专利名称：胶乳增强免疫比浊法测定血清或尿液中心脏型脂肪酸结合蛋白的试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明属于医学检验学领域，涉及一种免疫检测试剂盒，特别地，本发明涉及一种测定血清或尿液中心脏型脂肪酸结合蛋白的试剂盒。
背景技术：
脂肪酸结合蛋白(FABP)是一族分子量为14_16kD的胞内蛋白质，至少包括肝、小肠、心、脑、肾、骨骼肌、脂肪组织、回肠、表皮的9种类型，各类型之间具有不同的免疫学差另IJ。心脏型脂肪酸结合蛋白(H-FABP)是存在于心肌细胞胞浆内的可溶性蛋白质，分子量15kD，占心肌内蛋白含量的4±8%，由132个氨基酸构成，呈酸性(pi = 5)，参与细胞脂肪酸的摄取、转运和代谢。H-FABP在心肌细胞胞浆与血液中的比值为200，000 1，在骨骼肌 的浓度不到心肌里的十分之一，在远端肾小管、脑组织的特殊部位、乳腺、胎盘内含量更低。而肌红蛋白在骨骼肌的浓度是心肌里的两倍。正常条件下血流中几乎检测不到H-FABP，极微量的H-FABP可能与破坏的骨骼肌持续释放H-FABP有关，当心肌细胞受损时，H-FABP释放并迅速进入血循环，因与其它FABP在免疫学上具有特异性，不会发生交叉反应，故对心肌损伤的诊断特异性较强。另外，H-FABP通过肾脏代谢，以原形排出，所以肾功能不全时血里H-FABP的浓度会升高。急性心肌梗死(AMI)是一种严重威胁人类健康的疾病。自20世纪80年代中后期早期溶栓的应用，使AMI的治疗发生了革命性转变，病死率显著下降，而实施上述再灌注治疗的前提，是在AMI发病的早期迅速确诊。为此，人们一方面使用肌钙蛋白(cTnl)、肌酸激酶同工酶(CK-MB)等传统的诊断指标，另一方面则致力于寻求更敏感、更特异的血清(浆)新标志物。心型脂肪酸结合蛋白就是一种新的AMI早期诊断标志物，其作为AMI早期的诊断指标，受骨骼肌损害的影响极小，对心肌损伤的诊断有显著的特异性，在急性心肌梗死患者发病早期，特别是在发病的1-3个小时内，血液和尿中H-FABP的浓度就有明显的升高，6-8小时内将达到高峰，24-30小时后回落到正常。因此H-FABP在AMI发生后的6个小时内，较目前常用的肌红蛋白(MYO)、肌钙蛋白和CK-MB心肌梗死标志物，具有更高的敏感性、特异性和准确性，能更早地提示心肌细胞的损伤情况，对早期快速排除是否由于心肌梗死引发的胸痛，以及判断心肌梗死的严重程度等具有重要的临床意义。目前，已知心脏型脂肪酸结合蛋白测定方法有放射免疫法(RIA)、酶联免疫吸附法(ELISA)、免疫层析等，但临床应用的预期效果都不理想，如放射免疫分析步骤繁琐，试剂价格昂贵，需使用配套的仪器且存在放射性污染；免疫层析多为定性检测，灵敏度低；酶联免疫吸附法存在检测时间长，操作复杂，重复性差、不适用于急诊和临床病人及时诊断的需要。胶乳增强免疫比浊法具有操作简单、快速、灵敏度高、可应用于自动生化分析仪等优点，如能开发出可在全自动生化分析仪上使用的免疫比浊试剂用于检测血清或尿液中的心脏型脂肪酸结合蛋白，将为临床AMI的诊断及治疗提供强有力的支持。

发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的不足和缺点，提供一种具有高灵敏度和宽线性范围的心脏型脂肪酸结合蛋白检测试剂盒，同时还具有测值准确，操作简单、快速可用于门急诊检测且仪器适用面广等优点，所述试剂盒包括试剂R1、试剂R2和校准品，其中，a)试剂Rl包含防腐剂、稳定剂、表面活性剂、反应促进剂、电解质和缓冲液；b)试剂R2包含结合有抗心脏型脂肪酸结合蛋白单克隆抗体和多克隆抗体的胶乳颗粒、防腐剂、稳定剂、表面活性剂、电解质和缓冲液；
