专利名称：检测钠/钙交换体(ncx)“反向模式”调节化合物的基于荧光的测定法的制作方法
技术领域：
本发明涉及钠/钙交换体(sodium/calcium exchanger, NCX)和检测其活性的方 法。更具体地讲，本发明涉及用于检测NCX “反向模式”调节化合物的基于荧光的测定法。 本发明还涉及包含表达(expriming)NCX的细胞的组件试剂盒(kit of parts)及组件试剂 盒的用途。
背景技术：
生命的一个基本的必要条件是区室化一以生物膜作为实现这一原则的天然工 具。然而，脂双层一构成细胞膜基础的结构一对大多数离子和化合物是不渗透的，而这些 离子和化合物的转运是维持细胞和生物体的生命机能所必需的。这种反论的答案在于细胞 膜的半渗透性质一必须跨过膜的溶质通过特定的膜蛋白转运。这些转运蛋白负责离子梯 度的产生和维持，营养物的摄取，代谢产物的转运，信号转导分子的重摄取以及毒性和废弃 化合物的清除。因此，在这种情况下，转运蛋白是允许直接影响疾病相关性异常状况的潜在 的药物靶标。转运蛋白是一个新兴的靶标家族，具有巨大的潜力，提供了科学和经济机会。另一 方面，就药物开发技术而言转运蛋白是困难的靶标类别。人钠/钙交换体基因家族(亦称为NCX或SLC8)包括三种截然不同的蛋白质NCX1、 NCX2 和 NCX3。SLC8 与 SLC24 —起构成 Na+/Ca2+ 反向转运蛋白(countertransporter)的超 家族。SLC24家族成员还转运K+，亦称为NCKX。NCXl是人钠/钙交换体基因家族中表征最充分的成员，它的表达在人衰竭性心 脏中上调，并在心肌梗死后参与缺血-再灌注损伤(ischemia-r印erfusion damage)。 抑制NCXl使衰竭性心脏的心肌收缩性正常化，并且在缺血再灌注后发挥心脏保护作 用(Flesch 等，Circulation 1996 ；Komuro 禾口 Ohtsuka, Journal of Pharmacological. Sciences. 2004)。NCX2主要在大脑中表达，NCX3主要在大脑和骨骼肌中表达，其生理作用 不详。钠/钙交换体根据膜电位和离子梯度可按两个方向转运Ca2+和Na+。在第一个方 向上，称为“正向模式”或“钙输出模式”，Ca2+被转运到细胞外，Na+被转运到细胞内。在另 一个方向上，称为“反向模式”或“钙输入模式”，转运方向反转过来。钠/钙交换体是从不同细胞中去除Ca2+的重要机制。在心脏中，它排除通过Ca2+ 通道进入的Ca2+引起收缩，同时使Na+进入心脏细胞。其在心血管疾病中的关联性参见例如 Hobai，JA禾口 0，Rourke，B (2004) Expert Opin. Investig. Drugs, 13，653—664。因此，制药业已 开发出抑制 NCX 的化合物，参见例如 Iwamoto, T.等(2004) J. Biol. Chem.，279，7544-7553。心脏钠/钙交换体的抑制对于心脏保护十分重要(例如Pogwizd，2003)。存在区 分抑制NCX的“正向模式”的化合物和抑制NCX的“反向模式”的化合物的医学需求。因此， 需要分析钙输入模式的测定法。另外，抑制NCXl的化合物应当是选择性的，因为NCX2和 NCX3属于同一转运蛋白家族。因此，需要可供选择性特征分析的测定法。
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鉴定例如通过阻断钙流和/或抑制NCX的活化来调节钠/钙交换体活性的化合物 是相当有价值的。这样做的一种标准方法是通过采用膜片钳实验。在这些实验中，必须由技术娴熟的操作人员，通过测量在响应膜电位变化和/或 试验化合物应用时跨越细胞膜的钙流，依次个别地对细胞进行评价。