专利名称：一种动物源性食品中残留庆大霉素的可视化蛋白芯片检测方法
技术领域：
本发明涉及ー种动物源性食品中残留庆大霉素的可视化蛋白芯片检测方法，属于食品安全监瞀或食品分析的免疫分析技术领域。
背景技术：
庆大霉素属氨基糖苷类抗生素，抗生素作为兽药和饲料添加剂被广泛应用，可能会造成抗生素在动物源性食品中的残留。对于牛奶等乳制品，抗生素残留不仅会影响乳制品的品质，如严重影响发酵乳制品的生产，降低产量及破坏后期产品风味，给生产者造成经济损失，而且会对人体造成极大的危害，如引起人体的过敏反应(如皮疹、过敏性休克等)，抑制肠道中正常的敏感菌群的生长，使致病菌、念珠菌大量増殖而导致全身或局部感染，并且会导致人体对抗生素产生抗药性，给临床治疗带来不可估量的危害。目前，牛奶、蜂蜜、·家禽、水产中的抗生素残留已引起消费者的高度重视，因此，加强抗生素的残留检测尤为重要。庆大霉素常用的检测方法有理化检测法和免疫法。理化检测法以HPLC和HPLC-MS为主，但是该法对设备要求高，技术难度大，对技术人员要求高，操作繁琐，不适合现场监控和大量样本的筛查。

发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种可半定量或定量检测动物源性食品中庆大霉素含量的可视化蛋白芯片方法，在于弥补现有抗生素同时半定量、定量检测技术的空白。满足对该种抗生素进行快速筛选的要求，提供ー种快速，高灵敏度，低成本的检测动物源性食品中庆大霉素的可视化蛋白芯片检测方法。为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案如下方法一定量检测方法。—种动物源性食品中残留庆大霉素的可视化蛋白芯片检测方法，该方法依次顺序包括如下步骤(I)以牛血清白蛋白(BSA)为空白对照，将牛血清白蛋白和庆大霉素-载体蛋白偶联物通过生物芯片点样仪进行点样操作，点样板孔内分别加入lOSOyL的牛血清白蛋白和1(T50 u L的庆大霉素-载体蛋白偶联物，将点好的玻片放在4°C冰箱中固定过夜；(2)固定后每个反应孔内加入1(T100 U L r50mg/mL的牛血清白蛋白缓冲溶液对芯片进行封闭f3h，然后PBST洗涤3-4次，毎次3-15min ;封闭的目的是防止待测样品中的蛋白质与其他活性基团非特异性结合，形成高背景或假阳性；(3)在部分反应孔内加入1(T100 U L庆大霉素抗体和不同浓度的游离庆大霉素的标准溶液，在剩余反应孔内加入1(T100 u L庆大霉素抗体和样品溶液，所有反应孔2(T37°C水浴反应f 3h，然后PBST洗涤3 4次，每次3 15min ；
(4)在每个反应孔内加入KTlOOilL胶体金标记羊抗鼠IgG，2(T37°C水浴反应I 3h，然后PBST洗涤3 4次，每次3 15min ；(5)在每个反应孔内加入KTlOO UL银增强显色剂，避光显色反应5 30min后，终
止反应；(6)用CCD平板扫描仪进行图像扫描，根据不同浓度的庆大霉素包被抗原的灰度值信号，利用外标曲线法定量检测样品中庆大霉素的含量。方法ニ 半定量和定量检测方法。一种动物源性食品中残留庆大霉素的可视化蛋白芯片检测方法，该方法依次顺序包括如下步骤

