放置在分析载玻片32上并且具有吸收材料62，另一种与采样或等分管34相对应，该两种可能的设置能够系统地或根据在未着色载玻片上到沉积分析的结果，连接在同一载体上以同时或错开地实施互补技术，以在预分析步骤中获得更好的控制自动设备2还包括用于识别瓶4上的视觉标记32的远距离读取装置90。这些读取装置90包括广域相机并且读取装置90在装载板6的上方延伸。这些远距离读取装置90由自动设备的第二可移动机械臂支撑，从一个瓶4移动到下一个瓶4的第二臂被固定地在板6上保持在原位,从而读取视觉标记50或标记在该盖46上的标识。相机设置为能够读取分析载玻片32的识别数据50。该数据被传输到例如数据处理系统，该数据处理系统确保对多个分析载玻片的监控和对沉积在所述载玻片上的细胞涂片的数据的归类的质量。所述数据尤其包括细胞涂片的原点、分析载玻片的标记与瓶4上的标记成对的对应。
根据一种优选实施方式，细胞密度分析装置70的相机72允许读取视觉标记50。细胞密度分析装置70和远距离读取装置90以这种方式结合，以此节省空间。优选地，当盖固定到主体上时，标记50沿精确且不变的方向定向，这可以简便地使用用于读取标记的远距离装置90。不变的方向可以通过在文件EP-2111300中描述的用于阻挡瓶4的装置44来获得。这些远距离读取装置90 (由于瓶4的特定定向)允许这些瓶具有单一的或多种的视角(viewing)，以使它们以单一的或多种的样式与设想的分析系统(涂片载玻片32、采样或等分管34、分析井36…)相匹配，该系统本身固定地设置。换句话说，读取装置90能够读取单个瓶4的标记50或者同时读取多个标记。这种固定定位(该固定定位与设置在滗析压机66中的分析载玻片32相对应)位于文件EP-2111300中描述的轨迹的延长部分，用于支撑瓶4，以使一个相同的单个板能够适当地定位瓶4和用于远距离读取装置的载玻片32，并且提供单一的或多种的视角。因此，可以对瓶进行分组处理，该分组处理能够提供更快的分析速度。 自动装置还包括数据处理器(未示出)，该数据处理器收集使用者设置的与细胞样本的类型有关的参数的选择，并且控制机械臂、移液装置20、读取装置90、细胞密度分析装置70、按钮14 (移动、米样体积、相机米集、光源…)。根据一种实施方式，自动设备还包括托架(未示出)，该托架以精确的方式固定在自动设备2的支架8上，所述托架包括装有通常用于着色或标记细胞的具体实体(例如细胞核、细胞质或细胞的其他组成单元)的溶液的瓶。所述着色或标记溶液的支架允许在分析载玻片上实施着色或标记步骤，例如本领域技术人员的通常操作。然后使用移液装置20实施所述着色或标记步骤，将移液装置20设置在着色或标记溶液的瓶的上方后，提取需要体积然后该移液装置20移至分析载玻片的上方，在此移液装置分配其内容物。根据一种实施方式，自动设备2的分析系统30还包括如文件FR-2931966中描述的用于形成样本的虚拟载玻片的装置，该用于形成样本的虚拟载玻片的装置包括相机。根据一种实施方式，分析装置和/或读取装置使用同样的相机。自动设备还包括形成读取装置90的单个相机、细胞密度分析装置70和用于形成虚拟载玻片的装置，该用于形成虚拟载玻片的装置能够节省空间。现在将进一步详述通过上述的自动设备2实施的用于制备和分析这些悬浮液的方法，以制备分析载玻片32。预先地，在取出待制备和分析的细胞样本5之后并且在将这些转移到瓶4中后，操作者用瓶4的盖46最后密封瓶4。有效地实施用于制备和分析这些悬浮液的方法并且在这之后不要打开瓶4.在另一种实施方式中，如果细胞样本通过用细针刺穿而取走(细针抽吸)，操作者可以通过将采样针插穿瓶的自修复隔膜而插入细胞样本，在任何时候都无需打开盖。技术人员或使用者，在一段充足的细胞固定时间(例如至少两小时)后，然后将装有细胞悬浮液5的瓶4安装到装载板6上，瓶4的数量与分析系统30的容器的数量一样多，优选地瓶4的数量与分析载玻片32的数量一样多。