专利名称：：一种有机物可生化性的评价方法
技术领域：
：本发明涉及一种有机物可生化性的评价方法，属于环境污染物环境行为评价领域。
背景技术：
：生物法处理有机废物具有费用低、易操作、无二次污染等优点，近年来广泛受到了许多研究者的重视。采用生物法处理，必须考虑目标污染物的可生化性情况。目前常用的可生化性评价指标有B0D5/C0D、B0D/TOC、B0D5/T0C等，其中最为常用的评价指标是BOD5/COD。纵观这些评价指标，都涉及到了BOD5测定。BOD5是五日生化需氧量，是指水温20°C、培养5d，微生物分解水中有机物所消耗的溶解氧量。由于水中的饱和溶解氧是有限的，因此必须对高浓度的有机物进行稀释测定。通常把0.3作为有机物可生化性的分界点B0D5/C0D>0.3,有机物生化性较好，且比值越大可生化性越好；B0D5/C0D=0.3，有机物生化性一般；B0D5/C0D<0.3，有机物生化性较差，且比值越小可生化性越差。在实际运用过程中，B0D5/C0D存在以下两个缺点①忽略了有机物的浓度对有机物可生化性的影响有些有机物在浓度较低时能被微生物所利用，在高浓度时则会抑制微生物的生长繁殖。若采用稀释法测定BOD5则忽略了这种抑制作用，会得出错误的评价结果；②测定周期较长，且测定过程较为复杂=BOD5测定一般需要5d，测定周期过长，且前期准备工作较为复杂，准备不充分将会影响评价结论。如稀释接种水准备不当，曝气不充分将会影响溶解氧的含量，从而将会严重影响结果的准确性以及可靠性。近几年国内外公开发表的文献资料检索显示，研究者提出了多种有机物可生化性的评价方法，来替代B0D5/C0D等经典评价方法。这些评价方法都是基于BOD5进行适当的修正，因此还是无法避免BOD5测定过程中存在的内在缺陷。为了彻底解决上述问题，急需一种新的有机物可生化性的评价方法。
发明内容为解决现有评价方法存在的不足和缺陷，本发明提供了一种有机物可生化性的评价方法，该方法采用指示剂TTC(2，3，5-氯化三苯四氮唑)分光光度法，可以测定不同浓度梯度的单一有机物或混合有机物对微生物活性的影响，且方法简单，操作便捷，48h内就可获得可靠的测定结果。本发明采用的技术方案是一种有机物可生化性的评价方法，所述方法包括(1)测定吸光度值采用96孔微孔平板作为反应体系，各孔加入驯化的活性污泥和显色剂2，3，5-氯化三苯四氮唑(TTC)，再分别加入梯度浓度的待测有机物，30°C恒温培养(24h96h)，每24h测定96孔吸光度值；测定同一浓度下待测有机物的所有吸光度值，计算获得该浓度下有机物的平均吸光度值；所述活性污泥取自污水处理厂曝气池；所述活性污泥从曝气池中取出后，通常需要空曝1012h，以去除其中残留有机物；96孔微孔平板使用前需用去离子水洗净，彻底去除孔内残留的有机物，自然干燥后于紫外灯下灭菌30min；(2)采用标准化OD值评价有机物的可生化性取有机物同一浓度不同时刻测得吸光度值中的最大值，计算该吸光度值与相应浓度下的平均吸光度值的比值Rsi；如果Rsi值>1，说明微生物能利用该浓度下的该有机物，Rsi值越大则说明该有机物可生化性越好；如果Rsi值<1，说明微生物较难利用该浓度下的该有机物，Rsi值越小则说明该有机物可生化性越差。通常的，所述步骤(1)中有机物梯度浓度范围为101000mg/L。所述步骤(1)中每孔加样量为有机物用量为IOOyL/孔，活性污泥用量为30μL/孔，0.1%(w/w)的2，3，5-氯化三苯四氮用量为20μL/孔。按照本发明方法，评价所得有机物可生化性实际是相对的可生化性，实际操作过程中，由于微生物自身活性可能会有所不同，因此为了评价结果更为准确，所述方法可同时以葡萄糖(生化性优)、乙酸异丁脂(生化性良好)或苯(生化性较差)中的一种或多种于相同条件下进行检测评定作为参照，若上述三种标准物质测得可生化性能与其实际性能相符，则表示检测所用微生物活性正常，评价结果较为准确；若测得可生化性能与其实际性能不符，则可能微生物活性异常，需另外选取活性污泥重新进行评价。