研究了 Sea0400(NCX 的一种新的特异性抑制剂)对狗心室乳头肌的动作电位的作用，参见K. Acsai在“2004年 ESC 大会，，期间发表于 Munich on Poster Nr. 2886 的文献(标题=Effect of a specific sodium-calcium exchanger blocker Sea0400 on the ventricular action potential and triggered activity in dog ventricular muscle and Purkinje fiber(特异j"生 钠-钙交换体阻断剂Sea0400对心室动作电位的作用和在狗心室肌和浦肯野纤维中的引发 舌t生))C. Lee ^ (The journal of pharmacology and experimental therapeutics ； 第 311 ^ 748-757,2004 ；丰示 H :Inhibitory profile of SEA0400[2-[4-[ (2, 5-Difluorophenyl)methoxy]phenoxy]-5-ethoxyaniline]assessed on the cardiac Na+/ Ca2+ exchanger，NCXl·l(评价SEA0400[2-[4-[(2，5-二氟苯基)甲氧基]苯氧基]-5-乙 氧基苯胺]对心脏Na7Ca2+交换体NCX1. 1的抑制特征))。采用离子选择电极技术定量测定巨膜片(giant patch)中离子流的研究表明，心 脏 Na+/Ca2+交换体具有多种转运模式(Tong Mook Kang 和 Donald W. Hilgemann ；Nature ； % 427 2004 ^ 2 B 5 H ；丰示H :Multiple transport modes of the cardiac Na+/Ca2+ exchanger (心脏Na+/Ca2+交换体的多种转运模式))。这些实验虽然有效并提供大量信息，但却非常耗时而且不适于对调节钙离子通道 活性的化合物进行高通量分析。多种技术已发展成为电生理学标准方法的备选方法。例如，已采用放射性流量 测定法(radioactive flux assay)，其中将细胞暴露于放射性示踪物(例如45Ca)中并 监测放射性标记的Ca流量。将负载有示踪物的细胞暴露于化合物中，增加或减少示踪物 流出的那些化合物被鉴定为潜在的细胞膜离子通道的激活剂或抑制剂。一个具体实例 0β T. Kuramochi 等；Bioorganic & Medicinal Chemistry ； 12 (2004) 5039-5056 ； feH Synthesis and structure-activity relationships of phenoxypyridine derivates as novel inhibitors of the sodium-calcium exchanger (作为 内 _ f丐交换体新型才IpfU齐[J的 苯氧基吡啶衍生物的合成和结构_活性关系)。EP1031556公开了其中使用肌膜囊泡测定 NaVCa2+交换体活性的方法，通过测量45Ca的放射性来测定肌膜囊泡中Ca2+摄取的浓度。多种放射性离子转运蛋白测定法的灵敏度有限，因此数据质量不佳。另外，与放射 性筛选技术有关的成本和安全问题是妨碍广泛应用的障碍。在上述药物开发技术中，应用放射性流量测定法来鉴定调节离子通道和离子转运 蛋白活性的化合物是与本发明最接近的现有技术，因为该技术可以通过监测细胞的Ca2+流 量来将试验化合物鉴定为潜在激活剂或抑制剂。放射性测定法的主要问题出在检测每秒约1-1000个分子的离子转运蛋白的周转 受限(小于大多数离子通道的约104倍)的困难上。因此，由现有技术水平所产生的问题是确定在高通量筛选钠/钙交换体调节剂和 分析其特征方面具有极佳灵敏度的稳健测定法，可供区别化合物的“正向模式“和“反向模 式”调节活性，并且可供分析已鉴定出的调节剂分别对NCX1、NCX2和NCX3的选择性的特征。本发明解决了这个问题。