(I)以牛血清白蛋白(BSA)为空白对照，将牛血清白蛋白、庆大霉素-载体蛋白偶联物和不同浓度鼠IgG内标物通过生物芯片点样仪进行点样操作，点样板孔内分别加入10^50 u L的牛血清白蛋白和10 50 u L的庆大霉素-载体蛋白偶联物，以及10-50 u L4个不同浓度的鼠IgG内标物，将点好的玻片放在4°C冰箱中固定过夜；(2)固定后每个反应孔内加入l(Tl00ii L f50mg/mL的牛血清白蛋白缓冲溶液对芯片进行封闭f3h，然后PBST洗涤3-4次，毎次3-15min ;封闭的目的是防止待测样品中的蛋白质与其他活性基团非特异性结合，形成高背景或假阳性；(3)在部分反应孔内加入1(T100 u L庆大霉素抗体和不同浓度的游离庆大霉素的标准溶液，在剩余反应孔内加入1(T100 u L庆大霉素抗体和样品溶液，所有反应孔2(T37°C水浴反应f 3h，然后PBST洗涤3 4次，每次3 15min ；(4)在每个反应孔内加入KTlOOii L胶体金标记羊抗鼠IgG，2(T37°C水浴反应I 3h，然后PBST洗涤3 4次，每次3 15min ；(5)在每个反应孔内加入KTlOO UL银增强显色剂，避光显色反应5 30min后，终
止反应；(6)用CCD平板扫描仪进行图像扫描，根据不同浓度的庆大霉素包被抗原的灰度值信号，做出外表曲线，根据不同浓度的内标物鼠IgG灰度值信号做出内标曲线，可以同时通过外标曲线和内标曲线实现定量和半定量检测样品中庆大霉素的含量。对于方法一和方法ニ，庆大霉素是小分子半抗原，不具备免疫原性，因其结构不同，也不便于直接固定在片基表面上，因而要首先将小分子半抗原与载体蛋白偶联，制备成人工抗原。所述的庆大霉素-载体蛋白偶联物按如下步骤制备得到(I)将I 500mg庆大霉素溶于I IOOmL PBS缓冲液(0. lM，pH7. 4)中，得到溶液I，在冰水浴中搅拌l(T60min ；(2)将I 500mg碳ニ亚胺溶于I IOOmLPBS缓冲液(0. lM，pH7. 4)中，得到溶液II，在冰水浴中搅拌l(T60min ；(3)称f200mg载体蛋白溶于f IOOmLPBS缓冲液(0. lM，pH7. 4)中，得到溶液III，在冰水浴中搅拌l(T60min ；(4)搅拌条件下将溶液I加入溶液III中，再在冰水浴下，将溶液II液逐滴加入上述混合液中，搅拌避光反应lh，4°C反应2 24h，得到庆大霉素-载体蛋白偶联物；(5)将庆大霉素-载体蛋白偶联物放入透析袋中，用PBS缓冲液(0. 1M，pH7. 4)，4°C,透析I 3天，每8h换一次透析液。
(6)透析后的庆大霉素-载体蛋白偶联物进行紫外扫描，分析鉴定庆大霉素-载体蛋白偶联物及浓度測定，分装后于_20°C冰箱保存备用即得；其中，所述的载体蛋白为匙孔血蓝蛋白、人血清白蛋白、牛血清白蛋白、牛丙种球蛋白、酶或卵清蛋白。本发明所述的动物源性食品包括牛奶、奶粉、奶酪、饲料、尿液、组织(如猪肉、牛肉、鸡肉、猪肝或鸡肝)、血清、蜂蜜、蜂皇浆、鸡蛋、水产品(如鱼或虾)。对于方法一和方法ニ，所述的牛血清白蛋白缓冲溶液，溶剂为0. lmol/LpH7. 4PBS缓冲液。对于方法一和方法ニ，所述的银增强显色剂为Sigma-Aldrich公司的银增强试剂A和银增强试剂B按体积比I :1的混合液。银增强试剂A主要成分为硝酸银，银增强试剂B主要成分为氢醌(即对苯ニ酚)。·对于方法一和方法ニ，PBST配方如下PBS (0. 1M, pH7. 4的磷酸盐缓冲液)
NaClSOg
KCl2g
KH2PO42g
Na2HPO4.12H2036.2g