然后将吸收片62设置到板6上，以使每个分析载玻片32被设置在装载板6和吸收片62之间。多个滗析井36安装在滗析压机66中。滗析压机66安装在板6的上方，以使每个滗析井36位于如文件FR-2917165所述的分析载玻片32的上方。板6随后被安装到自动设备2中且被安装到自动设备2的支架8上，通过自动设备2的板6和支架8的配合定位装置10和12，以及通过用于验证位置是否正确的按钮14，板6可以被精确地定位。技术人员或使用者打开软件，根据防止在自动设备中的样本的编号和类型选择非常简单的参数设置，并且开始制备工作。读取装置90识别瓶4的视觉标记50和分析载玻片32的视觉标记50，以确定装有待分析溶液的瓶4和待制备的分析载玻片32之间的关联。 采样装置20设置在装有待分析细胞溶液5的瓶4的上方。采样装置20的针或移液管22向下穿过瓶4的盖46的自修复隔膜48直至细胞悬浮液。瓶4中的细胞悬浮液的样本随后通过采样装置20的移液管22被取出。为此,如图7中的箭头F所示,通过移液装置20的移液管22吸取/采样第一体积的细胞溶液，然后将该第一体积排出/排放到细胞溶液中，使得细胞悬浮液5在瓶子中混合。优选地，细胞溶液的第一体积大致在50yL至2000μ 之间。这个步骤的目的是在瓶4的滗析椎体56的壁上打碎/破裂待分析的细胞样本5的细胞簇(cell cluster)。同样，注入瓶内的细胞穿过过滤装置以分解尺寸大于过滤网的尺寸的细胞簇，以允许将获得的样本的二次过滤和样本悬浮液的替换。然后进行对细胞溶液的第一时间段的初始滗析。优选地，第一时间段大致在5分钟到12小时之间，该第一时间段由选择的分析模式而定，例如用15分钟制备分析载玻片。通过这一步骤，能够获得在待分析的感兴趣的细胞和炎症或出血细胞之间的渐变，例如不同的滗析。接下来执行溶液的吸入步骤，这些溶液存放在分析容器中。这个步骤包括i )通过移液装置20吸入一定体积的胶，该胶用于使细胞粘附在分析载玻片32上，无论该分析载玻片的类型或缓冲剂， )如文件FR2919054所述的可选择的一定体积的空气，然后iii)在包含相关细胞的滗析椎体的底部的一定体积的细胞溶液，例如在第一次差分滗析(differential decanting)之后位于溶液下部的细胞。优选地，胶的体积和细胞溶液的体积相等，并且在50 μ L至1000 μ L之间，例如250 μ L。在使用等分管的实施方式中，胶的体积为零。同样优选地，一定体积的细胞溶液的最终采样步骤分为两个步骤第一子步骤称为微混合步骤，然后第二子步骤为吸收需要体积的细胞溶液。微混合步骤包括在瓶的滗析椎体的底部正上方(例如距离为2mm)吸收一定体积的细胞溶液，该体积在20 μ L至200 μ L之间，例如100 μ L，然后移液装置20基本在同一点再次注入采样体积的一部分(例如50μ L)，以避免死体积或残留物100，也就是通过移液装置20的注射力将细胞从滗析椎体56的底部分离，并且在悬浮液中获得高限局性的替换。所述微混合步骤为可选择的，并且能够被通过细胞溶液体积的简单采样步骤而替代。使用适合于引起细胞依附到分析载玻片32的胶就能够使用没有受任何用于细胞依附的特殊处理的载玻片，从而减少待分析细胞溶液的制备和分析的花费。