发明概述本发明的一个主题涉及用于测定钠/钙交换体的钙输入活性的测定法，其中a)提供表达钠/钙交换体的细胞；b)提供用于测定胞内钙的有色物质(colored substance)；c)使细胞与钠/钙交换体激活剂接触；和d)将来自所述有色物质的发光信号中钙介导的变化与对照实验中产生的发光信 号相比较。本发明另一个主题涉及用于测定在响应化合物的加入中钠/钙交换体的钙输入 活性的测定法，其中a)提供表达钠/钙交换体的细胞；b)提供用于测定胞内钙的有色物质；c)使细胞与化合物接触，其中所述细胞在用所述化合物处理前已经过钠/钙交换 体激活剂处理；和d)将来自所述有色物质的发光信号中钙介导的变化与对照实验中产生的发光信 号相比较。一般而言，所使用的钠/钙交换体来源于哺乳动物，特别来源于人。钠/钙交换 体选自下列钠/钙交换蛋白之一 NCX1、NCX2、NCX3、NCX4、NCX5、NCX6和/或NCX7，特别是 NCX1、NCX2和/或NCX3 ；和/或选自下列钠/钙/钾交换蛋白之一 NCKX1、NCKX2、NCKX3、 NCKX4 禾口 / 或 NCKX5。一般而言，用于本发明测定法的细胞可来源于任何真核生物。在一个优选的 实施方案中，细胞是哺乳动物细胞。在一个更优选的实施方案中，细胞是CH0(CCL-61)、 HEK(CCL-1573)、C0S7(CRL-1651)和 / 或 JURKAT (CRL-1990)细胞。在一个优选的实施方案中，将作为染料前体的能够进入细胞并能够水解成染料 的所述有色物质加入细胞中，藉此染料与钙在所述细胞中络合并且发出发光信号。此外， 所述染料前体可优选为乙酰氧基甲基酯衍生物，并且所述染料可优选为钙敏感荧光染料 fluo-4。在一个更优选的实施方案中，所述发光信号是荧光，所述监测步骤c)采用FLira
直ο本发明还涉及采用前述测定法测定化合物作为钠/钙交换体的钙输入活性的激 动剂或拮抗剂的活性。在另一个优选的实施方案中，本发明涉及采用前述测定法诊断与钠 /钙交换体表达发生改变有关的疾病。本发明还涉及包含以下组件试剂盒a)表达(expriming)钠/钙交换体的冻干细胞；b)有色物质；c)化合物缓冲液；和d)有色物质缓冲液。在本发明组件试剂盒的一个优选的实施方案中，所述有色物质是钙敏感荧光染料 fluo-4。在另一个优选的实施方案中，所使用的钠/钙交换体来源于哺乳动物，特别来源于 人。钠/钙交换体选自下列钠/钙交换蛋白之一 NCX1、NCX2、NCX3、NCX4、NCX5、NCX6和/或NCX7，特别是NCX1、NCX2和/或NCX3 ；和/或选自下列钠/钙/钾交换蛋白之一 =NCKXl、 NCKX2、NCKX3、NCKX4 禾口 / 或 NCKX5。本发明还涉及采用前述组件试剂盒测定化合物作为钠/钙交换体钙输入活性的 激动剂或拮抗剂的活性。在另一个优选的实施方案中，本发明涉及采用前述组件试剂盒诊 断与钠/钙交换体表达发生改变有关的疾病。发明详述术语“测定法”是指测定某一系统或对象的性质的方法。测定法是常用术语生物测定法的省略形式，并且是体外实验的一种类型。通常进 行测定法以测量某一物质对活生物体的作用。测定法可以是定性或定量的，它们在新药开 发中是必不可少的。本测定法提供大的动态范围(dynamic range)，使得可测定NCX蛋白的活性。特别 是本发明可提供快速有效的测定法，用于筛选与钠/钙交换体进行特异性相互作用并调节 其活性的药学上有效的化合物和分析所述化合物的特征。在本发明的情况中，术语“钠/钙交换体”或“NCX”可以是指下列NaYCa2+交换蛋 白中单独或彼此组合的任一种NCX1、NCX2、NCX3、NCX4、NCX5、NCX6、NCX7 ；或者下列Na+/ Ca2VK+交换蛋白中单独或彼此组合的任一种NCKX1、NCKX2、NCKX3、NCKX4、NCKX5。尤其优选的是SLC8家族成员NCXl、NCX2和/或NCX3，其氨基酸序列分别对应于 SEQ ID NO :1、SEQ ID NO 2 和 SEQ ID NO :3。