专利名称：检测重金属胁迫下核仁纤维蛋白定位的免疫荧光方法
技术领域：
本发明属于细胞生物学技术领域，涉及一种快速检测重金属胁迫下核仁蛋白质变
化的定位方法。更具体的说是一种检测重金属胁迫下植物细胞核仁纤维蛋白定位的免疫荧 光方法。该方法为研究重金属毒害植物细胞机理提供新的技术支持。
背景技术：
随着矿产资源的大量开发，农药、化肥的广泛使用以及城市污泥、污水的农用，重 金属对土壤、水体的污染越来越严重。过量重金属(Cd、Cr、Hg、Pb、Cu、Zn、Ag、Sn等)进入 环境，参与水体_ 土壤_生物系统的循环，通过植物的吸收在植物体内大量积累，经食物链 危及动物和人类健康。目前，全球性的重金属污染状况日益严重，如何控制和减轻重金属对 环境的污染和危害，已成为科学家们关注的热点课题。大量研究表明了过量重金属对植物 产生毒害作用，影响植物正常生长发育；引起植物生理、生化的变化；诱导染色体畸变；损 伤细胞结构。 核仁(皿cleolus)是细胞核中一种明显的功能区域。核糖体形成的大多数步骤 发生在核仁中，包括核糖体基因的转录、核糖体RNA前体的加工和rRNA与核糖体蛋白及 5SrRNA的联系等一系列复杂的过程。核仁的功能不仅限于核糖体合成，它还具有其它重要 功能，包括几种小RNA的核苷酸的修饰、信号识别颗粒的生物合成，与基因沉默、衰老和细 胞分裂有关蛋白的时期性的封存和释放等。因此，核仁结构的损伤势必影响其功能的正常 发挥，从而造成细胞多种生命活动的严重障碍。核仁的化学成分主要由DNA、RNA、蛋白质和 酶类等组成，其中以蛋白质为主。利用蛋白质组学方法已鉴定了 350中核仁蛋白，这些蛋白 质与核仁的功能密切相关。 人们利用分子生物学和细胞生物学手段，从不同角度研究重金属对核仁的结构以 及核仁蛋白质分布及功能的影响。硝酸银染色就是用于研究重金属对核仁结构损伤的一种 常用技术，其主要机制是硝酸银能将核仁中酸性非组蛋白染色。发明人利用此技术研究了 不同重金属(Cd、Cr、Cu、Hg、Mn、Ni、Pb、Zn、Al)胁迫对蚕豆、向日葵、洋葱及玉米等植物幼 苗根尖细胞核仁的影响，这些研究结果表明重金属胁迫能够损伤核仁结构，导致核仁中银 染蛋白物质外溢到细胞质中。因此，利用银染技术研究重金属对植物细胞核仁结构的影响， 具有一定的科学价值。但是，银染技术只能鉴定重金属胁迫后，从细胞核外溢到细胞质中的 银染颗粒是核仁蛋白，至于究竟哪些核仁蛋白受到重金属胁迫的影响不能具体鉴定，具有 一定的局限性。 近年来，免疫荧光技术得到了飞速发展，作为一种研究方法或实验手段，已被广泛 地应用于生命科学领域和医学科学领域内，诸如测定生长因子、蛋白质定位、核酸分析、神 经递质研究等。 核仁纤维蛋白是真核细胞内重要的核仁蛋白之一，在进化上具有高度保守性。在 间期细胞内，核仁纤维蛋白定位于核仁的纤维中心(FC)和致密纤维组分(DFC)区域。它主 要参与了核仁在细胞周期中的解体和重建过程，其中包括rRNA的合成加工修饰以及核糖体的组装等。此外，核仁纤维蛋白还是构成核仁骨架的主要蛋白成分之一。但是，利用免疫 荧光技术研究重金属胁迫对核仁纤维蛋白的功能和动态变化的影响尚未见文献报道。

发明内容