例如，取250 μ L的胶和100 μ L的包含感兴趣的细胞的细胞溶液，然后将50 μ L的装于移液管中的细胞溶液样本再次注入，并且取出200 μ L的细胞溶液，以使胶或缓冲剂的量与感兴趣的细胞溶液的量相等。然后移液管22被自动驱使以均匀地混合它的内容物(即胶或缓冲剂和如文件FR2919054中所描述的采样的细胞溶液)。这个步骤允许样本在均匀悬浮液中和在胶或缓冲剂中被稀释和替换，接下来为如文件FR-2919054中所描述的稀释方法。在另一种实施方式中，缓冲溶液可以包括标记或着色成分。然后移液装置20被移至滗析井36的上方以将样本分配/放置在滗析室64中，并且以形成包括待分析的细胞涂片的分析载玻片32。细胞涂片通过如文件FR-2917165 (本领域的技术人员可以参考该文件)中描述的滗析井中的样本的沉积而获得。在载玻片上进行第二时间段的第二次滗析。优选地，第二时间段大致在5至60分钟之间，并且分析载玻片的制备时间优选为15分钟。 通过对需被细胞学者诊断的病理的或相关的细胞进行不同的筛选，而对每个待分析的瓶4重复采样步骤和形成载玻片32的步骤。然后通过测量分析载玻片32上的细胞密度，实施分析在滗析井36的底部的细胞沉积的步骤，以提出对所有样本的预先分析检查，这些样本是否用于细胞分析或用于另外的生物学技术(例如文件FR-2922019中所描述的)。这一步骤用于决定细胞悬浮液是否包括具体数量的细胞以获得能够得到可靠的诊断的满意的细胞沉积，以使其自动地再调整样本以获得用于分析载玻片32的合适的细胞密度。这一步骤允许确保从细胞溶液5制备的分析载玻片32的质量监控。根据一种实施方式，细胞沉积分析步骤之后的是自动着色或标记步骤。根据一种实施方式，移液装置20包括多个针(优选为四个或八个)，该多个针能够对多个细胞悬浮液进行制备和分析，并且提高分析载玻片的制备速度。本发明的自动设备能够自动执行涂片或其他薄层细胞的采样。本发明的自动设备2的一个优势为它是完全密封的(从瓶4到分析载玻片32)，从而确保所有溶液和细胞样本的完整性，完全避免污染的风险并且确保操作者的安全(不会吸入固定溶液)。该优势同样产生于将过滤装置和滗析装置结合以获得薄层细胞涂片的瓶的使用。此外，与如文件US 2009/0233331中所描述的自动设备不同，本发明的瓶4被固定地保持在自动设备2的支架上，例如移液装置20、读取装置70和密度分析装置90等其他系统在瓶4的上方可移动，从而确保在实验室中操作的更高的安全性。此外，它能够更好的标准化。所有的样本被有效地提取-通过对包括瓶和其他容器(分析载玻片、等分管、滗析井)的板的精确而固定的定位，在瓶的滗析椎体中的同一点(不超出十分之一毫米)进行提取；-通过移液装置以提取相等的量(不超过一微升)；并且-由于所有的样本以同样的方式提取而同时进行提取。此外，通过将瓶上的盖上的视觉标记50设置为对应于制备容器(例如分析载玻片)的视觉标记，并且使用这些视觉标记的读取装置，从而在分析过程中通过样本序号的计算机管理来实现完全的可跟踪性。
如果需要的话，通过自动设备调节细胞密度以形成分析载玻片的方法允许病理细胞的相对密度增大，同时保持最新型的但信息量大的分析内容，并且提高涂片质量和选择成分的保存。这相比于传统的技术或半自动薄层细胞技术提供了更可靠的解释。此外，瓶或瓶 组的自动制备相比于使用常规技术或使用板自动薄层细胞技术同时允许技术制备时间大幅减少90%。最后，自动化使得建立真正的质量保证系统和薄层沉积的标准化，提高了涂片的再生性并且确保注意到了细胞的完整和读取的方便。还能够显著减小技术和读取的花费。
权利要求
1.一种制备和分析多个细胞悬浮液的方法，该方法包括至少以下连续步骤 (a)将多个瓶(4)安装到装载板(6)上，每个瓶(4)装有待分析的细胞悬浮液(5); (b)将多个分析容器(32、34、36)安装到所述装载板(6)上；以及 (c)从所述瓶(4)中提取所述细胞悬浮液(5)的样本并且将该样本放置到分析容器(34,36)中；对每个待分析的瓶(4)重复步骤(c)； 其特征在于，从所述瓶(4)中提取所述细胞悬浮液(5)的样本并且将该样本放置到分析容器(34、36)中的所述步骤(c)中包括至少一个使用移液-分液装置(20)分散细胞簇的步骤。
2.根据权利要求I所述的方法，其特征在于，从所述瓶(4)中提取所述细胞悬浮液(5)的样本并且将该样本放置到分析容器(34、36)中的所述步骤(c)包括至少一个在所述瓶(4)中混合并过滤所述细胞悬浮液的步骤。
