专利名称：用于单细胞检测的多功能探针的制作方法
技术领域：
本实用新型属于单细胞检测领域的多功能探针，特别涉及玻璃管表面的薄膜热电偶的制作，PH敏感微电极以及离子浓度微电极制作。
背景技术：
人们对生命现象的观察和研究已经深入到单细胞、单分子的水平，如何在这样一个尺度范围内获取有用的生物理化信息对各个研究领域均提出了新的要求。单细胞检测技术的应用渐渐成为现代分析研究的主流领域之一。可进行实时、在线、原位、活体检测的分子探针和超微型生物传感器成为人们研究的热点和重点。其中德国马普生物物理研究所Neher和^tkmarm在1976年创建了膜片钳技术，这是一种以记录通过离子通道的离子电流来反映细胞膜单一的(或多个的离子通道分子活动的技术)。以后由于吉欧姆阻抗封接方法的确立和几种方法的创建。这种技术点燃了细胞和分子水平的生理学研究的革命之火，它和基因克隆技术并架齐驱，给生命科学研究带来了巨大的前进动力。这一伟大的贡献，使Neher和Mkmarm获得1991年度的诺贝尔生理学与医学奖。发展至今，已经成为现代细胞电生理的常规方法，它不仅可以作为基础生物医学研究的工具，而且直接或间接为临床医学研究服务，目前膜片钳技术广泛应用于神经(脑) 科学、心血管科学、药理学、细胞生物学、病理生理学、中医药学、植物细胞生理学、运动生理等多学科领域研究。基于膜片钳技术，在探测细胞膜离子电流的同时测量其他的生物信号，如细胞内的温度、PH值、离子浓度等，则可为研究单细胞的生命过程提供更多的理化参数，为单细胞基础研究提供研究工具，也可作为药物筛选提供高效的工具。
发明内容技术问题本实用新型的目的在于提供一种用于单细胞检测的多功能探针，可同时检测多种生理信号的单细胞探针，为测量单细胞理化参数和研究细胞生命过程提供新的研究工具。技术方案本实用新型的用于单细胞检测的多功能探针包括细胞内测温薄膜热电偶和三个微电极，所述的三个微电极为膜电位测量和离子通道检测微电极，PH值测量微电极，离子浓度检测微电极；所述三个微电极都为圆锥形，三个微电极紧靠在一起，三个微电极的圆锥尖位于同一方向；所述测温薄膜热电偶由两种金属薄膜和绝缘层组成，其中两种金属薄膜在三个微电极的外侧尖端形成测温结，其余部分相互绝缘。三个微电极通过含有三内管芯的玻璃管热处理拉制而成。所述PH值测量微电极，采用PH敏感液膜、PH敏感玻璃或固态PH传感器实现。所述离子浓度测量微电极，采用离子敏感玻璃或离子敏感聚合物膜。所述的测温薄膜热电偶，采用可溅射或蒸镀的靶材；其中选择钼-钨、钼-金、 钼-银或钼-铜在常温下有较大热电动势差的金属材料对，或使用铜镍-铜、钼铑-钼、镍铬-铜镍商用合金材料对。所述所述绝缘层采用SiA或MgO，通过磁控溅射绝缘材料实现。有益效果通过此方法得到的单细胞检测探针，在实现传统的离子通道、膜电位测量功能的同时，也可实现细胞内外温度的测量，以及细胞内PH值和离子浓度。其中温度测量功能提供的温度反馈也进一步的提高了 PH值测量的精度。

图1是本实用新型多功能探针结构示意图。图2是本实用新型第二步，在其中一根微管内使用PH敏感玻璃和使用PH敏感材料液膜。图3是本实用新型第三步，在其中一根微管内使用离子敏感玻璃和离子敏感聚合物膜。图4是本实用新型第四步，在玻璃电极外侧制作的薄膜热电偶。以上图中包含测温薄膜热电偶11，膜电位测量和离子通道检测微电极12，PH值测量微电极13，离子浓度检测微电极14 ；玻璃微电极21，PH敏感玻璃22，PH敏感玻璃尖端封接23，PH敏感玻璃和玻璃微电极内壁封接M，PH敏感液膜25 ；玻璃微电极31，离子敏感玻璃32，离子敏感玻璃尖端封接33，离子敏感玻璃和玻璃微电极内壁封接34，离子浓度敏感聚合物膜35 ；玻璃微电极41，薄膜热电偶42 ；金属薄膜一 43，绝缘层44，金属薄膜二 45。
具体实施方式