c)校准品包含防腐剂、稳定剂、电解质、心脏型脂肪酸结合蛋白纯品和缓冲液。特别地，本发明涉及一种单多抗复合的胶乳增强免疫比浊试剂用于测定血清或尿液中心脏型脂肪酸结合蛋白，包括试剂R1、试剂R2和已知浓度的心脏型脂肪酸结合蛋白抗原校准品，其中a)本发明所述试剂盒的试剂Rl是一种使样本中H-FABP特异的抗原位点充分暴露，有利于与抗心脏型脂肪酸结合蛋白抗体充分结合的，包含占其质量百分比为0. 01%~ I. 0%防腐剂、0. 05% 5. 0%的稳定剂、0. 01% 3. 0%的表面活性剂、0. 01% 10. 0%的反应促进剂、0. 01% 5. 0%的电解质、pH 6. 5 8. 5的10 200mmol/L的缓冲液；b)本发明所述试剂盒的试剂R2包含结合有鼠抗人H-FABP单克隆抗体和羊抗人或兔抗人H-FABP多克隆抗体的致敏胶乳颗粒，可特异性识别并结合血清或尿液中的H-FABP抗原，包括占其质量百分比为0. 1% 0.8%的50 250nm胶乳颗粒、0.01% 1.0%防腐剂、0. 05% 15. 0%的稳定剂、0. 01% 3. 0%的表面活性剂、0. 01% 5. 0%的电解质、pH6. 5 8. 5的10 200mmol/L的缓冲液；c)本发明所述的H-FABP校准品，用来与样本比较进行结果计算，包括占其质量百分比为:0. 01% I. 0%防腐剂、0. 05% 5. 0%的稳定剂、0. 01% 5. 0%的电解质、根据需要的H-FABP校准品浓度添加的相应量的心脏型脂肪酸结合蛋白纯品及pH 6. 5 8. 5的10 100mmol/L的缓冲液。本发明所述的H-FABP校准品中使用的心脏型脂肪酸结合蛋白纯品提取自人心肌组织。本发明所述的H-FABP校准品的浓度可以是高浓度单点校准品，在使用时用生理盐水稀释成多个不同浓度的校准品，也可以直接制备成多个不同浓度的校准品。本发明采用单克隆抗体和多克隆抗体复合包被胶乳颗粒的方法，可以同时保证高线性和灵敏度，与现有的心脏型脂肪酸结合蛋白试剂盒相比较，测定结果准确性大大提高。本发明中所使用的抗心脏型脂肪酸结合蛋白单抗为鼠抗人单克隆抗体，抗心脏型脂肪酸结合蛋白多抗为羊抗人多克隆抗体或兔抗人多克隆抗体，特别地，本发明所使用的鼠抗人H-FABP单克隆抗体可以多于一种，即可以为几种抗H-FABP特异性单抗的混合，以识别更多的抗原表位，使得所述试剂盒具有更高的灵敏度。本发明中所使用的鼠抗人H-FABP单抗、羊抗人H-FABP多抗或兔抗人H-FABP多抗，对于本领域技术人员而言可购得或制备，市售抗体可以购自于芬兰Hytest公司。本发明所述试剂盒的试剂R2中胶乳颗粒与抗心脏型脂肪酸结合蛋白单克隆抗体的结合可以采用物理吸附法或化学交联法制备，优选化学交联法。本发明中所使用的反应促进剂可以是聚乙二醇2000、聚乙二醇4000、聚乙二醇6000、聚乙二醇8000、溴化乙二甲胺、聚凝胺的一种或几种，优选聚乙二醇6000。本发明中所使用的防腐剂选自叠氮钠、叠氮锂、山梨酸钾、苯甲酸钠、亚硝酸钠、PC300中的一种或几种，优选叠氮钠。本发明中所使用的电解质可以是钠离子或镁离子，优选钠离子。本发明中所使用的缓冲液可以是甘氨酸缓冲液、Tris缓冲液、HEPES缓冲液、PIPES缓冲液、硼酸盐缓冲液或磷酸缓冲液、优选甘氨酸缓冲液。本发明中所使用的表面活性剂为非离子型表面活性剂和/或阴离子型表面活性齐U，优选地，所述表面活性剂为非离子型表面活性剂和阴离子型表面活性剂的复配使用，其中非离子型表面活性剂选自 Tween20、Tween40、Tween60、Span40、Span80、TritonX-100 中的一种或几种，阴离子型表面活性剂选自SDS、脂肪醇聚氧乙烯磺酸钠、聚茴脑磺酸钠、脱氧胆酸钠中的一种或几种。本发明中所使用的稳定剂选自蛋白质、无机盐、金属络合剂、助悬剂和抗氧化剂中的一种或几种。