本发明的目的是提供一种检测重金属胁迫下植物细胞核仁纤维蛋白定位的免疫 荧光方法，为研究逆境胁迫下细胞中蛋白质定位及变化特征提供了简易、准确、快速的方 法。 本发明人结合实验室前期工作，发明了一种检测重金属胁迫下植物细胞核仁纤维 蛋白定位的免疫荧光方法。该技术的主要原理是将免疫学方法(抗原抗体特异结合)与荧 光标记技术结合起来，研究特异蛋白抗原在细胞内分布的方法。由于荧光素所发的荧光可 在荧光显微镜下检出，从而确定抗原或抗体的性质、定位，以及利用定量技术测定含量。特 别是本发明涉及的压片方法的改革，能够提高观察细胞数目，可适用于其它细胞生物学研 究。为达到上述目的，本发明提供如下的技术方案 —种快速检测重金属胁迫下植物细胞核仁纤维蛋白定位的免疫荧光方法，其特征 在于，按如下的步骤进行 (1)切取重金属处理后的植物根尖分生组织细胞，于4%多聚甲醛中固定l-2h ;经 PBS缓冲液洗； (2)采用2. 5%纤维素酶+2. 5%果胶酶酶液于37t:温箱酶解；经PBS缓冲液洗涤 后压片； (3)将植物根尖转至离心管中，滴加PBS缓冲液，手摇震荡至多数细胞游离状态， 用滴管吸取约0. 1-0. 2ml样品液，均匀涂于载玻片上分散成单个细胞，标记后自然风干后 备用； (4)将(3)得到的载玻片放在1 % TritonX-100浸泡15-20分钟；经PBS缓冲液洗 涤； (5)在(4)得到的载片上滴入15-20 iU配好的一抗，盖上盖玻片，37t:温箱孵育 lh-l. 5h ;再经PBS缓冲液洗涤； (6)再将(5)得到的载片上滴入15-20 iU配好的二抗，盖上盖玻片，37t:温箱孵育 45min-lh ;经PBS缓冲液洗涤； (7)再将(6)的载玻片上滴加15-20 ii 1 DAPI，盖上盖玻片；经PBS缓冲液洗涤；
(8)用滤纸吸干多余PBS，滴加5-10 ii 1防淬灭剂于载玻片材料上，盖上盖玻片，用 指甲油将盖玻片四周封好，l-2h后在荧光显微镜下观察。 本发明所述的检测重金属胁迫下植物细胞核仁纤维蛋白定位的免疫荧光方法，其
中步骤(2)中酶解所用时间是指在镜检时如果观察到大部分细胞均分散开，成一层球形
原生质体，其中少量细胞的细胞质已经解体，只剩下细胞核时，即结束酶解。 本发明所述的检测重金属胁迫下植物细胞核仁纤维蛋白定位的免疫荧光方法，其
中步骤(2)中所述的压片是指酶解后直接将样品制成悬浮液状态，然后，均匀地滴在载玻
片上，不盖载玻片，自然风干后备用。 本发明所述的检测重金属胁迫下植物细胞核仁纤维蛋白定位的免疫荧光方法，其 中的一抗为鼠抗核仁纤维蛋白单克隆抗体，其浓度为0. 5mg/ml。
本发明所述的检测重金属胁迫下植物细胞核仁纤维蛋白定位的免疫荧光方法，其 中的二抗为FITC-兔抗鼠IgG其浓度为0. 75mg/ml。 本发明所述的检测重金属胁迫下植物细胞核仁纤维蛋白定位的免疫荧光方法，其 中DAPI (4， 6- 二胺-2苯基吲哚-二盐酸)的浓度为1 y g/ml 。 本发明所述的检测重金属胁迫下植物细胞核仁纤维蛋白定位的免疫荧光方法，其 中的1% Triton X-100为聚乙二醇辛基苯基醚(曲拉通)。 本发明所述的检测重金属胁迫下植物细胞核仁纤维蛋白定位的免疫荧光方法，其 中的防淬灭剂为lOXlml。 本发明所述的检测重金属胁迫下植物细胞核仁纤维蛋白定位的免疫荧光方法，其 中的重金属为Cd、 Cr、 Cu、 Hg、 Mn、 Ni、 Al、 Pb或Zn。优选Cd、 Pb、 Al、 Cr、 Cu、 Hg，特别优选 Cd、Pb和Al。 本发明的检测重金属胁迫下植物细胞核仁纤维蛋白定位的免疫荧光方法，其中所
述的植物细胞包括蚕豆、洋葱、向日葵和小麦根尖细胞中核仁纤维蛋白的变化。 本发明的检测重金属胁迫下植物细胞核仁纤维蛋白定位的免疫荧光方法，能够对
重金属胁迫后，细胞内核仁纤维蛋白的变化进行精确定位。 本发明用到的用于固定样品的多聚甲醛试剂属危险化学品，请注意适当防护。多 聚甲醛在冷水中不易溶解，配制时要放置在通风橱中，9(TC搅拌加热至溶解(呈透明色)，