蒸馏水800ml全部溶解后，冷却至室温，定容至1000ml。对于方法一和方法ニ,样品溶液处理方法如下对于液体样品，取50 ii L-ImL样品于IOmLEP管中，用PBS缓冲液(0. lM，pH7. 4)稀释10 100倍，用于可视化蛋白芯片測定。对于固体样品，取粉碎样品5g，加入8mLPBS缓冲液(0. 1M，pH7. 4)，混合5min，置50°C水浴下放置30min,室温3000r/min离心lOmin，取50 u L上清液，加入450 u L PBS缓冲液(0. 1M，PH7. 4)混匀，取50 y L用于分析。本发明的有益效果本发明采用蛋白芯片法测定动物源性食品中庆大霉素的含量，该方法对庆大霉素的检测限为0. lng/ml,远远低于国家规定的最大允许残留量(MRL) 200ng/ml。庆大霉素抗体的特异性较好，和其它29种不同抗生素(除硫酸依替米星外)均无交叉性反应。并且孔间CV值低于15%，孔内CV值低于10%，方法精密度高。对牛奶加样回收率在95%-130%之间，方法的准确度高，适于实际样品的检测。根据内标曲线可半定量求出抗生素浓度。因此，在实际样品检测时，无需毎次实验都重新绘制标准曲线，可根据ー个孔内的不同浓度鼠IgG的信号值，半定量求出抗生素的含量。该方法可大大降低了操作步骤，減少试剂用量，降低了成本，无需特殊昂贵的实验仪器，同时也为现场快速检测提供了ー种思路。本发明利用免疫測定原理建立庆大霉素可视化蛋白芯片检测方法。灵敏度高，检测时间短(大约2-3h)，操作简单易行，检测结果可视化，无需特殊昂贵的检测仪器，目视即可达到孔内半定量检测，大大降低了检测成本，适用于现场大規模样品的初筛。


图I为可视化蛋白芯片法所得的标准曲线图。曲线在0. lng/ml-200ng/ml范围内线性良好，R2X). 95，并且孔间CV值低于15%，孔内CV值低于10%，方法精密度高。且牛奶加样回收率在95%-130%之间，方法的准确度高。图2为可视化蛋白芯片法所得的标准曲线与内标曲线的相关性图。根据内标曲线可半定量求出抗生素浓度。因此，在实际样品检测时，无需毎次实验都重新绘制标准曲线，可根据ー个孔内的不同浓度鼠IgG的信号值，半定量求出抗生素的含量。
具体实施例方式根据下述实施例，可以更好地理解本发明。然而，本领域的技术人员容易理解，实施例所描述的内容仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本·发明。以下实施例所需试剂来源如下庆大霉素单克隆抗体(美国biodesign公司),羊抗鼠IgG-胶体金，鼠IgG (北京博奥森生物科技有限公司)，银增强显色剂(美国sigma公司),牛血清白蛋白(BSA)(美国sigma公司)。实施例I :庆大霉素包被抗原的制备。I)将5mg GM溶于IOmL PBS缓冲液(0. 1M，pH7. 4)中，得溶液I，在冰水浴中搅拌IOmin02)将20mg碳ニ亚胺溶于IOmLPBS缓冲液(0. 1M，pH7. 4)中，得溶液II，在冰水浴中搅拌IOmin。3)称取IOmg载体蛋白溶于20mLPBS缓冲液(0. lM，pH7. 4)中，得溶液III，在冰水浴中搅拌lOmin。4)将溶液I加入溶液III中并放磁力搅拌器上搅拌，再在冰水浴下，将溶液II缓慢逐滴加入上述混合液中，搅拌避光反应lh，4°C反应3h，合成庆大霉素-载体蛋白偶联产物。5)将庆大霉素-载体蛋白偶联产物放入透析袋中，用PBS缓冲液(0. 1M，pH7. 4)，4°C,透析3天,姆8h换一次透析液。6)透析后的偶联产物进行紫外扫描，分析鉴定偶联产物及浓度測定，分装后于-20°C冰箱保存备用。实施例2 :庆大霉素包被抗原的制备。