96孔可分为标准物质区和待测样品区，分别为48孔。标准样品区内，每种物质做两个平行，共6排；待测样品区内按实际样品个数确定。每排前两孔为空白孔，一孔只含有活性污泥液30微升和TTC溶液20微升，另一孔只含有一定浓度的有机物溶液100微升和TTC溶液20微升，不足量用去离子水补足。96孔微平板放置于28°C恒温恒湿培养箱，24h或48h利用多功能读数仪测定96孔吸光度值；扣除空白孔吸光度值后，计算相同浓度孔的吸光度平均值，根据以下公式计算Rsi<formula>formulaseeoriginaldocumentpage4</formula>如果Rsi>1，说明微生物能利用这种有机物，Rsi值越大则说明这种有机物可生化性越好；如果有机物Rsi<1，说明微生物较难利用这种有机物，Rsi值越小则说明这种有机物可生化性越差。本发明所采用的评价方法的原理脱氢酶是一种还原酶，有机物的降解过程中都需要这种酶的参与。若脱氢酶活受到抑制，则说明该有机物的可生化性不佳。TTC(2，3，5-三苯基氯化四氮唑)是一种染色剂，当被细菌细胞吸收后能接受细胞脱氢酶中的氢，还原成一种红色且稳定的物质，从而引起吸光度值的变化。细菌大量繁殖，则吸光度会大幅度增力口。因此，TTC可从某种程度上综合表征微生物的活性。本发明所采用的评价方法不仅可用于测定单一有机物的可生化性，也可用于测定混合有机物的可生化性，特别适用于那些未知成分的混合物；本发明所采用的评价方法还可确定待测物质可生化性的浓度范围，避免了传统BOD5测定过程中因稀释而引起的结果偏差。本发明的有益效果主要体现在本发明评价方可以测定单一有机化合物的可生化性，也可测定未知成分的混合物的可生化性，方法简单，操作便捷，48h内就可获得可靠的测定结果，同时也避免了高倍稀释带来的测定误差。图1为96孔微平板加样示意图。具体实施例方式下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此本发明重点是一种有机物可生化性的评价方法，对不同有机物或混合有机物具有通用性。实施例考察了不同类型、不同浓度有机物的可生化性，并与经典BOD5/COD指标进行了对照，以确定该评价方法的适用性、准确性。实施例1单一有机物的可生化性评价及评价结果与B0D5/C0D指标比较实施方案具体为选取丙酮、戊酸钠、苯胺、苯酚、二氯甲烷和1-氯苯等六种工业应用中常见的物质作为待测物质，标准物质为葡萄糖(强)、乙酸异丁脂(一般)和苯(差)，浓度均为150mg/L。取自污水处理厂曝气池的活性污泥空曝12h后，用无菌水稀释成107CFU/mL，同时96孔微平板洗净灭菌。每种待测物质上样孔为8个，其中4个以去离子水代替待测物质作为空白孔，用于扣除活性污泥溶液自身具有的颜色(吸光度)。标准物质上样方式同待测物质。150微升测试液包括30微升活性污泥液，20微升0.TTC溶液，100微升待测物质or标准物质/去离子水溶液。96孔微平板放置于28°C恒温恒湿培养箱，24h或48h利用多功能读数仪测定96孔吸光度值，计算每种物质的Rsi。同时，根据国标法《HJ/T399-2007水质化学需氧量的测定快速消解分光光度法》和《GB7488-87水质五日生化需氧量(B0D5)的测定、稀释与接种法》分别测定每种物质的COD和BOD5，计算相应的B0D5/C0D。每种物质的Rsi值和B0D5/C0D比值结果如表1所示。表1:Rsi和B0D5/C0D结果比较<table>tableseeoriginaldocumentpage5</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>表1结果表明，根据判定标准，六种物质的Rsi与B0D5/C0D所得的结论是一致的，且两者变化的趋势也是相似的。