冷却至室温后，倒入棕色瓶中，4t:保存待用。 本发明酶解所需的时间，要根据样品酶解的具体情况而定。根据本发明人的经验， 在镜检时观察到大部分细胞均分散开，成一层球形原生质体，其中少量细胞的细胞质已经 解体，只剩下细胞核时结束酶解，获得的效果最佳。酶解后直接将样品制成悬浮液状态，然 后，均匀地滴在载玻片上，不用盖盖玻片，自然风干后备用。这种方法减去了常规压片中盖 片和揭片两个步骤，避免了在这两个步骤的操作中对细胞的损伤。
更加详细的实验步骤如下 以植物根尖为实验材料，待根生长长度约1. 5cm左右时，进行不同重金属胁迫实 验。
(1)切取重金属处理后的根尖分生组织细胞，于4%多聚甲醛中固定l-2h。
(2) PBS缓冲液(pH7. 0)中洗3次(每次10分钟)。 (3)2. 5%纤维素酶+2. 5%果胶酶，37。C温箱酶解，根据细胞酶解情况确定时间。
(4) PBS缓冲液洗3次(每次10分钟)。 (5)将根尖转至0.5ml的离心管中，滴加PBS缓冲液少量(适样品多少而定)，盖 离心管盖，手摇震荡至多数细胞游离状态。用滴管吸取约O. l-0.2ml样品液，均匀涂于载片 上分散成单个细胞，不盖盖玻片，用记号笔在载片的无样品面标记，自然风干后备用。
(6)将要标记的切片放在1% TritonX-lOO聚乙二醇辛基苯基醚(曲拉通)浸泡 20分钟。 (7) PBS缓冲液洗3次(每次10分钟)。 (8)用滤纸吸干多余的PBS缓冲液，滴一滴(20 y 1)配好的一抗(与核仁纤维蛋白 结合)至载玻片的样品处，盖上盖玻片，37t:温箱孵育lh-1.5h。需要强调的是购买的抗 体要尽快分装，分装可以最大程度地降低反复冻融对抗体活性的损害，同时也降低了由于多次从同一管中吸取抗体造成的污染可能性。
(9) PBS缓冲液中洗3次(每次10分钟)。 (10)用滤纸吸干多余的PBS缓冲液，滴一滴(20 1)配好的二抗(与一抗结构的 荧光素)至载玻片的样品上，盖上盖玻片。37t:温箱孵育45min-lh。
(11) PBS缓冲液中洗3次(每次10分钟)。 (12)DAPI(DNA染料)染色用滤纸吸干多余的PBS缓冲液，滴一滴(20iU)DAPI盖 上载玻片。 (13) PBS缓冲液中洗3次(每次10分钟)。 (14)用滤纸吸干多余PBS，滴一滴(10 ii 1)防淬灭剂于载玻片材料上，盖上盖玻 片，用指甲油将盖玻片四周封好，lh后可在荧光显微镜下观察。 (15)荧光显微镜观察核仁纤维蛋白用蓝光450 490nm(FITC)激发呈绿色荧 光。DNA(细胞核和染色体)用紫外光355 425nm(DAPI)激发呈蓝色荧光。
本发明所用到主要试剂的配置及保存 (1) —抗鼠抗核仁纤维蛋白单克隆抗体(mouse monoclonal
anti-Fibrillarinantibody)，购自Santa(美国)公司。 一抗浓度为0. lmg/ml，每个包装为
0.2ml。购买后按每管10iiL分装于1.5ml离心管中，-2(TC保存。待用时解冻。使用前用
PBS缓冲液(pH7. 4)稀释至1.5ml即可(相当于稀释了 150倍)，4"保存。 (2) 二抗FITC-兔抗鼠IgG (Fluorescein-conjugated rabbit anti-Mouse
IgG(H+L))，购自Sigma(美国)公司。原装进口为冻干粉，2. Oml ;进口分装为液体，
0. lml(另加O. lml甘油)。按每管10iiL分装于0.5ml离心管中，-2(TC避光保存。待用时