I)将200mg GM溶于50mL PBS缓冲液(0. 1M，pH7. 4)中，得溶液I，在冰水浴中搅拌 IOmin02)将IOOmg碳ニ亚胺溶于50mL PBS缓冲液(0. 1M，pH7. 4)中，得溶液II，在冰水浴中搅拌lOmin。3)称取50mg载体蛋白溶于IOOmL PBS缓冲液(0. lM，pH7. 4)中，得溶液III，在冰水浴中搅拌lOmin。4)将溶液I加入溶液III中并放磁力搅拌器上搅拌，再在冰水浴下，将溶液II缓慢逐滴加入上述混合液中，搅拌避光反应lh，4°C反应3h，合成庆大霉素-载体蛋白偶联产物。5)将庆大霉素-载体蛋白偶联产物放入透析袋中，用PBS缓冲液(0. 1M，pH7. 4)，4°C,透析3天,姆8h换一次透析液。6)透析后的偶联产物进行紫外扫描，分析鉴定偶联产物及浓度測定，分装后于-20°C冰箱保存备用。实施例3 :可视化蛋白芯片法定量检测庆大霉素含量的方法I。(I)以牛血清白蛋白(BSA)为空白对照，将牛血清白蛋白和庆大霉素-载体蛋白偶联物通过生物芯片点样仪按照不同规格的矩阵进行点样操作，点样板孔内分别加入30 UL的牛血清白蛋白和30 UL的庆大霉素-载体蛋白偶联物，将点好的玻片放在4°C冰箱中固定过夜；
·
(2)固定后每个反应孔内加入20 ii L 10mg/mL的牛血清白蛋白缓冲溶液对芯片进行封闭lh，然后PBST洗涤3次，毎次5min ;包被抗原固定后将载体上其他无蛋白质样品区域封闭以防止待测样品中的蛋白质与其他活性基团非特异性结合，形成高背景或假阳性；(3)在部分反应孔内加入20 y L庆大霉素抗体和不同浓度的游离庆大霉素的标准溶液，在剩余反应孔内加入20 ii L庆大霉素抗体和样品溶液，所有反应孔37°C水浴反应lh，然后PBST洗涤3次，每次5min ；(4)在每个反应孔内加入20 y L胶体金标记羊抗鼠IgG，37°C水浴反应lh，然后PBST洗涤3次，每次5min ；(5)在每个反应孔内加入20yL银增强显色剂(A+B液体积比I :1，现配现用)，避光显色反应IOmin后,终止反应；(6)用CCD平板扫描仪进行图像扫描，并用计算机相关软件进行结果处理分析，根据不同浓度的庆大霉素包被抗原的灰度值信号，利用外标曲线法定量检测样品中庆大霉素的含量。本实施例方法中，对方法检测线、精密度等进行了考察。数据见图I。从图中可以看出，该方法对庆大霉素的检测限为0. lng/ml，远远低于国家规定的最大允许残留量(MRL)200ng/ml。并且孔间CV值低于15%，孔内CV值低于10%，方法精密度高。实施例4 :可视化蛋白芯片法定量检测庆大霉素含量的方法2。(I)以牛血清白蛋白为空白対照，将牛血清白蛋白和庆大霉素-载体蛋白偶联物通过生物芯片点样仪进行点样操作，点样板孔内分别加入IOy L的牛血清白蛋白和IOy L的庆大霉素-载体蛋白偶联物，将点好的玻片放在4°C冰箱中固定过夜；(2)固定后每个反应孔内加入IOii L 50mg/mL的牛血清白蛋白缓冲溶液对芯片进行封闭Ih，然后PBST洗涤3次，每次5min ；(3)在部分反应孔内加入10 y L庆大霉素抗体和不同浓度的游离庆大霉素的标准溶液，在剩余反应孔内加入IOii L庆大霉素抗体和样品溶液，所有反应孔37°C水浴反应lh，然后PBST洗涤3次，每次5min ；(4)在每个反应孔内加入IOyL胶体金标记羊抗鼠IgG，37°C水浴反应lh，然后PBST洗涤3次，每次5min ；(5)在每个反应孔内加入IOii L银增强显色剂，避光显色反应30min后，終止反应；
