专利名称：一种体外检测标记物及其制备方法以及其所制成的试纸条的制作方法
技术领域：
本发明涉及体外检测领域，特别是涉及一种体外检测标记物及其制备方法以及其 所制成的试纸条。
背景技术：
近几十年来，世界范围内的过敏人群日益增多。过敏这一概念通常是指I型超敏 反应(速发型过敏反应)，通常在接触过敏原30分钟后引发症状。引起I型超敏反应的过 敏原大多是来自自然环境的蛋白质，如植物花粉、动物皮毛、食物、尘螨和昆虫毒液。I型超 敏反应的显著特点是过敏原与特异性免疫球蛋白E相结合(SlgE)，因此检测SlgE成为目前 过敏诊断的重要手段。免疫层析法(immunochromatography)是近几年来国外兴起的一种快速诊断技 术，其原理是将特异的抗体先固定于硝酸纤维素膜的某一区带，当该干燥的硝酸纤维素一 端浸入样品(尿液或血清)后，由于毛细管作用，样品将沿着该膜向前移动，当移动至固定 有抗体的区域时，样品中相应的抗原即与该抗体发生特异性结合，若用免疫胶体金或免疫 酶染色可使该区域显示一定的颜色，从而实现特异性的免疫诊断。近年来，提供可靠、即时的检测结果是检验医学发展的方向之一。这种需求促使各 种能在患者身边进行的医学检测(POCT)产品不断推出。20世纪90年代初发展起来的金标 记免疫测定技术，已在临床上得到了广泛的应用，涉及的检测项目包括感染性疾病抗原、抗 体，肿瘤标志物，激素和药物的检测。胶体金对蛋白的吸附主要取决于pH值，在接近蛋白质的等电点或偏碱的条件下， 二者容易形成牢固的结合物。如果胶体金的PH值低于蛋白质的等电点时，则会聚集而失去 结合能力。除此以外胶体金颗粒的大小、离子强度、蛋白质的分子量等都影响胶体金与蛋白 质的结合，从而对诊断检测产生一定影响。由此可见，上述现有的金标记免疫测定技术在使用仍存在缺陷，而亟待加以进一 步改进。如何能创设一种同样能用于快速诊断，且标记物的物理性能稳定，不需要特殊的反 应条件，从而降低实验操作要求，简化操作步骤的新的体外检测标记物及其制备方法以及 其所制成的试纸条，实属当前重要研究课题之一，亦成为当前业界极需改进的目标。

发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种体外检测标记物的制备方法，使其制备出可 替代免疫金颗粒的聚苯乙烯微球，用来标记抗体，完成体外快速诊断。为解决上述技术问题，本发明一种体外检测标记物的制备方法，主要包括以下步 骤:A.将抗体溶于去离子水中，使其浓度达到ImM ;B.将直径0. 3-0. 5um的聚苯乙烯微球储 存液震荡后，取出2ul微球溶液离心；C.除去上清后加缓冲液，并震荡；D.将步骤A的产物 1 10稀释，并取2ul置于步骤C的离心管中；E.加入2.5ul 10mg/ml的EDC，并在震荡混 合均勻后孵育；F.加入表面活性剂并离心；G.除去上清，将沉淀溶于缓冲液，震荡、显微镜计数、保存。作为本发明的一种改进，所述的离心使用Eppendorf离心管，条件为 8000g-10000g 转速离心 l-2min。所述的步骤C中加入的缓冲液为50ul IOOmM的MES，并控制pH值为4. 5。所述的震荡均为剧烈震荡20s。所述的步骤E孵育条件为室温暗室孵育30min。所述的步骤F包括先加入1. Oml 0. 02%的表面活性剂Tween-20并离心；再除去 上清，加入1. Oml 0. 的阴离子表面活性剂SDS、振荡、离心。所述的步骤F包括先加入1. Oml 0. 的阴离子表面活性剂SDS、振荡、离心；再 除去上清，加入1. Oml 0. 02%的表面活性剂Tween-20并离心。所述的步骤G的缓冲液为IOOmM pH值为8. 0的Tris溶液，保存条件为4°C。本发明还提供了根据上述制备方法制成的体外检测标记物，使其物理性能更加稳 定，实验操作更加简单。