解冻，用PBS buffer (pH7. 6)稀释至0. 5ml即可(相当于稀释了 50倍)，4。C避光保存待用 (3) DAPI (4， 6- 二胺_2苯基吲哚-二盐酸)DAPI主要染核酸中DNA，储存液用无离
子水配成lmg/ml浓度，4t:避光保存备用，使用终浓度为1 y g/ml，4t:避光保存。紫外光激
发，细胞核和染色体呈蓝色荧光。 (4)磷酸盐缓冲液(PBS缓冲液) NaCl 0. 14mM 0. 0082g/L KC12. 7mM 0. 2013g/L Na2HP04 8. OmM 2. 8651g/L NaH2P04 1. 5mM 0. 2041g/L 加无离子水至1L，用0. lMNaH2P04调pH至7. 0 (5)固定剂4%多聚甲醛(paraformaldehyde in PBS buffer):购自Sigma(美 国)公司。称多聚甲醛白色粉末lg，量取25ml PBS buffer于烧杯中，盖盖儿，放置在通风 橱中，9(TC搅拌加热至溶解(呈透明色)，冷却至室温后，倒入棕色瓶中，4t:保存待用。固定 剂4%多聚甲醛，主要是杀死细胞，维持细胞在活体时的结构状态。 (6)酶液(2. 5% Cellulase纤维素酶+2. 5 % Pectolase果胶酶)购自Yakult Honsha(日本)公司。 一般配制5ml酶液，分别称0. 125g Cellulase和O. 125g Pectolase， 于5ml无离子水中，充分溶解后，分装于4支1. 5ml的离心管中，_24°0保存备用。主要作用 去除细胞壁(纤维素和果胶)。 (7)1% Triton X-100聚乙二醇辛基苯基醚(曲拉通)购自上海化学试剂公司。一般配25ml，取O. 25ml Triton X-100加到25ml PBS buffer中，现用现配。这是一种优异
的表面活性剂、润湿及洗涤剂，破细胞膜，即在细胞膜上打孔，使抗体进入。 (8)抗荧光淬灭封片液(Antifade mounting medium):购自上海杰美基因公司。 (9)指甲油市场购置。 本发明的实验中应注意的几个问题 (1)抗体的活性决定了使用效果，如果抗体保存得当，大部分抗体活性都可以维持
数月甚至数年。因此，买来的抗体要尽快分装，分装可以最大程度的降低反复冻融对抗体活
性的损害，同时也降低了由于多次从同一管中吸取抗体造成的污染可能性。
(2)酶解是本实验关键的步骤之一，酶解时间依细胞具体情况而定。根据我们的经
验，在镜检时如果观察到大部分细胞均分散开，成一层球形原生质体，其中少量细胞的细胞
质已经解体，只剩下核时结束酶解。 (3)压片方法也是本实验成功的关键步骤。本发明对传统的制片方法进行了改革。 酶解后直接将样品制成悬浮液状态，然后，均匀地滴在载玻片上，不用盖盖玻片，自然风干 后备用。这种方法减去了常规压片中盖盖片和揭片两个步骤，避免了在这两个步骤的操作 中对细胞的损伤。 本发明与现有技术相比所具有的积极效果在于 (1)本发明通过免疫荧光定位技术，对重金属胁迫后的核仁纤维蛋白的变化进行 精确定位。利用上述方法已经观察了在Cd、Pb和Al胁迫下，蚕豆和洋葱根尖细胞中核仁纤 维蛋白的变化，取得了很好的结果。 (2)本发明的检测技术具有特异性高、实验结果准确等特点。本发明中对常规压片 方法进行了改革，使操作步骤更加简便易行、大大提高了观察细胞数目等优点。该方法为研 究重金属等逆境胁迫下对细胞中蛋白质的影响提供科学依据。为探讨重金属毒害细胞机理 提供了精确的检测方法，其方法具有广阔的应用前景。