(6)用CCD平板扫描仪进行图像扫描，根据不同浓度的庆大霉素包被抗原的灰度值信号，利用外标曲线法定量检测样品中庆大霉素的含量。实施例5 :可视化蛋白芯片法定量检测庆大霉素含量的方法3。(I)以牛血清白蛋白为空白対照，将牛血清白蛋白和庆大霉素-载体蛋白偶联物通过生物芯片点样仪进行点样操作，点样板孔内分别加入50 y L的牛血清白蛋白和50 y L的庆大霉素-载体蛋白偶联物，将点好的玻片放在4°C冰箱中固定过夜；(2)固定后每个反应孔内加入IOOii L lmg/mL的牛血清白蛋白缓冲溶液对芯片进行封闭3h，然后PBST洗涤3次，每次5min ；(3)在部分反应孔内加入IOOii L庆大霉素抗体和不同浓度的游离庆大霉素的标准溶液，在剩余反应孔内加入100 u L庆大霉素抗体和样品溶液，所有反应孔20°C水浴反应3h,然后PBST洗涤3次，每次5min ；(4)在姆个反应孔内加入IOOii L胶体金标记羊抗鼠IgG,20°C水浴反应3h,然后 PBST洗涤3次，每次5min;(5)在姆个反应孔内加入IOOii L银增强显色剂,避光显色反应5min后，终止反应；(6)用CCD平板扫描仪进行图像扫描，根据不同浓度的庆大霉素包被抗原的灰度值信号，利用外标曲线法定量检测样品中庆大霉素的含量。实施例6 :可视化蛋白芯片法定量和半定量检测庆大霉素含量的方法4。(I)以牛血清白蛋白(BSA)为空白对照，将牛血清白蛋白、庆大霉素-载体蛋白偶联物和不同浓度鼠IgG内标物通过生物芯片点样仪按照不同规格的矩阵进行点样操作，点样板孔内分别加入30 的牛血清白蛋白30 的庆大霉素-载体蛋白偶联物，以及30 u L4个不同浓度的鼠IgG内标物，将点好的玻片放在4°C冰箱中固定过夜；(2)固定后每个反应孔内加入20 ii L 10mg/mL的牛血清白蛋白缓冲溶液对芯片进行封闭lh，然后PBST洗涤3次，毎次5min ;包被抗原固定后将载体上其他无蛋白质样品区域封闭，以防止待测样品中的蛋白质与其他活性基团非特异性结合，形成高背景或假阳性；(3)在部分反应孔内加入20 ii L庆大霉素抗体和不同浓度的游离庆大霉素的标准溶液，在剩余反应孔内加入20 ii L庆大霉素抗体和样品溶液，所有反应孔37°C水浴反应lh，然后PBST洗涤3次，每次5min ；(4)在每个反应孔内加入20 y L胶体金标记羊抗鼠IgG，37°C水浴反应lh，然后PBST洗涤3次，每次5min ；(5)在每个反应孔内加入20yL银增强显色剂(A+B液体积比I :1，现配现用)，避光显色反应IOmin后,终止反应；(6)用CCD平板扫描仪进行图像扫描，并用计算机相关软件进行结果处理分析，根据不同浓度的庆大霉素包被抗原的灰度值信号，做出外表曲线，根据不同浓度的内标物鼠IgG灰度值信号做出内标曲线,可以同时通过外标曲线和内标曲线实现定量和半定量检测样品中庆大霉素的含量。本实施例方法中，对内标曲线和外标曲线的相关性进行了考察，数据见图2，其中图中虚线是外标曲线，实线是内标曲线。从图中可以看出，两者相关性很好，可根据内标曲线可半定量求出抗生素浓度。因此，在实际样品检测时，无需毎次实验都重新绘制标准曲线，可根据ー个孔内的不同浓度鼠IgG的信号值，半定量求出抗生素的含量。实施例7 :可视化蛋白芯片法定量和半定量检测庆大霉素含量的方法5。