本发明所采用的评价方法可以替代bod5/COD测试法，用来快速准确评价单一有机化合物的可生化性。实施例2不同浓度有机物的可生化性评价及评价结果与B0D5/C0D指标比较实施方案具体为选取丙酮、戊酸钠和1-氯苯等三种工业应用中常见的物质作为待测物质，标准物质为葡萄糖、乙酸异丁脂和苯。活性污泥空曝12h后，用无菌水稀释成107CFU/mL,同时96孔微平板洗净灭菌。每种待测物质上样孔为16个，其中4个以去离子水代替待测物质作为空白孔，用于扣除活性污泥溶液自身具有的颜色(吸光度)；余下孔作为浓度梯度孔，依次为10mg/L、50mg/L、100mg/L、250mg/L、500mg/L和1000mg/L，每种浓度作平行样，共计12个孔。标准物质上样方式同待测物质。150微升测试液包括30微升活性污泥液，20微升0.1%TTC溶液，100微升待测物质or标准物质/去离子水溶液。96孔微平板放置于28°C恒温恒湿培养箱，24h或48h利用多功能读数仪测定96孔吸光度值，计算每种物质的Rsi。同时，根据国标法《HJ/T399-2007水质化学需氧量的测定快速消解分光光度法》和《GB7488-87水质五日生化需氧量(BOD5)的测定、稀释与接种法》分别测定每种物质不同浓度的COD和BOD5,计算相应的B0D5/C0D。每种物质的Rsi值和B0D5/C0D比值结果如表2所示。表2不同浓度的有机物Rsi和B0D5/C0D的比较<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>__符合符合符合符合符合符合<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>表2结米表明，同种物质的可生化性与其浓度有较大的关系，特别是浓度较高的有机物溶液以及那些可生化性较差的物质。当丙酮浓度达到500mg/L和1000mg/L时，本发明所采用的评价方法得出的结论是可生化性有一定程度的下降(Rsi)，但是B0D5/C0D比值仍在0.3以上，可能会误认为高浓度的丙酮溶液生化性较好。造成这种误差是由于BOD5测定过程中存在稀释接种这一步骤，高浓度的丙酮溶液在测定过程中被稀释成低浓度，因而其生化性有了改变，所得的B0D5/C0D比值只能反映稀释状态下的可生化性特性。而对于戊酸钠和1-氯苯，虽然两种方法得出的结论几乎是一致的，但由于这两种物质本身具有的性质(无论浓度高低，其可生化性均不佳)，掩盖了因稀释而造成的测量误差。综上所述，本发明所采用的评价方法可以弥补B0D5/C0D测定过程中因稀释造成的实验误差，并可以得出有机化合物可生化性的浓度范围。实施例3混合有机化合物的可生化性评价及评价结果与B0D5/C0D指标比较由于实际应用中，目标污染物通常是混合物，故采用本发明的评价方法对混合有机化合物的可生化性进行评价，并与BOD5/COD指标比较。实施方案具体为采用真空紫外处理α-菔烯废气，在不同湿度(23%、3545%和7585%)、不同反应介质(高纯氮气和标准空气)的条件下进行光解，用磷酸缓冲溶液(ρΗ7.2)吸收光解产物，此吸收液作为待测物质，标准物质仍为葡萄糖、乙酸异丁脂和苯。活性污泥空曝12h后，用无菌水稀释成107CFU/mL，同时96孔微平板洗净灭菌。测定每种光解吸收液的总可溶性有机碳(TOC)，以确保每孔加入的有机物含量(浓度)保持相对一致，从而确保测定结果相对准确。每种光解吸收液上样孔为8个，其中2个以去离子水代替待测物质作为空白孔，用于扣除活性污泥溶液自身具有的颜色(吸光度)；余下孔作为浓度梯度孔，依次为5mg/L、10mg/L和20mg/L，每种浓度作平行样，共计6个孔。标准物质上样方式同待测物质。150微升测试液包括30微升活性污泥液，20微升0.1%TTC溶液，100微升待测物质or标准物质/去离子水溶液。