图1包括 图中A为未经重金属胁迫的细胞中核仁纤维蛋白的分布。其中Al :绿色荧光显示 核仁纤维蛋白；A2 :蓝色荧光显示细胞核(DNA) ;A3 :合成图。 图中B、 C为重金属胁迫后细胞中核仁纤维蛋白在细胞中的定位，显示细胞核中的 核仁纤维蛋白在重金属的胁迫下外溢到细胞质中。
Bl :绿色荧光显示核仁纤维蛋白；B2 :蓝色荧光显示细胞核(DNA) ;B3 :合成图；
Cl :绿色荧光显示核仁纤维蛋白；C2 :蓝色荧光显示细胞核(DNA) ;C3 :合成图；
图2为银染实验结果图；其中未经重金属胁迫的细胞核仁呈深棕色处于细胞核中 (图2a) 。 CcT处理后，发现一些与核仁银染反应相同的细小颗粒分布在细胞质内(图2b)。 这些银染颗粒的数量随着Cd2+浓度升高和处理时间的延长而增多(图2c)。
具体实施例方式
以下结合实施例用来帮助理解本发明，并且不用于也不应被解释为以任何方式对 所列出的权利要求中发明的限制。本发明所用到的各种试剂均有市售。
实施例1 材料培养以蚕豆为例蚕豆主(侧)根根长约1.5cm时，用10 ii M、50 ii M、 100 ii M 的CcT处理24h、48h、72h。 (1)切取重金属处理后的蚕豆植物根尖分生组织细胞，于4%多聚甲醛中固定2h ; 经PBS缓冲液洗； (2)采用2. 5%纤维素酶+2. 5%果胶酶酶液于37。C温箱酶解；经PBS缓冲液洗涤 后压片； (3)将蚕豆植物根尖转至离心管中，滴加PBS缓冲液，手摇震荡至多数细胞游离状 态，用滴管吸取约O. lml样品液，均匀涂于载玻片上分散成单个细胞，标记后自然风干后备 用； (4)将(3)得到的载玻片放在1 % TritonX-100浸泡15分钟；经PBS缓冲液洗涤；
(5)在(4)得到的载片上滴入15 配好的一抗，盖上盖玻片，37t:温箱孵育lh ; 再经PBS缓冲液洗涤； (6)再将(5)得到的载片上滴入15iU配好的二抗，盖上盖玻片，37t:温箱孵育 45min-lh ;经PBS缓冲液洗涤； (7)再将(6)的载玻片上滴加15 1 DAPI，盖上盖玻片；经PBS缓冲液洗涤；
(8)用滤纸吸干多余PBS，滴加5 1防淬灭剂于载玻片材料上，盖上盖玻片，用指 甲油将盖玻片四周封好，lh后在荧光显微镜下观察。 (9)荧光显微镜观察及图像分析处理制片用NIKON公司(日本)HB-10101AF型 荧光显微镜观察，Pixera Pro 600CL CCD数码照相。图像采集为1392X 1040象素，图像的 后期处理利用Photoshop 7. 0软件排版。核仁纤维蛋白由FITC标记，蓝光450 490nm激 发，呈绿色荧光(见图1中A1， Bl， C1)，细胞核由DAPI染色，紫外光355 425nm激发，呈 蓝色荧光(见图1中A2， B2， C2)。图1中A3， B3， C3为合成图。
实施例2 材料培养以向日葵为例，向日葵根根长约l. 5cm时，用10iiM、50iiM、100iiM的Pb"
处理24h、48h、72h。 实验步骤 (1)切取重金属处理后的根尖约2mm，于4%多聚甲醛中固定2h。
(2) PBS缓冲液(pH7. 0)中洗3次(每次10分钟)。 (3)2. 5%纤维素酶+2. 5%果胶酶，37。C温箱酶解，在酶解过程中随时镜检，直到有
大量的球形原生质体产生结束酶解。 (4) PBS缓冲液洗3次(每次10分钟)。 (5)将根尖转至0.5ml的离心管中，滴加PBS缓冲液少量(适样品多少而定)，盖 离心管盖，手摇震荡至多数细胞游离状态。用滴管吸取约O. 2ml样品液，均匀涂于载片上分 散成单个细胞，不盖盖玻片，用记号笔在载片的无样品面标记，自然风干后备用。