(I)以牛血清白蛋白(BSA)为空白对照，将牛血清白蛋白、庆大霉素-载体蛋白偶联物和不同浓度鼠IgG内标物通过生物芯片点样仪按照不同规格的矩阵进行点样操作，点样板孔内分别加入IOu L的牛血清白蛋白IOy L的庆大霉素-载体蛋白偶联物，以及10 u L4个不同浓度的鼠IgG内标物，将点好的玻片放在4°C冰箱中固定过夜；(2)固定后每个反应孔内加入IOii L 50mg/mL的牛血清白蛋白缓冲溶液对芯片进行封闭Ih，然后PBST洗涤3次，每次5min ；(3)在部分反应孔内加入10 y L庆大霉素抗体和不同浓度的游离庆大霉素的标准溶液，在剩余反应孔内加入IOii L庆大霉素抗体和样品溶液，所有反应孔37°C水浴反应lh，然后PBST洗涤3次，每次5min ；·(4)在每个反应孔内加入IOyL胶体金标记羊抗鼠IgG，37°C水浴反应lh，然后PBST洗涤3次，每次5min ；(5)在每个反应孔内加入IOii L银增强显色剂，避光显色反应30min后，終止反应；(6)用CCD平板扫描仪进行图像扫描，根据不同浓度的庆大霉素包被抗原的灰度值信号，利用外标曲线法定量检测样品中庆大霉素的含量。实施例8 :可视化蛋白芯片法定量和半定量检测庆大霉素含量的方法6。(I)以牛血清白蛋白(BSA)为空白对照，将牛血清白蛋白、庆大霉素-载体蛋白偶联物和不同浓度鼠IgG内标物通过生物芯片点样仪按照不同规格的矩阵进行点样操作，点样板孔内分别加入50 ii L的牛血清白蛋白50 ii L的庆大霉素-载体蛋白偶联物，以及50ii L4个不同浓度的鼠IgG内标物，将点好的玻片放在4°C冰箱中固定过夜；(2)固定后每个反应孔内加入IOOii L lmg/mL的牛血清白蛋白缓冲溶液对芯片进行封闭3h，然后PBST洗涤3次，每次5min ；(3)在部分反应孔内加入IOOiI L庆大霉素抗体和不同浓度的游离庆大霉素的标准溶液，在剩余反应孔内加入100 u L庆大霉素抗体和样品溶液，所有反应孔20°C水浴反应3h,然后PBST洗涤3次，每次5min ；(4)在每个反应孔内加入100 UL胶体金标记羊抗鼠IgG，20°C水浴反应3h，然后PBST洗涤3次，每次5min;(5)在姆个反应孔内加入IOOii L银增强显色剂,避光显色反应5min后，终止反应；(6)用CCD平板扫描仪进行图像扫描，根据不同浓度的庆大霉素包被抗原的灰度值信号，利用外标曲线法定量检测样品中庆大霉素的含量。实施例5 :样品处理方法牛奶样品-M IOOiI L牛奶样品于IOmLEP管中，用PBS缓冲液(0. 1M，pH7. 4)稀释50倍，用于可视化蛋白芯片測定。结果发现，牛奶样品加样回收率在95%_130%之间，方法准确度高，适于实际样品的检测。
权利要求
1.一种动物源性食品中残留庆大霉素的可视化蛋白芯片检测方法，其特征在于，该方法依次顺序包括如下步骤 (1)以牛血清白蛋白为空白对照，将牛血清白蛋白和庆大霉素-载体蛋白偶联物通过生物芯片点样仪进行点样操作，点样板孔内分别加入lOlOyL的牛血清白蛋白和10^50 u L的庆大霉素-载体蛋白偶联物，将点好的玻片放在4°C冰箱中固定过夜； (2)固定后每个反应孔内加入KTlOOiiLf50mg/mL的牛血清白蛋白缓冲溶液对芯片进行封闭f 3h，然后PBST洗涤3-4次，每次3-15min ； (3)在部分反应孔内加入KTlOOilL庆大霉素抗体和不同浓度的游离庆大霉素的标准溶液，在剩余反应孔内加入1(T100 u L庆大霉素抗体和样品溶液，所有反应孔2(T37°C水浴反应f 3h，然后PBST洗涤3 4次，每次3 15min ； (4)在每个反应孔内加入1(T100u L胶体金标记羊抗鼠IgG，2(T37°C水浴反应f 3h，然后PBST洗涤3 4次，每次3 15min ； (5)在每个反应孔内加入KTlOOilL银增强显色剂，避光显色反应5 30min后，终止反应； (6)用CCD平板扫描仪进行图像扫描，根据不同浓度的庆大霉素包被抗原的灰度值信号，利用外标曲线法定量检测样品中庆大霉素的含量。