96孔微平板放置于28°C恒温恒湿培养箱，24h或48h利用多功能读数仪测定96孔吸光度值，计算每种光解吸收液的Rsi。同时，根据国标法《HJ/T399-2007水质化学需氧量的测定快速消解分光光度法》和《GB7488-87水质五日生化需氧量(BOD5)的测定、稀释与接种法》分别测定每种光解吸收液的COD和BOD5(总可溶性有机碳含量相一致)，计算相应的B0D5/C0D。每种光解吸收液的Rsi值和B0D5/C0D比值结果如表3所示。表3混合有机化合物Rsi和BOD5ZiCOD1<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>注1表3只列举了其中一个浓度梯度的Rsi和B0D5/C0D，其他浓度梯度情况类似。表3结果表明，本发明所采用的评价方法可以用来评价混合有机物的可生化性，所得的结果和BOD5/cod结果相一致。不同光解条件下吸收液含有的可溶性有机碳(TOC)量在增加，说明光解产物种类和数量在发生变化，因而其可生化性均不相同。本发明所采用的评价方法可以在实际运用中用来判断采用生物净化的方法处理目标污染物的可行性。特别是对于那些成分复杂而又无法准确得知其中成分的工业污染物，采用本评价方法将快速而又准确的地得出相应的结论。权利要求一种有机物可生化性的评价方法，所述方法包括(1)测定吸光度值采用96孔微孔平板作为反应体系，各孔加入驯化的活性污泥和显色剂2，3，5-氯化三苯四氮唑，再分别加入梯度浓度的待测有机物，30℃恒温培养，每24h测定96孔吸光度值；同一浓度下的待测有机物不同时刻测得的吸光度值分别取平均值，获得该浓度下有机物的平均吸光度值；所述活性污泥取自污水处理厂曝气池；(2)采用标准化OD值评价有机物的可生化性取有机物同一浓度不同时刻测得吸光度值中的最大值，计算该吸光度值与相应浓度下的平均吸光度值的比值Rsi；如果Rsi值＞1，说明微生物能利用该浓度下的该有机物，Rsi值越大则说明该有机物可生化性越好；如果Rsi值＜1，说明微生物较难利用该浓度下的该有机物，Rsi值越小则说明该有机物可生化性越差。2.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述步骤(1)中有机物梯度浓度范围为101000mg/L。3.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述步骤(1)中每孔加样量为有机物用量为100μL/孔，活性污泥用量为30μL/孔，2，3，5-氯化三苯四氮唑浓度为0.1%，用量为20μL/孑L。4.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述方法同时以葡萄糖、乙酸异丁脂或苯于相同条件下进行检测评定作为参照。全文摘要本发明提供了一种有机物可生化性的评价方法，涉及有机物环境行为评价方法及技术。为了解决BOD5测定过程中因稀释而存在的测量误差和测定周期过长的问题，本发明采用生长指示剂TTC分光光度法测定有机化合物对微生物活性的影响，从而确定有机化合物的可生化性；采用统计平均的方法计算相应的Rsi值待测有机物Rsi＞1，说明微生物能利用这种有机物，Rsi值越大则说明这种有机物可生化性越好；待测有机物Rsi＜1，说明微生物较难利用这种有机物，Rsi值越小则说明这种有机物可生化性越差。本发明采用的评价方法简单快捷，可以测定单一有机化合物的可生化性，也可测定未知成分的混合物的可生化性，同时也避免了高倍稀释带来的测定误差。文档编号G01N21/31GK101799406SQ20101013330公开日2010年8月11日申请日期2010年3月26日优先权日2010年3月26日发明者成卓韦,蒋轶锋,陈建孟申请人:浙江工业大学