特别的，所述的蛋白质为牛血清白蛋白或明胶；所述的无机盐选自氯化钠、氯化钾或氯化镁中的一种或几种，优选氯化钠；所述的金属络合剂为含有氨基二乙酸基团的络合剂，选自EGTA、EDTP, DTPA, EDTA中的一种或几种；所述的助悬剂选自乙二醇、丙三醇、乳糖、蔗糖、麦芽糖中的一种或几种；所述抗氧化剂选自2，6_ 二叔丁基对甲酚、叔丁基对羟基茴香醚、没食子酸丙酯中的一种或几种。本发明采用胶乳增强免疫比浊法，开发出可检测血清和尿液中H-FABP的试剂。胶乳增强免疫比浊法的反应原理是包被了高特异性抗体的胶乳颗粒，与样本中相应的H-FABP抗原发生特异性结合，形成不溶性的抗原-抗体-胶乳颗粒复合物，产生一定的浊度，其浊度高低与样本中的H-FABP抗原浓度成正比关系，在一定波长下进行浊度测定，即可测得样本中被检测H-FABP的含量。本发明中，选取的检测波长为340-800nm，优选500_750nm。采用本发明所述的试剂盒测定血清或尿液中H-FABP时，先将样本与试剂Rl混匀后孵育5分钟，然后加入试剂R2，测定反应第0. 5分钟和第5分钟的吸光度值(Al、A2)，计算吸光度差值，根据校准曲线得到样本中H-FABP的含量。本发明采用6点定标法，以样条函数作为计算模式，绘制出校准曲线。本发明所述的试剂盒，用于测定血清或尿液中H-FABP，与现有技术相比，具有特异性好、灵敏度高、准确性好、线性范围宽等优点；另外，进行检测时操作简便适用于全自动生化分析仪，大幅度提高了检测效率。


图I :由实施例I得到的本发明试剂盒I与ELISA试剂盒A测定结果的相关性。图2 :由实施例2得到的本发明试剂盒2与进口试剂盒B测定结果的相关性。图3 :由实施例I得到的本发明试剂盒I线性的测定结果。图4 :进口试剂盒B线性的测定结果。
具体实施例方式实施例I
胶乳增强免疫比浊法测定血清或尿液中心脏型脂肪酸结合蛋白的试剂盒一、试剂盒主要成分及浓度如下试剂Rl Tris 缓冲液pH8.0 50mmol/L
叠氮钠0.05%
牛血清白蛋白0.5% 氯化钠1%
PEG-60003%
Tween-200.1%
聚茴脑磺酸钠0.05%试剂R2
甘氨酸缓冲液pH 8.0 40mmol/L
叠氮钠0.05%
氯化钠0.5%
Tween-200.05%
牛血清白蛋白0.1%
蔗糖10%包被有鼠抗人H-FABP单克隆抗体和羊抗人H-FABP多克隆抗体的致敏胶乳颗粒胶乳粒径160nm胶乳浓度0.2%H-FABP 校准品
Tris 缓冲液pH7.4 20mmol/L
叠氮钠0.1%
牛血清白蛋白1%
氯化钠0.8%按照需要的H-FABP参考校准品浓度将相应的心脏型脂肪酸结合蛋白纯品120 u g/L加入上述缓冲液，制备得120 u g/L浓度的H-FABP参考校准品，在使用时使用生理盐水稀释成多浓度参考校准品(120 u g/L、60 u g/L、30 u g/L、15 u g/L、7. 5 u g/L)。试剂Rl为无色透明液体，R2为乳白色液体，校准品为浅黄色透明溶液。二、试剂盒测定方法分析方法两点终点法；反应方向上升反应校准方式Spline
测定波长700nm测定温度37 °CRl R2 样本=100 100 8 U I操作步骤将100 U I试剂Rl加入8 U I样本，于37度孵育5分钟后加入100 U I试剂R2，反应开始0. 5分钟时读取第一点，反应5分钟后读取第二点。使用奥林巴斯AU400全自动生化分析仪。采用6点定标方法，校准品浓度分别0. 0 ii g/L、7. 5 U g/L、15 U g/L、30 U g/L、60 u g/L、120 u g/L。实施例2胶乳增强免疫比浊法测定血清或尿液中心脏型脂肪酸结合蛋白的试剂盒一、试剂盒主要成分及浓度如下试剂Rl
Tris 缓冲液50mmol/L pH7.5
甘氨酸0.4%
叠氮钠0.05%
牛血清白蛋白0.1% 氯化钠2%
PEG-60005%
Triton X-1000.2%