2.根据权利要求I所述的动物源性食品中残留庆大霉素的可视化蛋白芯片检测方法，其特征在于，庆大霉素-载体蛋白偶联物按如下步骤制备得到 (1)将f500mg庆大霉素溶于fIOOmL PBS缓冲液中，得到溶液I，在冰水浴中搅拌10 60min ； (2)将f500mg碳二亚胺溶于fIOOmLPBS缓冲液中，得到溶液II，在冰水浴中搅拌10 60min ； (3)称f200mg载体蛋白溶于fIOOmLPBS缓冲液中，得到溶液III，在冰水浴中搅拌10 60min ； (4)搅拌条件下将溶液I加入溶液III中，再在冰水浴下，将溶液II液逐滴加入上述混合液中，搅拌避光反应lh，4°C反应2 24h，得到庆大霉素-载体蛋白偶联物； (5)将庆大霉素-载体蛋白偶联物放入透析袋中，用PBS缓冲液，4°C，透析f3天，每8h换一次透析液。
(6)透析后的庆大霉素-载体蛋白偶联物进行紫外扫描，分析鉴定庆大霉素-载体蛋白偶联物及浓度测定，分装后于_20°C冰箱保存备用即得； 其中，所述的载体蛋白为匙孔血蓝蛋白、人血清白蛋白、牛血清白蛋白、牛丙种球蛋白、酶或卵清蛋白。
3.根据权利要求I所述的动物源性食品中残留庆大霉素的可视化蛋白芯片检测方法，其特征在于，牛血清白蛋白缓冲溶液，溶剂为PBS缓冲液。
4.根据权利要求I所述的动物源性食品中残留庆大霉素的可视化蛋白芯片检测方法，其特征在于，所述的银增强显色剂为Sigma-Aldrich公司的银增强试剂A和银增强试剂B按体积比I :1的混合液。
5.根据权利要求I所述的动物源性食品中残留庆大霉素的可视化蛋白芯片检测方法，其特征在于，样品溶液处理方法如下对于液体样品，取50 u L^lmL于IOmL EP管中，用PBS缓冲液稀释1(T100倍，用于分析；对于固体样品，取粉碎样品5g，加入8mL PBS缓冲液，混合5min,置50°C水浴下放置30min,室温3000r/min离心IOmin,取50 y L上清液，加入.450 u LPBS缓冲液混匀，取50 ii L用于分析。
6.一种动物源性食品中残留庆大霉素的可视化蛋白芯片检测方法，其特征在于，该方法依次顺序包括如下步骤 (1)以牛血清白蛋白为空白对照，将牛血清白蛋白、庆大霉素-载体蛋白偶联物和不同浓度鼠IgG内标物通过生物芯片点样仪进行点样操作，点样板孔内分别加入10 50 u L的牛血清白蛋白和l(T50iiL的庆大霉素-载体蛋白偶联物，以及10-50 iiL4个不同浓度的鼠IgG内标物，将点好的玻片放在4°C冰箱中固定过夜； (2)固定后每个反应孔内加入KTlOOiiLf50mg/mL的牛血清白蛋白缓冲溶液对芯片进行封闭f 3h，然后PBST洗涤3-4次，每次3-15min ； (3)在部分反应孔内加入KTlOOilL庆大霉素抗体和不同浓度的游离庆大霉素的标准溶液，在剩余反应孔内加入1(T100 u L庆大霉素抗体和样品溶液，所有反应孔2(T37°C水浴反应f 3h，然后PBST洗涤3 4次，每次3 15min ； (4)在每个反应孔内加入1(T100u L胶体金标记羊抗鼠IgG，2(T37°C水浴反应f 3h，然后PBST洗涤3 4次，每次3 15min ； (5)在每个反应孔内加入KTlOOilL银增强显色剂，避光显色反应5 30min后，终止反应； (6)用CCD平板扫描仪进行图像扫描，根据不同浓度的庆大霉素包被抗原的灰度值信号，做出外表曲线，根据不同浓度的内标物鼠IgG灰度值信号做出内标曲线，可以同时通过外标曲线和内标曲线实现定量和半定量检测样品中庆大霉素的含量。
