专利名称：检测血液或尿液中同型半胱氨酸含量的方法
技术领域：
本发明涉及一种检测血液或尿液中同型半胱氨酸含量的方法。
背景技术：
同型半胱氨酸作为独立的心血管风险指标已被广泛接受，是高血脂、吸烟、糖尿病之外的又一危险因子。同型半胱氨酸除与血管疾病有关外，还与神经管畸形、先兆子痫、帕金森病、胎儿生长缓慢、慢性肾功能衰竭等多种疾病及某些药物、肿瘤的影响有关。目前，同型半胱氨酸的定量测定主要采用酶免试剂盒方法，但酶免试剂盒方法具有时间长、价格高， 准确性低，不能大规模应用等缺点。而我们建立的液相串联质谱的检测方法是一种简单、高效、灵敏且准确度高的定量测定方法，为大规模应用提供了必要条件。

发明内容
本发明的目的是提供一种特异性强、准确度和灵敏度高、分析时间短的检测血液或尿液中同型半胱氨酸含量的方法。本发明所提供的检测血液或尿液中同型半胱氨酸含量的方法，包括如下步骤将标品、待测样本分别和内标溶液混勻，加入基质溶液，混勻；加入巯基乙醇、二硫苏糖醇或三O-氯乙基)磷酸酯(TCEP)混勻，静置IOmin ；加入质量百分含量10%的三氯乙酸，高速离心，取上清液，用去离子水稀释，与流动相一起流经色谱柱进入液相-质谱分析，最终测定血液或尿液中同型半胱氨酸的含量。本发明的检测血液或尿液中同型半胱氨酸含量的方法，其中所述基质溶液为质量百分含量4%的牛血清蛋白溶液、生理盐水或空白血浆溶液。本发明的检测血液或尿液中同型半胱氨酸含量的方法，其中所述流动相为水 有机相=90 10，其中所述水相含有体积百分含量0.2%的甲酸，所述有机相中含有体积百分含量0. 的甲酸。本发明的检测血液或尿液中同型半胱氨酸含量的方法，其中所述TCEP的浓度为 120g/L。本发明的检测同型半胱氨酸含量的方法以同位素为内标，使得目标化合物的识别更为准确，同时更好的消除了系统误差，定量结果更为准确。添加基质溶液，模拟体液环境， 消除基质效应，提高了同型半胱氨酸的回收率。以巯基乙胺为还原试剂，可以将与蛋白质残基结合的同型半胱氨酸全部还原出来，以游离形式存在。本发明用10%的三氯乙酸除蛋白， 除去蛋白的效率较高。用去离子水稀释上清液可以降低三氯乙酸的浓度，结合较小的进样量，降低离子抑制作用。本发明的检测同型半胱氨酸含量的方法，简便、快速、准确，不仅可以应用于大规模样本检测，而且定量准确。


图1为标准品(同型半胱氨酸)的色谱图。
图2为内标品(D4-同型半胱氨酸)的色谱图。图3为血清中同型半胱氨酸的色谱图。图4为血清中内标(D4-同型半胱氨酸)色谱图。图5为同型半胱氨酸质谱图。图6为内标D4-同型半胱氨酸质谱图。
具体实施例方式步骤1 用移液器移取标品和内标溶液，涡旋仪混勻；同时平行移取待测样本和内标溶液涡旋混勻；步骤2 向上述混合液中加入基质溶液(质量百分含量4%的牛血清蛋白溶液、生理盐水或空白血清溶液)，涡旋混勻；步骤3 分别加入巯基乙胺、巯基乙醇、二硫苏糖醇或120g/L TCEP，充分混勻；步骤4:静置 IOmin ；步骤5 加入除蛋白试剂试剂(质量百分含量10%的三氯乙酸)，涡旋混勻，高速离心；步骤6 取上清液，用去离子水稀释；步骤7 取上清溶液，由液相自动进样器进样，经液相色谱柱的色谱分离，经质谱分析，最终定量分析血液或尿液中同型半胱氨酸的含量。液相色谱条件样品经液相的自动进样器进样，流动相为水有机相=90 10，其中水相含有 0. 2%的甲酸，有机相中含有0. 1 %的甲酸，等度洗脱分离，流速200 μ L/min,进样量3 μ L。 色谱柱 discovery C18 (SUPELCO, HPLC, 5cm*2. lmm, 5 μ m)三重四级杆串联质谱仪条件ESI离子源，正离子扫描；MRM模式，扫描时间2. 5min，喷雾电压5000V，鞘气 (氮气)30psi，辅助气(氮气)lOpsi，毛细管温度450°C，碰撞气(氮气)1. 5mTorr ；m/z 136 — 90,m/z 136 — 118 作为 Hcy 的特征定性离子对，m/z 140 — 94,m/z 140 — 122 作为内标D4-Hcy的特征定性离子对，m/z 136 — 90用于Hcy定量，CE为MeV，扫描时间0. 5s, 扫描宽度lu。四种还原试剂对测定值的影响见表1，采用巯基乙胺还原的样本，其最终产物的色谱峰强度小于其他3种还原试剂还原的样本色谱峰强度。表1.不同还原试剂测定值结果比较
权利要求
1.检测血液或尿液中同型半胱氨酸含量的方法，包括如下步骤将标品、待测样本分别和内标溶液混勻，加入基质溶液，混勻；加入巯基乙醇、二硫苏糖醇或TCEP混勻，静置IOmin ；加入质量百分含量10%的三氯乙酸，高速离心，取上清液，用去离子水稀释，与流动相一起流经色谱柱进入液相-质谱分析，最终测定血液或尿液中同型半胱氨酸的含量。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述基质溶液为质量百分含量4%的牛血清蛋白溶液、生理盐水或空白血浆溶液。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于所述TCEP的浓度为120g/L。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于所述流动相为水有机相=90 10，其中所述水相含有体积百分含量0. 2 %的甲酸，所述有机相中含有体积百分含量0. 1 %的甲酸。
全文摘要
本发明公开了一种检测血液或尿液中同型半胱氨酸含量的方法，包括如下步骤将标品、待测样本分别和内标溶液混匀，加入基质溶液，混匀；加入巯基乙醇、二硫苏糖醇或TCEP混匀，静置10min；加入质量百分含量10％的三氯乙酸，高速离心，取上清液，用去离子水稀释，与流动相一起流经色谱柱进入液相-质谱分析，最终测定血液或尿液中同型半胱氨酸的含量。本发明的检测同型半胱氨酸含量的方法，简便、快速、灵敏，不仅可以应用于大量样本筛查，而且定量准确、特异性强。
文档编号G01N30/72GK102565252SQ201010581678
公开日2012年7月11日 申请日期2010年12月9日 优先权日2010年12月9日
发明者倪君君, 宋彦强, 崔学峰, 李玮, 韩鎏 申请人:北京国立柏林医学科技发展有限公司