聚茴脑磺酸钠0.05%试剂R2:
甘氨酸缓冲液pH 8.0 40mmol/L
叠氮钠0.05%
氯化钠0.5%
牛血清白蛋白0.1%
蔗糖10%
Triton X-1000.07%包被有鼠抗人H-FABP单克隆抗体和兔抗人H-FABP多克隆抗体的致敏胶乳颗粒胶乳粒径160nm胶乳浓度0.2%
H-FABP 校准品Tris 缓冲液pH7.4 20mmol/L
叠氮钠0.1%
牛血清白蛋白1.0%
氯化钠0.5%按照需要的H-FABP参考校准品浓度将相应的心脏型脂肪酸结合蛋白纯品分别加入上述缓冲液中，制备得浓度为IOOii g/L、50i i g/L、25ii g/L、12. g/L、6. 25 u g/L的多浓度H-FABP参考校准品。试剂Rl为无色透明液体，R2为乳白色液体，校准品为浅黄色透明溶液。二、试剂盒测定方法分析方法两点终点法；反应方向上升反应校准方式Spline测定波长700nm测定温度37°CRl R2 样本=100 100 8 U I操作步骤将100 U I试剂Rl加入8 U I样本，于37度孵育5分钟后加入100 U I试剂R2，反应开始0. 5分钟时读取第一点，反应5分钟后读取第二点。使用奥林巴斯AU400全自动生化分析仪。采用6点定标方法，校准品浓度分别0. Ou g/L、6. 25 U g/L、12. 5 U g/L,25 U g/L、50 u g/L、100 u g/L。实施例3心脏型脂肪酸结合蛋白试剂盒的性能评价I.相关性将按照实施例I配制的本发明试剂盒I与市售采用酶联免疫吸附法(ELISA)测定的试剂盒A(购自美国Biocheck公司)做相关性实验。检测50份新鲜人血清(包含正常和异常样本)，按照各自测定方法进行测定，对测定值进行相关分析(结果见图1，X，Y轴均为测定值，单位ng/ml)。相关系数R2 = 0.913，回归方程为y = 0. 837x+0. 845，结果表明本发明试剂与酶联免疫吸附法ELISA有良好的相关性。相关性实验数据如表I所示将按照实施例2配制的本发明试剂盒2与市售进口试剂盒B做相关性实验。检测50份新鲜人血清(包含正常和异常样本)，按各自说明书进行测定，对测定值进行相关分析(结果见图2，X，Y轴均为测定值，单位ng/ml)。相关系数R2 = 0. 982，回归方程为y =0. 846x+0. 549，结果表明本发明试剂与试剂盒B有很好的相关性。相关性实验数据如表I所示试剂盒B的试剂组成如下Rl :缓冲液、叠氮钠< 0. 1% w/vR2 :包被有鼠抗人H-FABP单克隆抗体的胶乳增强免疫比浊试剂、叠氮钠< 0. I %w/v表I
权利要求
1.ー种胶乳增强免疫比浊法測定血清或尿液中心脏型脂肪酸结合蛋白的试剂盒，包括试剂R1、试剂R2和已知浓度的心脏型脂肪酸结合蛋白抗原校准品，其中 a)试剂Rl包含表面活性剤、反应促进剂、防腐剤、稳定剂、电解质和缓冲液； b)试剂R2包含结合有抗心脏型脂肪酸结合蛋白单克隆抗体和多克隆抗体的胶乳颗粒、防腐剤、稳定剂、表面活性剤、电解质和缓冲液； c)校准品包含防腐剤、稳定剂、电解质、心脏型脂肪酸结合蛋白纯品和缓冲液。
2.根据权利要求I所述的试剂盒，其特征在于所述抗心脏型脂肪酸结合蛋白单克隆抗体为鼠抗人单克隆抗体，抗心脏型脂肪酸结合蛋白多克隆抗体为羊抗人多克隆抗体或兔抗人多克隆抗体。
3.根据权利要求I所述的试剂盒，其特征在于所述胶乳颗粒为粒径在50 250nm之间的聚苯こ烯胶乳，胶乳颗粒占试剂R2的质量百分比为O. 1% O. 8%。