7.根据权利要求I所述的动物源性食品中残留庆大霉素的可视化蛋白芯片检测方法，其特征在于，庆大霉素-载体蛋白偶联物按如下步骤制备得到 (1)将f500mg庆大霉素溶于fIOOmL PBS缓冲液中，得到溶液I，在冰水浴中搅拌.10 60min ； (2)将f500mg碳二亚胺溶于fIOOmLPBS缓冲液中，得到溶液II，在冰水浴中搅拌.10 60min ； (3)称f200mg载体蛋白溶于fIOOmLPBS缓冲液中，得到溶液III，在冰水浴中搅拌.10 60min ； (4)搅拌条件下将溶液I加入溶液III中，再在冰水浴下，将溶液II液逐滴加入上述混合液中，搅拌避光反应lh，4°C反应2 24h，得到庆大霉素-载体蛋白偶联物； (5)将庆大霉素-载体蛋白偶联物放入透析袋中，用PBS缓冲液，4°C，透析f3天，每.8h换一次透析液。
(6)透析后的庆大霉素-载体蛋白偶联物进行紫外扫描，分析鉴定庆大霉素-载体蛋白偶联物及浓度测定，分装后于_20°C冰箱保存备用即得； 其中，所述的载体蛋白为匙孔血蓝蛋白、人血清白蛋白、牛血清白蛋白、牛丙种球蛋白、酶或卵清蛋白。
8.根据权利要求7所述的动物源性食品中残留庆大霉素的可视化蛋白芯片检测方法，其特征在于，牛血清白蛋白缓冲溶液，溶剂为PBS缓冲液。
9.根据权利要求7所述的动物源性食品中残留庆大霉素的可视化蛋白芯片检测方法， 其特征在于，所述的银增强显色剂为Sigma-Aldrich公司的银增强试剂A和银增强试剂B按体积比I :1的混合液。
10.根据权利要求7所述的动物源性食品中残留庆大霉素的可视化蛋白芯片检测方法，其特征在于，样品溶液处理方法如下对于液体样品，取50 mmL于IOmL EP管中，用PBS缓冲液稀释1(T100倍，用于分析；对于固体样品，取粉碎样品5g，加入8mL PBS缓冲液，混合5min,置50°C水浴下放置30min,室温3000r/min离心IOmin,取50 y L上清液，加入·450 u LPBS缓冲液混匀，取50 ii L用于分析。
全文摘要
本发明公开了一种动物源性食品中残留庆大霉素的可视化蛋白芯片检测方法，属于间接竞争免疫法。本发明利用碳二亚胺法通过一步合成庆大霉素包被抗原，建立动物性食品中庆大霉素的可视化蛋白芯片检测方法。在芯片载体上固定庆大霉素包被抗原和内标物，然后在反应区内加入游离庆大霉素和庆大霉素单克隆抗体，游离的庆大霉素和芯片上固定的偶联物间进行竞争反应，待反应完毕后洗涤，再加入胶体金标记的二抗，反应完全洗涤后再加银增强显色剂，胶体金可将银原子催化成可目测的黑色银，通过扫描仪对图像进行扫描，最终可同时实现孔内半定量，定量检测。本发明方法可以快速准确测定动物源性食品中庆大霉素的残留量，灵敏度高，检测时间短，操作简单易行。
文档编号G01N33/531GK102788877SQ20121032470
公开日2012年11月21日 申请日期2012年9月4日 优先权日2012年9月4日
发明者孙思云, 李周敏 申请人:南京祥中生物科技有限公司