这类钠/钙交换体可来源于任何脊椎动物，特别是哺乳动物物种(例如狗、马、牛、 小鼠、大鼠、犬科动物、兔、鸡、类人猿、人等)。钠/钙交换体可以从这类有脊椎生物的组织 探查物(probes)中分离，或者可以通过能够表达钠/钙交换体的重组生物材料制备。术语“钠/钙交换蛋白”是指多肽、多态变体(polymorphic variant)、突变体和种 间同源物，其氨基酸序列优选在至少约25、50、100、200个或500个以上氨基酸的区域内与 SEQ ID NO :1、SEQ ID NO 2和SEQ ID NO 3中所含氨基酸序列相比有超过约80%氨基酸 序列同一性、85%、90%、优选91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%以上氨 基酸序列同一性。术语“生物材料”是指含有遗传信息并且能够自体复制或在生物系统中复制的任 何材料。重组生物材料是通过本领域技术人员熟知的重组技术产生、改变或修饰的任何生 物材料。下列参考文献是克隆特定NCX蛋白的实例Nicoll，DA.等人克隆了犬Na+/Ca2+交 换体 NCXl (Science. 250(4980) :562_5，1990 ；标题Molecular cloning and functional expression of the cardiac sarcoIemmalNa (+) -Ca2+ exchanger (Na (+) -Ca2+ ^ 换体的分子克隆和功能性表达))。Komuro, I.等(Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. Α. 89 (10), 4769-4773,1992 ； f 示 IS :Molecular cloning and characterization of the human cardiacNa+/Ca2+ exchanger cDNA (人心脏 Na+/Ca2+ 交换体 cDNA 的分子克隆与表征)) 和 Kofuji，P.等(Am. J. Physiol. 263 (Cell Physiol. 32) :C1241_C1249，1992 ；标题 Expression of the Na-Ca exchanger in diverse tissues -.a study using the cloned human cardiac Na-Ca exchanger (不同组织中Na-Ca交换体的表达使用克隆的人心脏 Na-Ca交换体的研究))克隆了人NaVCa2+交换体NCXl。Li，Z.等人克隆了人Na+/Ca2+交换体
7NCX2 (J. Biol. Chem. 269(26) 17434-9，1994 ；标题Cloning of the NCX2 isoform of the plasma membrane Na(+)-Ca2+ exchanger (质膜Na(+)_Ca2+交换体的NCX2 同种型的克隆))。 Nicoll，DA.等人克隆了大鼠 Na+/Ca2+交换体 NCX3(J. Biol. Chem. 271(40) :24914_21，1996 ； 标题Cloning of a third mammalian Na+/Ca2+ exchanger, NCX3 (第三种哺乳动物 Na+/ Ca2+交换体 NCX3 的克隆))。Gabellini，N.等人克隆了人 Na+/Ca2+交换体 NCX3 (Gene. 298 1—7，2002 ；标题The human SLC8A3gene and the tissue-specific Na+/Ca2+ exchanger 3 isoforms (人SLC8A3基因和组织特异性Na+/Ca2+交换体3同种型))。术语“多肽”、“肽”和“蛋白质”在本文中可互换使用，是指氨基酸残基的聚合体。 