专利名称：一种结核病抗原特异的全血t细胞检测方法
—种结核病抗原特异的全血T細胞检测方法本发明涉及结核杆菌检测技术领域，具体地说是ー种结核病抗原特异的全血T细胞检测方法。结核病是由结核分枝杆菌(Macobacteriumtubercuolosis)感染所导致的以呼吸系统感染为主的慢性传染病，迄今仍是全球范围内単一病原体引起死亡人数最多的传染性疾病，是全球关注的公共卫生和社会问题，也是我国把重点控制的主要疾病之一。结核分枝杆菌感染后约10%会发展为活动性结核，而大部分成为无症状感染者。即使初始的结核感染被成功控制后，一些细菌仍然以不增殖或者低增殖水平的休眠状态存在于宿主体内， 这种感染状态称为结核潜伏感染，无临床症状。无症状感染者在免疫能力低下时(免疫系统发育不全、衰退、或免疫抑制等)则较易发展成活动性结核，是隐形感染者中的高危人群。因此，能否早期、准确地检测活动性结核病以及潜伏性结核感染(latent tuberculosisinfection LTBI)的病患，将极大地影响着全球结核病预防控制的效果。因此,寻■求快速、简便、有效、廉价的检测方法很有实际意义。临床上常用的辅助结核病检测的方法，結核菌素皮肤试验(tuberculin skin test, TST)就是利用检测结核分枝杆菌感染的细胞免疫功能的方法，所需费用较少，简单易行，用于结核病的检测的历史已超过100年。但是，TST所应用的结核分枝杆菌纯化的蛋白衍生物(purified protein derivative of tuberculin)PPD是分枝杆菌培养液中200多种成分的混合物，这种蛋白混合物是结核分枝杆菌、牛分枝杆菌BCG和大多数的环境分枝杆菌所共有，因而缺乏特异性。当直接检测结核分枝杆菌病原体、结核分枝杆菌的相关抗体的灵敏度特异性仍然不能满足结核病检测的要求吋，科学家们想通过间接的办法来检测结核分枝杆菌的感染。结核分枝菌感染的免疫反应主要是由T淋巴细胞介导的细胞免疫反应，机体感染结核分枝杆菌后会产生特异性致敏T淋巴细胞，利用此T淋巴细胞在体外激活能产生一系列效应过程的原理，来检验个体是否感染过结核分枝杆菌。近100年来，在结核病检测方面最为重要的进展之一是基于IFN- Y的检测分祈。这个方法的原理是当特异性的致敏T淋巴细胞再次接触相同的抗原时便被激活而分泌IFN- Y，通过检测IFN- Y的量而进行检测。1991年，Wood等最早使用酶联免疫吸附法(ELISA)或酶联免疫斑点法(Enzyme-linked immunospot assay, ELISP0T)在体外检测特异性T淋巴细胞分泌IFN-Y的量，从而对农场的13091头牛进行了检查，检测的敏感性为76. 89Γ93. 6%，特异性为96. 2% 98. 1%，灵敏度高于TST65. 6%。但该方法仍然有如下二方面不足一是检测周期过长，需要两天时间，ニ是操作繁琐，对操作人员和操作环境要求很高，不适于基层推广。本发明是针对上述检测方法的困难和不足之处，提出一种结核病抗原特异的全血T细胞检测方法。为了实现上述目的，本发明设计ー种结核病抗原特异的全血T细胞检测方法，其特征在于将结核杆菌特异抗原表位肽，MHC供体和受检者的外周全血孵育，直接检测MHC供体-结核分枝杆菌抗原表位-特异性T细胞形成的复合物的信号。该应用方法包括以下步骤，a.对所述的结核杆菌特异抗原表位肽进行标记，并与MHC供体孵育制备标记表位肽-MHC供体复合物；采集受检者的外周静脉血样本；b.用步骤(a)得到的复合物刺激外周静脉血中的T淋巴细胞，37°C度培养箱静止培养 O. 5-16h, c.收集培养T细胞，d.检测MHC供体-结核分枝杆菌抗原表位-特异性T细胞形成的复合物的信号。该特异抗原表位具有结核分枝杆菌特异性，包含且不限于ー种或几种结核杆菌特异抗原所含的表位。所述的结核杆菌抗原来源的细菌菌种仅限于结核分枝杆菌的不同型别及由这些型别衍生的细菌菌株。所述的结核杆菌特异抗原是天然抗原、重组抗原或肽及其它可能用于识别结核分枝杆菌特异性T细胞受体的物质。所述的结核杆菌抗原是抗原本身或抗原缀合物或衍生物。所述的MHC供体包括且不限于天然含MHC的细胞，人工构建的MHC单体、MHC ニ聚体、MHC四聚体。所述的复合物信号检测包括且不限于通过表位肽标记物、TCR标记物及其它可用于抗原特异性TCR识别检测的标记物、⑶3的标记。本发明可实现对结核病病人和感染者早期、快速、特异的检测，整个检测2-3小时即可完成，对操作人员和操作环境要求较低，特别是无须在无菌环境下手动操作和自动化操作。