本发明也提供了由上述体外检测标记物制成的试纸条，使其可用于体外快速诊 断，且不需要特殊反应条件，从而降低实验操作要求，简化操作步骤，克服现有金标记免疫 测定技术的不足与缺陷。为解决上述技术问题，本发明试纸条，包括底板，以及依次固定在底板上的样品 垫、标记区、NC膜和吸水滤纸，其中，标记区分布有上述的体外检测标记物。采用这样的设计后，本发明具有以下优点1、利用带有羧基并染有颜色的聚苯乙烯微球代替免疫层析中用到的胶体金颗粒 标记抗体，能从血清、血浆或全血中检测出是否含有针对过敏原的特异性IgE抗体，检测速 度快；2、聚苯乙烯微球与抗体(或抗原)以化学法连接，在连接的同时并不影响抗体 (抗原)的免疫学活性；3、聚苯乙烯微球与胶体金颗粒相比具有物理性能稳定的特点，因此不需要特殊的 反应条件，实验操作要求低，操作简单一步完成；4、诊断检测结果直观可见。


上述仅是本发明技术方案的概述，为了能够更清楚了解本发明的技术手段，以下 结合附图与具体实施方式
对本发明作进一步的详细说明。图1是本发明中聚苯乙烯与抗体偶联的化学式。图2是本发明体外检测检测试纸条的结构示意图。图3是本发明体外检测检测试纸条的检测结果示意图。
具体实施例方式本发明体外检测检测标记物的制备方法主要包括以下步骤步骤A.将抗体溶于去离子水中，使其浓度达到ImM(毫摩尔每升)。步骤B.将直径0. 3-0. 5um(优选0. 4um)的聚苯乙烯微球储存液剧烈震荡20s，取出2ul微球溶液至Eppendorf离心管中，8000g-10000g转速离心l_2min。前述聚苯乙烯微 球储存液是连有羧基并已经染色的现有产品。步骤C.除去上清后，加入50ul IOOmM的缓冲液MES (2-吗啉乙磺酸)，控制pH值 为4. 5，剧烈震荡20s。步骤D.将步骤A的产物1 10稀释，并取2ul置于步骤C的离心管中。步骤E.加入2. 5ul新鲜配制的10mg/ml的EDC (二氯乙烷)，并在剧烈震荡20s混 合均勻后，室温暗室孵育30min，聚苯乙烯与抗体偶联的化学式请参阅图1所示。步骤Fl.加入1. Oml 0. 02 %的表面活性剂Tween-20至已偶联的微球中， 8000g-10000g 转速离心 l-2min。步骤F2.除去上清，将偶联的微球溶于1.0ml 0. 1 %的阴离子表面活性剂 SDS (十二烷基硫酸钠)中，剧烈震荡20s、8000g-10000g转速离心l_2min。上述步骤Fl、F2的顺序可调。步骤G.除去上清，将沉淀溶于IOOmM Tris缓冲溶液(pH 8. 0)，剧烈震荡20s，显 微镜下观察、计算获得的微球数量后，置于4°C冰箱保存。请参阅图2所示，利用上述方法制成的体外检测标记物所制成的试纸条，主要由 底板1，以及依次搭接固定在底板1上的样品垫2、标记区3、NC膜4和吸水滤纸5组成。其 中，NC膜4由硝酸纤维素膜制成，可根据需要包被有羊抗人IgE的多克隆抗体，其他组成部 分均由非吸水介质制成，且标记区3分布有经上述步骤制备的体外检测标记物。通常本发 明试纸条可设计为长60-80毫米、宽3-4毫米、厚1-2毫米。请配合参阅图3所示，以豚草过敏诊断为例来说明本发明试纸条的检测过程及结 果。先将试纸条水平放置，在样品垫中滴加入30ul待测病人血清，等待15分钟然后判读结 果，其中图2 (A)分别在检测区(T)及控制区(C)各出现一条红色条带，显示检测结果为阳 性；图2(B)仅在控制区(C)出现一条红色带，显示检测结果为阴性；图2(C)在控制区(C)未出现红色带，则表明不正确的操作或试剂无效，需重新进 行检测试验。本发明将红色的聚苯乙烯微球代替胶体金与抗人IgE抗体连接，包被在吸水的或 不吸水的固态介质中；硝酸纤维素膜上喷抗原(过敏原)。