该术语适用于其中一个或多个氨基酸残基是相应天然存在的氨基酸的人工化学模拟物的 氨基酸聚合体，并适用于天然存在的氨基酸聚合体和非天然存在的氨基酸聚合体。术语“钠/钙交换体的钙输入活性”是指钠/钙交换体的“反向模式”，即将Ca2+输 入细胞并将Na+输出细胞的机制。该“反向模式”转运发生在某些质膜去极化条件和高胞质 Na+浓度下。通过测量合适有色物质与钙络合所产生的增强的发光，来确定钠/钙交换体的活 性。术语“表达钠/钙交换体的细胞”是指内源性表达目标交换体的细胞或重组细胞。当提及例如细胞、或核酸、蛋白质或载体时，术语“重组”是指通过导入异源核酸或 蛋白质或者改变天然核酸或蛋白质而被修饰的细胞、核酸、蛋白质或载体，或者所述细胞来 源于经如此修饰的细胞。因此，例如重组细胞表达天然(非重组)形式的细胞内不存在的 基因，或者表达异常表达、表达不足或根本不表达的天然基因。在本发明中，这通常是指用 编码钠/钙交换体的核酸序列转染的细胞。仅通过使细胞生长在含有合适培养基的适当容器中，便可进行该测定法。细胞可 以是天然存在的细胞、天然细胞、建立的细胞系、市售细胞、遗传修饰的细胞等，只要细胞在 试验期间能够维持，并且适宜在培养基中生长即可。用于进行主题测定法的合适细胞包括原核生物、酵母或高等真核细胞，尤其哺乳 动物细胞。原核生物包括革兰氏阴性生物和革兰氏阳性生物。细胞一般可为哺乳动物细胞， 例如人细胞、小鼠细胞、大鼠细胞、中国仓鼠细胞等。被认为是合适的细胞包括CH0、C0S7、 JURKAT, HeLa, HEK、MDCK 和 HEK293 细胞。细胞可以用众所周知的方法制备(Current protocols in cell biology, John Wiley & Sons Inc，ISBN :0471241059)，或者可以购买(Invitrogen Corp.，Sigma-Aldrich Corp.，Stratagene)。术语“有色物质”尤其是指钙敏感荧光染料。染料前体的特征在于在测定条件下不发光，是一种酯，能够进入细胞并且在胞内 水解成发光的含氧化合物，而且与钙络合时发光增强。选择易被胞内水解酶水解的酯。术语“能够进入细胞”是指前体能够跨细胞膜并且在细胞中被水解，染料前体在特 定的PH、温度等条件下进入细胞，以不同的速度进入细胞，或者在特定条件下不进入细胞。采用众所周知的方案，将有色物质加入细胞中(Current protocols in cell biology, John Wiley & Sons Inc，ISBN :0471241059)。所使用的有色物质是常用的市售试剂(Invitrogen Corp.)，并且可以使用在实验室合成的试剂。满足上述要求的多种市售染料是已知的。用于监测Ca2+的荧光染料是众所周知 的，详情可参见Molecular Probes目录第20. 1-20.4节，第9版。它们通常具有两个与荧光 核(例如荧光素、罗丹明、香豆素、氨基苯基吲哚等)连接的双-羧甲基氨基。所述化合物 大部分是3，6_ 二氧基取代的占吨，在前体中氧基是取代的，在发光染料中则是未取代的。 通常存在保护酚和酸的乙酰氧基甲基。参见例如Fluo3/4、Fura2/3、钙荧光素绿(calcein green)等。乙酰基的水解产生发光产物。前体能够跨过细胞膜并在细胞中水解。术语“发光，，是指“冷光”，光来自其它能量源，可发生在常温和较低温度下。在发 光时，一些能量源将原子的电子抛出其“基”(最低能量)态进入“激发”(较高能量)态; 然后电子返还光形式的能量，因此可以回到其“基”态。有若干种发光类型，各自根据能量 源是什么或是什么引起发光而命名。术语“荧光”是指主要作为冷体(cold body)中的光学现象而存在的发光，其中分 子吸收光子引起发射出另一个具有较长波长的光子。吸收光子与发出光子之间的能量差以 分子振动或热结束。通常吸收光子在紫外线区，发射光在可见区，但是这取决于具体荧光团 的吸光度曲线和斯托克司频移。