4.根据权利要求I所述的试剂盒，其特征在于该试剂盒包括试剂R1、试剂R2和已知浓度的心脏型脂肪酸结合蛋白抗原校准品，其中 a)试剂Rl包含质量百分比为0.01% 1.0%防腐剤、O. 05% 5.0%的稳定剂、O. 01% 3. O %的表面活性剤、O. 01% 10. O %的反应促进剂、O. 01% 5. 0%的电解质和pH 6. 5 8. 5的10 200mmol/L的缓冲液； b)试剂R2包含O.1% O. 8%的结合有抗心脏型脂肪酸结合蛋白抗体的50 250nm胶乳颗粒，还包含质量百分比为0. 01% 1.0%防腐剤、O. 05% 15. O %的稳定剂、O.01% 3. O %的表面活性剤、O. 01% 5. 0%的电解质和pH 6. 5 8. 5的10 200mmol/L的缓冲液； c)校准品包含质量百分比为0.01% 1.0%防腐剤、O. 05% 5.0%的稳定剂、O.01% 5. 0%的电解质、根据需要的H-FABP校准品浓度添加的相应量的心脏型脂肪酸结合蛋白纯品及pH 6. 5 8. 5的10 lOOmmol/L的缓冲液。
5.根据权利要求1-4任一项所述的试剂盒，其特征在于所述心脏型脂肪酸结合蛋白纯品提取自人心肌组织。
6.根据权利要求1-4任一项所述的试剂盒，其特征在于所述的稳定剂选自蛋白质、无机盐、金属络合剂、助悬剂和抗氧化剂中的ー种或几种。
7.根据权利要求6所述的试剂盒，其特征在于，所述的蛋白质选自牛血清白蛋白或明胶；所述的无机盐选自氯化钠、氯化钾或氯化镁中的ー种或几种；所述的金属络合剂为含有氨基ニこ酸基团的络合剂，选自EGTA、EDTP, DTPA、EDTA中的ー种或几种；所述的助悬剂选自こニ醇、丙三醇、乳糖、蔗糖、麦芽糖中的ー种或几种；所述抗氧化剂选自2，6_ ニ叔丁基对甲酚、叔丁基对羟基茴香醚、没食子酸丙酯中的ー种或几种。
8.根据权利要求1-4任一项所述的试剂盒，其特征在于所述的防腐剂选自叠氮钠、叠氮锂、山梨酸钾、苯甲酸钠、亚硝酸钠、PC300中的ー种或几种。
9.根据权利要求1-4任一项所述的试剂盒，其特征在于所述的缓冲液选自甘氨酸缓冲液、Tris缓冲液、HEPES缓冲液、PIPES缓冲液、硼酸盐缓冲液或磷酸缓冲液，优选地，所述缓冲液是甘氨酸或Tris缓冲液。
10.根据权利要求1-4任一项所述的试剂盒，其特征在于所述的表面活性剂为非离子型表面活性剂和/或阴离子型表面活性剤，优选地，所述表面活性剂为非离子型表面活性剂和阴离子型表面活性剂，其中非离子型表面活性剂选自Tween20、Tween40、Tween60、Span40、Span80、Triton X-IOO中的ー种或几种，阴离子型表面活性剂选自SDS、脂肪醇聚氧こ烯磺酸钠、聚茴脑磺酸钠、脱氧胆酸钠中的ー种或几种。
11.根据权利要求1-4任一项所述的试剂盒，其特征在于所述的反应促进剂选自聚こニ醇2000、聚こニ醇4000、聚こニ醇6000、聚こニ醇8000、溴化こニ甲胺、聚凝胺的ー种或几种。
12.根据权利要求1-4任一项所述的试剂盒，其特征在于所述的电解质为ー价金属离子和ニ价金属离子中的ー种或几种，优选地，所述电解质选自钠离子和/或镁离子。
全文摘要
本发明涉及胶乳增强免疫比浊法测定血清或尿液中心脏型脂肪酸结合蛋白的试剂盒，具体地，提供的心脏型脂肪酸结合蛋白检测试剂盒包括试剂R1、试剂R2和校准品，其中试剂R1包含反应促进剂、防腐剂、表面活性剂、稳定剂、电解质及缓冲液；试剂R2包含结合有抗心脏型脂肪酸结合蛋白单克隆抗体和多克隆抗体的胶乳颗粒、防腐剂、表面活性剂、稳定剂、电解质及缓冲液；校准品包含防腐剂、电解质、稳定剂、心脏型脂肪酸结合蛋白纯品及缓冲液。本发明采用单克隆抗体和多克隆抗体复合包被胶乳颗粒的方法保证了试剂盒的高灵敏度和宽线性范围，同时还具有准确度高、重复性好、特异性强、操作简单等优点，可用于临床常用的全自动生化分析仪。
文档编号G01N21/31GK102628864SQ20111045451
公开日2012年8月8日 申请日期2011年12月30日 优先权日2011年12月30日
发明者刘希, 蔡华雅, 陈婧, 高爱民 申请人:北京九强生物技术股份有限公司