3.根据权利要求I或2所述的方法，其特征在于，从所述瓶(4)中提取所述细胞悬浮液(5)的样本并且将该样本放置到分析容器(34、36)中的所述步骤(c)还包括至少以下步骤 Cd)替换悬浮液中的所述样本； Ce)通过差分滗析选择相关的细胞； (f)使用移液装置(20)吸出由差分滗析而得到的体积(100)，该体积(100)包含所述待分析的样本； (g)替换所述移液装置(20)中的均质悬浮液中的包含所述待分析样本的所述体积(100)； (h)将所述移液装置(20)移至所述分析容器(34、36)的上方； (i)将所述待分析样本分配到所述分析容器(34、36)中。
4.根据权利要求I或3所述的方法，其特征在于，每个所述分析容器包括滗析井(36)和设置为朝向所述滗析井(36)的分析载玻片(32)，并且所述方法包括至少以下连续步骤 (j)在所述装载板(6)上设置吸收片(62)，以使每个所述分析载玻片(32)设置在所述装载板(6)和所述吸收片(62)之间； (k)在压机(66)中安装多个滗析井(36)，并且将该压机(66)设置在所述板(6)的上方，以使每个滗析井(36)设置为位于所述分析载玻片(32)的上方且朝向所述分析载玻片(32);以及 (I)在所述分析载玻片(32 )上形成细胞分析涂片，该细胞涂片通过所述滗析井(36 )中的所述样本的沉积获得； 步骤(j)和步骤(k)在安装多个分析容器的步骤(b)之后且在取细胞悬浮液(5)的样本的步骤(c)之前实施，并且步骤(I)在取细胞悬浮液(5)的样本的步骤(c)之后实施。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述方法包括通过测量所述分析载玻片(32)上的细胞密度以分析在所述滗析井(36)的底部的细胞沉积的步骤。
6.根据权利要求I至5中任一项所述的方法，其特征在于，所述方法包括自动的细胞着色或标记的步骤。
7.根据权利要求I至6中任一项所述的方法，其特征在于，所述方法预先包括绝对地密封装有待分析的所述细胞悬浮液(5)的所述瓶(4)的步骤，所述方法实施之后不必打开所述瓶(4)。
8.根据权利要求I至7中任一项所述的方法，其特征在于，每个分析容器包括采样管或等分管(34)。
9.一种用于制备和分析至少一种细胞悬浮液(5)的自动设备(2)，该自动设备(2)包括 至少一个瓶(4)，该瓶(4)装有待分析的所述细胞悬浮液(5); 至少一个装载板(6)，所述瓶(4)固定且精确地设置和保持在所述装载板(6)上； 至少一个滗析井(36)，该滗析井(36)用于滗析所述细胞悬浮液(5)，所述滗析井(36)固定且精确地设置和保持在所述板(6)上； 分析系统(30)，该分析系统(30)包括至少一个用于接收/容纳所述细胞悬浮液(5)的样本的分析载玻片(32)，所述样本为含有待分析的感兴趣的成分的所述细胞悬浮液(5)的体积部分，所述分析载玻片(32)固定且精确地设置和保持在所述板(6)上，并且位于所述滗析井(36)的下方并且朝向所述滗析井(36)； 其特征在于，所述自动设备(2 )包括移液装置(20 )，该移液装置(20 )能够从所述瓶(4 )中提取出所述细胞悬浮液(5)的样本并且能够将该样本分配到所述分析系统(30)的所述分析载玻片(32)上的所述滗析井(36)内，这些移液装置(30)设置为使得细胞簇分散。
10.根据权利要求9所述的自动设备，其特征在于，所述自动设备包括第一可移动臂，所述移液装置(20)连接于该第一可移动臂，所述第一可移动臂至少在保持所述瓶(4)、所述滗析井(36)和所述分析载玻片(32)的所述装载板(6)的上方移动。
11.根据权利要求9或10所述的自动设备，其特征在于，所述自动设备包括标记或着色溶液，该标记或着色溶液能够通过所述移液装置(20)与所述细胞溶液混合。