荧光以矿物荧石(mineral fluorite)的名字命名，矿物荧 石由通常具有这种现象的氟化钙组成。可用发光计或荧光成像仪测量来自指示剂染料的荧光。一种优选的检测仪是 焚光成像读板仪(Fluorometric Imaging Plate Reader, FLI PR) (Molecular Devices, Sunnyvale,Calif.)0 FLII3R非常适于应用本发明方法的高通量筛选，因为它将能够将同时 移液至微量滴定板的96孔或384孔的集成液体处理与采用与电荷耦合器件摄影机连接的 氩激光器进行快速动力学检测结合在一起。使用钙指示剂染料的一种备选方法是使用水母发光蛋白系统。水母发光蛋 白系统利用蛋白质脱辅基水母发光蛋白(apoaequorin)，它与亲脂性发色团腔肠素 (coelenterazine)结合，形成脱辅基水母发光蛋白与腔肠素的组合(称为水母发光蛋白)。 脱辅基水母发光蛋白具有3个钙结合部位，在钙结合时，水母发光蛋白的脱辅基水母发光 蛋白部分的构象发生改变。构象的这种改变使腔肠素被氧化成coelenteramide、CO2和蓝 光(466nm)的光子。可以使用合适的仪器检测这种光子。有关使用水母发光蛋白的综述可参见Cr6ton等，1999，Microscopy Research and Technique 46 :390_397 ；Brini 等，1995，J. Biol. Chem. 270 9896-9903 ；Knight 和 Knight, 1995，Meth. Cell. Biol. 49 :201_216。同样有价值的可为美国专利第5，714，666号，它描述 了通过将腔肠素辅因子加入表达脱辅基水母发光蛋白的哺乳动物细胞中来测量哺乳动物 细胞的胞内钙的方法。“抑制剂”是例如结合钠/钙交换蛋白、部分或完全阻断其活性、降低、阻止钠/钙 交换蛋白的活性或表达、延迟钠/钙交换蛋白活化、使钠/钙交换蛋白失活、脱敏或者下调 钠/钙交换蛋白的活性或表达的化合物，例如拮抗剂。“激活剂”是增加、开启、激活、促进钠/钙交换体活性、促进其活化、敏化、刺激或上 调钠/钙交换体活性的化合物。在本发明中一种优选的激活剂是短杆菌肽，它引发胞内钠 浓度升高，从而在“反向”转运模式中导致钠/钙交换体活性增加。抑制剂、激活剂或调节剂还包括钠/钙交换蛋白的遗传修饰形式，例如活性发生改变的形式，以及天然存在和合成的配体、拮抗剂、激动剂、肽、环肽、核酸、抗体、反义分子、 核酶、有机小分子等。术语“化合物”或“试验化合物”或“试验候选物(test candidate)”或其语法等 同术语是指将要被测定调节钠/钙交换体活性的能力的任何天然存在或合成的分子，例如 蛋白质、寡肽、有机小分子、多糖、脂质、脂肪酸、多核苷酸、寡核苷酸等(Current protocols in molecular biology, John Wiley & Sons Inc, ISBN :0471250961)。试验化合物可 以是试验化合物文库的形式，例如提供足够多样性范围的组合文库或随机文库(Current protocols in molecular biology, John Wiley & Sons Inc，ISBN :0471250937)。试验化合 物任选与融合配偶体连接，融合配偶体例如靶向化合物、拯救化合物(rescue compound)、 二聚化合物、稳定化合物、可寻址化合物(addressable compound)和其它功能性部分。按 惯例，通过鉴定具有某些所需性质或活性(例如活性升高)的试验化合物(称为“先导化合 物”)、产生先导化合物的变体以及评价这些变体化合物的性质和活性，来产生具有有益性 质的新的化学实体。优选将高通量筛选(HTS)方法应用于这类分析。在细胞生长后，所述抑制剂、激活剂和试验化合物可通过注入培养基中而加入细 胞内，或者它们可在细胞生长前就存在于培养基中(Current protocols in cell biology, John Wiley & Sons Inc, ISBN :0471241059)。