本实用新型用于单细胞检测的多功能探针，包括细胞内测温薄膜热电偶11和三个微电极，所述的三个微电极为膜电位测量和离子通道检测微电极12，PH值测量微电极 13，离子浓度检测微电极14 ；所述三个微电极都为圆锥形，三个微电极紧靠在一起，三个微电极的圆锥尖位于同一方向；所述测温薄膜热电偶11由两种金属薄膜和绝缘层组成，其中两种金属薄膜在三个微电极的外侧尖端形成测温结，其余部分相互绝缘。其中三根管芯分别实现膜片钳基本功能(膜电位测量、离子通道、微注射)，PH测量功能，离子浓度测量功能。制备方法为第一步通过玻璃电极拉制仪拉制三芯玻璃电极，通过热抛光处理，使电极尖端变得更加光滑，从而可提高与细胞膜的封接率。第二步，在其中一根微管内集成PH敏感传感器，可以使用PH敏感玻璃，采用热封接的方法，或者采用PH敏感材料液膜法。第三步，在其中另一根微管内集成离子浓度敏感传感器。可以使用离子敏感玻璃， 和离子敏感材料聚合物膜。第四步，在玻璃电极外侧，使用溅射或蒸镀的方法，制备金属薄膜以及绝缘层。实例首先选用含三内管的硼硅酸玻璃管，IOcm长，单管外径1mm，内径0. 75mm，无细丝。 在玻璃电极拉制仪上拉制出尖端直径为Ium的玻璃微电极，通过热抛光处理使电极尖端变得更加光滑，从而可提高封接率。
4[0025]其次选用PH敏感玻璃管和钾离子敏感玻璃管，长10cm，管外径为0. 7mm,内径为 0. 35mm，无细丝。通过玻璃电极拉制仪拉制出尖端直径0. 2um的玻璃电极，通过环形热处理，使尖端封接闭合。控制两根玻璃微电极插入含三内管的玻璃电极中的其中两根，并缓缓插入至最尖端。然后在两根电极的末端通入氮气并维持一定的气压，同时利用热处理对其进行加热，使内管外壁和外管内壁封接。通过磁控溅射在硼硅酸玻璃管外壁溅射IOOnm厚的钼金属薄膜，钼金属薄膜外侧溅射覆盖20nm厚的S^2绝缘层，通过离子束刻蚀去除尖端SiO2层，使钼金属薄膜在玻璃管尖端裸露出来，在最外层溅射IOOnm厚的金薄膜。这样就在硼硅酸玻璃管外壁尖端形成了钼-金热电偶测温结。
权利要求1.一种用于单细胞检测的多功能探针，其特征在于该探针包括细胞内测温薄膜热电偶 (11)和三个微电极，所述的三个微电极为膜电位测量和离子通道检测微电极(12)，PH值测量微电极(13)，离子浓度检测微电极(14)；所述三个微电极都为圆锥形，三个微电极紧靠在一起，三个微电极的圆锥尖位于同一方向；所述测温薄膜热电偶(11)由两种金属薄膜和绝缘层组成，其中两种金属薄膜在三个微电极的外侧尖端形成测温结，其余部分相互绝缘。
2.按权利要求1所述的用于单细胞检测的多功能探针，其特征在于，三个微电极通过含有三内管芯的玻璃管热处理拉制而成。
3.按权利要求1所述的用于单细胞检测的多功能探针，其特征在于，所述PH值测量微电极(13)，采用PH敏感液膜、PH敏感玻璃或固态PH传感器实现。
4.按权利要求1所述的用于单细胞检测的多功能探针，其特征在于，所述离子浓度测量微电极(14 )，采用离子敏感玻璃或离子敏感聚合物膜。
5.按权利要求2所述的用于单细胞检测的多功能探针，其特征在于所述的测温薄膜热电偶(11)，采用可溅射或蒸镀的靶材；其中选择钼一鹤、钼-金、钼-银或钼-铜在常温下有较大热电动势差的金属材料对，或使用铜镍-铜、钼铑-钼、镍铬-铜镍商用合金材料对。
6.按权利要求2所述的用于单细胞检测的多功能探针，其特征在于所述绝缘层采用SiO2或1%0，通过磁控溅射绝缘材料实现。
专利摘要本实用新型所述用于单细胞检测的多功能探针包括温度测量、膜电位测量和离子通道检测、pH检测、离子浓度检测。该探针包括细胞内测温薄膜热电偶(11)和三个微电极，所述的三个微电极为膜电位测量和离子通道检测微电极(12)，PH值测量微电极(13)，离子浓度检测微电极(14)；所述三个微电极都为圆锥形，三个微电极紧靠在一起，三个微电极的圆锥尖位于同一方向；所述测温薄膜热电偶(11)由两种金属薄膜和绝缘层组成，其中两种金属薄膜在三个微电极的外侧尖端形成测温结，其余部分相互绝缘。可以实现多参数的共同测量，有助于更好的研究亚细胞层面的结构与性质。
文档编号G01N15/10GK202330238SQ20112026864
公开日2012年7月11日 申请日期2011年7月27日 优先权日2011年7月27日
发明者汪长岭, 顾宁 申请人:东南大学