12.根据权利要求9至11中任一项所述的自动设备，其特征在于，每个瓶(4)和每个分析载玻片(32)包括视觉标记(50)，并且所述自动设备包括用于读取所述视觉标记(50)的装置(90)。
13.根据引用权利要求9的权利要求12所述的自动设备，其特征在于，所述读取装置(90)包括相机，所述读取装置(90)由第二可移动臂支撑，所述第二可移动臂至少在保持所述瓶(4)、所述滗析井(36)和所述分析载玻片(32)的所述装载板(6)的上方移动。
14.根据权利要求9至13中任一项所述的自动设备，其特征在于，所述瓶(4)包括设置在滗析椎体(56)上方的过滤装置(52)，所述移液装置(20)设置为能够在所述过滤装置(52)的下面提取所述细胞悬浮液(5)的一部分并且将该部分重新注入到所述滗析椎体(56)上，以混合所述细胞悬浮液(5)并且促使所述悬浮液的一部分至少穿过所述过滤装置(52)—次以便分散尺寸大于所述过滤装置的筛孔尺寸的细胞簇。
15.根据权利要求9至14中任一项所述的自动设备，其特征在于，样本的所述分析系统(30 )包括装置(70 )，该装置(70 )用于在所述分析载玻片(32 )上分析位于所述滗析井(36 )的底部的细胞沉积的细胞密度。
16.根据引用权利要求9的权利要求15所述的自动设备，其特征在于，用于在所述分析载玻片(32)上分析位于所述滗析井(36)的底部的细胞沉积的细胞密度的所述装置(70)包括相机(72)。
17.根据权利要求9至16中任一项所述的自动设备，其特征在于，样本的所述分析系统(30)包括用于形成所述样本的虚拟载玻片的设备。
18.根据权利要求17所述的自动设备，其特征在于，所述用于形成所述样本的虚拟载玻片的设备包括相机。
19.根据权利要求13、14或18中任一项所述的自动设备，其特征在于，所述自动设备包括单个相机，该单个相机形成所述读取装置(90)、所述细胞密度分析装置(70)以及用于形成虚拟载玻片的设备。
20.根据权利要求9至19中任一项所述的自动设备，其特征在于，所述自动设备包括支架和按钮(14)，所述支架包括用于至少定位所述板(6)并且能够固定而精确地保持所述板的装置(9、12)，所述按钮(14)至少能够确认所述板(6)的位置。
21.根据权利要求9至20中任一项所述的自动设备，其特征在于，所述自动设备设置为实施根据权利要求I至7中任一项所述的方法。
22.根据权利要求9至21中任一项所述的自动设备，其特征在于，所述细胞悬浮液(5)为细胞的悬浮液。
23.根据权利要求22所述的自动设备，其特征在于，所述细胞的悬浮液包括 体积百分比为80%和95%之间的以下固定溶液 · 590ml的生理盐水， · IOml 的 PEG, ·203ml的异丙醇， ·193ml的纯乙醇； 体积百分比为0. 01%的叠氮化钠； 以及体积百分比为20%和5%之间的浓度为4%的甲醛缓冲液。
全文摘要
本发明涉及一种制备和分析多个细胞悬浮液的方法，该方法包括至少下列连续步骤(a)将多个瓶(4)安装到装载板(6)上，每个瓶(4)装有待分析的细胞悬浮液(5)；(b)将多个分析容器(32、34、36)安装到所述装载板(6)上；以及(c)从所述瓶(4)中提取所述细胞悬浮液(5)的样本，并且将该样本放置到所述分析容器(34、36)中；对每个待分析的瓶(4)重复步骤(c)；从所述瓶(4)中提取所述细胞悬浮液(5)的样本，并且将该样本放置到所述分析容器(34、36)的步骤(c)中包括至少一个使用移液-分液装置(20)分散细胞簇的步骤。本发明同时涉及一种实施所述方法的自动设备。
文档编号G01N35/10GK102812365SQ201180015106
公开日2012年12月5日 申请日期2011年3月21日 优先权日2010年3月22日
发明者E·佩尔蒂埃 申请人:诺维茨公司