细胞可以在抑制剂、激活剂和/或试验化合物中生长到适当数目，或者将抑制剂、 激活剂和/或试验化合物加入其中使用而细胞没有进一步生长。细胞可与抑制剂、激活剂 和/或试验化合物结合，或者在将细胞置于孔中并使其在孔中生长的实施方案中，细胞可 以是悬浮在孔内液体中的悬液细胞。术语“对照实验”是指可以同时进行的不同类型的实验。技术人员应了解的是，与 本文所述方法一起进行对照实验一般是有益的。例如，对于测定钠/钙交换体活性的测定法，具有对照通常是有益的，其中细胞优 选与用于该测定法的细胞基本相同，不同之处在于这些细胞不会表达目标钠/钙交换体。此外，对于测定在响应化合物的加入中钠/钙交换体的活性的测定法，具有对照 通常是有益的，其中在本发明的测定法中测定化合物，所述化合物针对的是优选与该测定 法中所用的细胞基本相同的细胞，不同之处在于这些细胞不表达目标钠/钙交换体。这样 可以确定通过所述测定法鉴定的化合物确实是通过目标钠/钙交换体而不是通过某些意 料之外的非特异性机制起作用。这类对照细胞的一种可能性可以是非重组亲本细胞，其中 实际实验中的所述细胞表达目标钠/钙交换体。对于测定在响应化合物的加入中钠/钙交换体活性的测定法，其它对照可以是在 不加入试验化合物(低水平对照(low control))时进行所述测定法以及用高浓度的试验 化合物(高水平对照(high control))进行所述测定法。其它类型的对照可包括将通过本发明的测定法鉴定的化合物作为目标钠/钙交 换体的激动剂或拮抗剂；和用现有技术的方法测定化合物以证实这些化合物在所述现有技 术方法中同样也是激动剂或拮抗剂。此外，本领域技术人员应了解的是，还需要通过比较测定值与标准值来进行统计 学分析。术语“激动剂”和“拮抗剂”是指通过受体调节信号转导的受体效应分子。受体效
10应分子能够与受体结合，但不一定在天然配体的结合部位。受体效应子当单独使用时可调 节信号转导，即可以替代配体，或者可以在天然配体存在下，通过天然配体提高或抑制信号 转导来改变信号转导。例如“拮抗剂”是阻断或降低受体信号转导活性的分子，例如，它们 可以竞争性、非竞争性和/或变构性地抑制来自受体的信号转导，而“激动剂”则增强、诱导 或提高受体的信号转导活性。术语“与钠/钙交换体表达发生改变有关的疾病”是指扩张型心肌病、冠心病、心
律失常、心力衰竭等。为方便起见，有色物质和测定法的其它组分可以试剂盒提供，其中有色物质可作 为可复溶粉末存在，或者可作为冰浴中缓冲溶液的冷却溶液存在。试剂盒还可包括缓冲液、 激活剂、抑制剂、试验化合物、表达(expriming)钠/钙交换蛋白的细胞等。细胞可作为冻 干细胞存在。所述组件试剂盒可以用作诊断试剂盒，用于诊断扩张型心肌病、冠心病、心律失
常、心力衰竭等。下列附图
和实施例将更详细地说明本发明，并披露了基于荧光的细胞钠/钙交换 体测定法的典型结果，但不限制保护的范围。实例1.材料与方法1. 1.化学试剂与设备
权利要求
一种用于测定钠/钙交换体的钙输入活性的测定法，所述测定法包括a)提供表达钠/钙交换体的细胞；b)提供用于测定胞内钙的有色物质；c)使细胞与钠/钙交换体激活剂接触；和d)将钙介导的来自所述有色物质的发光信号的变化与对照实验中产生的发光信号进行比较。
2.权利要求1的测定法，其中所述钠/钙交换体是下列NCX蛋白NCX1、NCX2、NCX3；或 下列 NCKX 蛋白NCKX1、NCKX2、NCKX3、NCKX4、NCKX5。
3.权利要求1的测定法，其中所述钠/钙交换体是下列NCX蛋白NCX1、NCX2、NCX3。
4.权利要求1-3的测定法，其中所述钠/钙交换体来源于哺乳动物，优选来源于大鼠、 小鼠、狗、牛、猪、猿或人。
5.权利要求1-4的测定法，其中所述细胞选自CH0、HEK、C0S7和JURKAT细胞。
6.权利要求1-5的测定法，其中将作为能够进入细胞并能够水解成染料的染料前体的 所述有色物质加入细胞中，藉此染料与钙在所述细胞中络合并且发出发光信号。