本发明提出的结核病抗原特异的全血TCR检测具有以下优势一是检测需要的时间短，较为快速，共需要2-4小吋。而结核杆菌培养检测需时间1-2月，TST检测需要3天。ELISP0T方法需要2天。由于结核杆菌一旦感染人体，首先就会被机体的免疫系统所识别，激活体液和细胞免疫应答，发生时间在感染后1-2个月，因此利用我们的细胞免疫学检测方法即可作出检测。X光片检测只有在感染者肺部出现明显的病理改变后才可作出检测，这通常需要很长的时间。抗原抗体检测法也只有在疾病症状处于活动期的情况下检测，但环境中分枝杆菌广泛存在，其与结核杆菌的共同抗原，可干扰实验的检测结果。ニ是特异检测，由于采用的是结核杆菌特异性的抗原，只与结核杆菌感染人体后产生的免疫记忆T细胞被识别。三是敏感性高，与TST检测相比，结核病抗原特异的TCR检测检测的敏感性为97. 2%，特异性高达92. 3%，具有良好的检测符合率(k = 0. 70)。因此，本发明提出结核病抗原特异的全血TCR检测试剂及其应用方法，对结核病的控制和消灭具有重要意义。下面结合具体实施例，进ー步阐明本发明。应理解这些实施例仅用于说明本发明而不是用于限制本发明的范围，本专利涉及表位肽包括且不限于下表中表位肽。下列实施例中未注明具体的实施方法，通常是按照实验室技术常规或市场公开销售的试剂盒的说明书进行。结核分枝杆菌感染人体后，首先会被人体的免疫系统识别，激活机体的T细胞免疫应答，发挥抗结核感染作用。部分T细胞转化为免疫记忆细胞，当再次与结核杆菌抗原表位肽相遇后，被特异性TCR识别。因此如果采用结核杆菌特异的抗原在体外被感染者和患者的T细胞识别，而非结核杆菌感染者或非结核病患者T细胞不能被识别，从而实现检测的目的。实施例中涉及表位肽组合如下表所示
权利要求
1.一种结核病抗原特异的全血T细胞检测方法，其特征在于将结核杆菌特异抗原表位肽，MHC供体和受检者的外周全血孵育，直接检测MHC供体-结核分枝杆菌抗原表位-特异性T细胞形成的复合物的信号。
2.如权利要求I所述的结核病抗原特异的全血T细胞检测方法，其特征在于该应用方法包括以下步骤， a.对所述的结核杆菌特异抗原表位肽进行标记，并与MHC供体孵育制备标记表位肽-MHC供体复合物；采集受检者的外周静脉血样本； b.用步骤(a)得到的复合物刺激外周静脉血中的T淋巴细胞，37°C度培养箱静止培养0.5-16h, c.收集培养T细胞， d.检测MHC供体-结核分枝杆菌抗原表位-特异性T细胞形成的复合物的信号。
3.如权利要求I或2所述的结核病抗原特异的全血T细胞检测方法，其特征在于该特异抗原表位具有结核分枝杆菌特异性，包含且不限于一种或几种结核杆菌特异抗原所含的表位。
4.如权利要求I或2所述的结核病抗原特异的全血T细胞检测方法，其特征在于所述的结核杆菌抗原来源的细菌菌种仅限于结核分枝杆菌的不同型别及由这些型别衍生的细菌菌株。
5.如权利要求I或2所述的结核病抗原特异的全血T细胞检测方法，其特征在于所述的结核杆菌特异抗原是天然抗原、重组抗原或肽及其它可能用于识别结核分枝杆菌特异性T细胞受体的物质。
6.如权利要求I或2所述的结核病抗原特异的全血T细胞检测方法，其特征在于所述的结核杆菌抗原是抗原本身或抗原缀合物或衍生物。
7.如权利要求I或2所述的结核病抗原特异的全血T细胞检测方法，其特征在于所述的MHC供体包括且不限于天然含MHC的细胞，人工构建的MHC单体、MHC 二聚体、MHC四聚体。
8.如权利要求I或2所述的结核病抗原特异的全血T细胞检测方法，其特征在于所述的复合物信号检测包括且不限于通过表位肽标记物、TCR标记物及其它可用于抗原特异性TCR识别检测的标记物、⑶3的标记。
全文摘要
本发明涉及结核杆菌检测技术领域，具体地说是一种结核病抗原特异的全血T细胞检测方法，将结核杆菌特异抗原表位肽，MHC供体和受检者的外周全血孵育，直接检测MHC供体-结核分枝杆菌抗原表位-特异性T细胞形成的复合物的信号。本发明可实现对结核病病人和感染者早期、快速、特异的检测，整个检测2-3小时即可完成，多操作人员和操作环境要求较低，特别是无须在无菌环境下手动操作和自动化操作。
文档编号G01N33/569GK102680684SQ20121018364
公开日2012年9月19日 申请日期2012年6月6日 优先权日2012年6月6日
发明者孙战强, 张舒林, 李荣秀 申请人:孙战强, 张舒林, 李荣秀