当血清样品流过标记区的时侯， 血清中的I gE抗体被标记在微球上的抗人IgE抗体捕获结合并向前继续爬行，血清样品中 的特异性IgE抗体与包被在硝酸纤维素膜上的抗原结合，沉淀从而显色。本发明体外检测检测试纸条不仅可以用来检测吸入类过敏原(如豚草、猫毛、狗 毛、艾蒿等)和食物类过敏原；还可以用来检测分子量较高的大分子物质，例如多肽、蛋白 质、抗原、半抗原以及抗体；或激素、维生素、药物、代谢物；或类固醇、维生素。以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非对本发明作任何形式上的限制，本 领域技术人员利用上述揭示的技术内容做出些许简单修改、等同变化或修饰，均落在本发 明的保护范围内。
权利要求
一种体外检测标记物的制备方法，其特征在于主要包括以下步骤A.将抗体溶于去离子水中，使其浓度达到1mM；B.将直径0.3 0.5um的聚苯乙烯微球储存液震荡后，取出2ul微球溶液离心；C.除去上清后加缓冲液，并震荡；D.将步骤A的产物1∶10稀释，并取2ul置于步骤C的离心管中；E.加入2.5ul 10mg/ml的EDC，并在震荡混合均匀后孵育；F.加入表面活性剂并离心；G.除去上清，将沉淀溶于缓冲液，震荡、显微镜计数、保存。
2.根据权利要求1所述的体外检测标记物的制备方法，其特征在于所述的离心使用 Eppendorf离心管，条件为8000g_10000g转速离心l_2min。
3.根据权利要求1所述的体外检测标记物的制备方法，其特征在于所述的步骤C中加 入的缓冲液为50ul IOOmM的MES,并控制pH值为4. 5。
4.根据权利要求1所述的体外检测标记物的制备方法，其特征在于所述的震荡均为剧 烈震荡20s。
5.根据权利要求1所述的体外检测标记物的制备方法，其特征在于所述的步骤E孵育 条件为室温暗室孵育30min。
6.根据权利要求1所述的体外检测标记物的制备方法，其特征在于所述的步骤F包括先加入1. Oml 0. 02%的表面活性剂Tween-20并离心；再除去上清，加入1.0ml 0. 的阴离子表面活性剂SDS、振荡、离心。
7.根据权利要求1所述的体外检测标记物的制备方法，其特征在于所述的步骤F包括先加入1. Oml 0. 的阴离子表面活性剂SDS、振荡、离心； 再除去上清，加入1. Oml 0. 02%的表面活性剂Tween-20并离心。
8.根据权利要求1所述的体外检测标记物的制备方法，其特征在于所述的步骤G的缓 冲液为IOOmM pH值为8. O的Tris溶液，保存条件为4°C。
9.根据权利要求1-8中任一项所述的方法制成的体外检测标记物。
10.根据权利要求9所述的体外检测标记物制成的试纸条，其特征在于包括底板，以及 依次固定在底板上的样品垫、标记区、NC膜和吸水滤纸，其中，标记区分布有权利要求9所 述的体外检测标记物。
全文摘要
本发明是有关于一种体外检测标记物的制备方法，包括A.将抗体溶于去离子水中，使其浓度达到1mM；B.将直径0.3-0.5μm的聚苯乙烯微球储存液震荡后，取出2μl微球溶液离心；C.除去上清后加缓冲液，并震荡；D.将步骤A的产物1∶10稀释，并取2μl置于步骤C的离心管中；E.加入2.5μl 10mg/ml的EDC，并在震荡混合均匀后孵育；F.加入表面活性剂并离心；G.除去上清，将沉淀溶于缓冲液，震荡、显微镜计数、保存。本发明产品可用于体外快速诊断，且标记物的物理性能稳定，不需要特殊的反应条件，从而降低实验操作要求，简化操作步骤。
文档编号G01N33/532GK101893622SQ20101022017
公开日2010年11月24日 申请日期2010年6月28日 优先权日2010年6月28日
发明者李纪阳 申请人:北京海瑞祥天生物科技有限公司