7.权利要求1-6的测定法，其中所述发光信号是荧光，所述监测步骤c)采用FLira装置。
8.权利要求6的测定法，其中所述染料前体是乙酰氧基甲基酯衍生物。
9.权利要求6的测定法，其中所述染料是钙敏感荧光染料fluo-4。
10.权利要求1-9的测定法在测定化合物作为钠/钙交换体钙输入活性的激动剂或拮 抗剂的活性中的用途。
11.权利要求1-9的测定法在用于诊断与钠/钙交换体表达发生改变有关的疾病中的 用途。
12.一种用于测定在响应化合物的加入中钠/钙交换体的钙输入活性的测定法，所述 测定法包括a)提供表达钠/钙交换体的细胞；b)提供用于测定胞内钙的有色物质；c)使细胞与化合物接触，其中所述细胞在用所述化合物处理前已经过钠/钙交换体激 活剂处理；和d)将钙介导的来自所述有色物质发光信号的变化与对照实验中产生的发光信号进行 比较。
13.权利要求12的测定法，其中所述钠/钙交换体是下列NCX蛋白NCX1、NCX2、NCX3； 或下列 NCKX 蛋白NCKX1、NCKX2、NCKX3、NCKX4、NCKX5。
14.权利要求12的测定法，其中所述钠/钙交换体是下列NCX蛋白NCX1、NCX2、NCX3。
15.权利要求12-14的测定法，其中所述钠/钙交换体来源于哺乳动物，优选来源于大 鼠、小鼠、狗、牛、猪、猿或人。
16.权利要求12-15的测定法，其中所述细胞选自CH0、HEK、C0S7和JURKAT细胞。
17.权利要求12-16的测定法，其中将作为能够进入细胞并能够水解成染料的染料前 体的所述有色物质加入细胞中，藉此染料与钙在所述细胞中络合并且发出发光信号。
18.权利要求12-17的测定法，其中所述发光信号是荧光，所述监测步骤c)采用FLIPR装置。
19.权利要求17的测定法，其中所述染料前体是乙酰氧基甲基酯衍生物。
20.权利要求17的测定法，其中所述染料是钙敏感荧光染料fluo-4。
21.权利要求12-20的测定法，其中所述化合物是钠/钙交换体拮抗剂。
22.—种组件试剂盒，所述组件试剂盒包含a)表达(expriming)钠/钙交换体的冻干细胞；b)有色物质；c)化合物缓冲液；和d)有色物质缓冲液。
23.权利要求22的组件试剂盒，其中所述有色物质是钙敏感荧光染料fluo-4。
24.权利要求22和23的组件试剂盒，其中所述钠/钙交换体是下列NCX蛋白NCX1、 NCX2、NCX3 ；或下列 NCKX 蛋白NCKX1、NCKX2、NCKX3、NCKX4、NCKX5。
25.权利要求22和23的组件试剂盒，其中所述钠/钙交换体是下列NCX蛋白NCX1、 NCX2、NCX3。
26.权利要求22-25的组件试剂盒，其中所述钠/钙交换体来源于哺乳动物，优选来源 于大鼠、小鼠、狗、牛、猪、猿或人。
27.权利要求22-26的组件试剂盒在测定化合物作为钠/钙交换体钙输入活性的激动 剂或拮抗剂的活性中的用途。
28.权利要求22-26的组件试剂盒在诊断与钠/钙交换体表达发生改变有关的疾病中 的用途。
全文摘要
转运蛋白是一个新兴的靶标家族，具有巨大的潜力，提供了科学和经济机会。钠/钙交换体是从不同细胞中去除Ca2+的重要机制。在心脏中，它排除通过Ca2+通道进入的Ca2+引起收缩，同时Na+进入心脏细胞。鉴定不仅调节钙输出活性(正向模式)而且还调节钠/钙交换体的钙输入活性(反向模式)的化合物是相当有价值的。本发明涉及用于检测NCX“反向模式”调节化合物的基于荧光的测定法。本发明还涉及包含表达(expriming)NCX的细胞的组件试剂盒，以及所述组件试剂盒在测定化合物作为NCX激动剂或拮抗剂的活性中的用途。
文档编号G01N33/58GK101978270SQ200980110625
公开日2011年2月16日 申请日期2009年3月13日 优先权日2008年3月20日
发明者M·弗赖, S·盖贝尔, T·利歇尔 申请人:赛诺菲-安万特