(6)将要标记的切片放在1% Triton X-100中抽提20min。
(7) PBS缓冲液洗3次(每次10分钟)。 (8)用滤纸吸干多余的PBS缓冲液，用经PBS稀释的一抗(鼠抗核仁纤维蛋白单克
隆抗体，工作浓度i : 150)37t:孵育lh或4t:孵育过夜。
(9) PBS缓冲液中洗3次(每次10分钟)。 (10)用滤纸吸干多余的PBS缓冲液，滴一滴(20 ii 1)配好的二抗(兔抗鼠IgG，工 作浓度l : 50)至载玻片上的样品处，盖上盖玻片，37t:温箱孵育45min-lh。
(11) PBS缓冲液中洗3次(每次10分钟)。 (12)DAPI染色用滤纸吸干多余PBS缓冲液，滴一滴(20iU)DAPI，盖上盖玻片。
(13) PBS缓冲液中洗3次(每次10分钟)。 (14)用滤纸吸干多余PBS，滴一滴(10 ii 1)防淬灭剂于载玻片材料上，盖上盖玻 片，用指甲油将盖玻片四周封好，lh后可在荧光显微镜下观察。 (15)荧光显微镜观察及图像分析处理制片用NIKON公司(日本)HB-10101AF型 荧光显微镜观察，Pixera Pro 600CL CCD数码照相。图像采集为1392X 1040象素，图像的 后期处理利用Photoshop 7. 0软件排版。核仁纤维蛋白由FITC标记，蓝光450 490nm激 发，呈绿色荧光(见图1中A1， Bl， C1)，细胞核由DAPI染色，紫外光355 425nm激发，呈 蓝色荧光(见图1中A2， B2， C2)。图1中A3， B3， C3为合成图。
实施例3 洋葱根尖细胞中核仁Fibrillarin蛋白质的变化 材料培养以洋葱为例洋葱不定根根长约1.5cm时，用10iiM、50iiM、100iiM的 Al3+处理24h、48h、72h。
实验步骤 (1)切取重金属处理后的根尖约2mm，于4X多聚甲醛中固定2h。
(2) PBS缓冲液(pH7. 0)中洗3次(每次15分钟)。 (3)2. 5%纤维素酶+2. 5%果胶酶，371:温箱酶解，在酶解过程中随时镜检，直到有
大量的球形原生质体产生结束酶解。 (4) PBS缓冲液洗3次(每次15分钟)。 (5)将根尖转至0.5ml的离心管中，滴加PBS缓冲液少量(适样品多少而定)，盖 离心管盖，手摇震荡至多数细胞游离状态。用滴管吸取约O. lml样品液，均匀涂于载片上分 散成单个细胞，不盖盖玻片，用记号笔在载片的无样品面标记，自然风干后备用。
(6)将要标记的切片放在1% Triton X-100中抽提20min。 [cms] (7)PBS缓冲液洗3次(每次15分钟)。 (8)用滤纸吸干多余的PBS缓冲液，用经PBS稀释的一抗(鼠抗核仁纤维蛋白单克
隆抗体，工作浓度i : 150)37t:孵育lh或4t:孵育过夜。 (9) PBS缓冲液中洗3次(每次10分钟)。 (10)用滤纸吸干多余的PBS缓冲液，滴一滴(20iU)配好的二抗(兔抗鼠IgG，工
作浓度l : 50)至载玻片上的样品处，盖上盖玻片，37t:温箱孵育45min。 (11) PBS缓冲液中洗3次(每次10分钟)。 (12)DAPI染色用滤纸吸干多余的PBS缓冲液，滴一滴(20iU)DAPI盖上盖玻片。 (13) PBS缓冲液中洗3次(每次10分钟)。 (14)用滤纸吸干多余PBS，滴一滴(lOiU)防淬灭剂于载玻片材料上，盖上盖玻 片，用指甲油将盖玻片四周封好，lh后可在荧光显微镜下观察。 (15)荧光显微镜观察及图像分析处理制片用NIKON公司(日本)HB_10101AF型荧光显微镜观察，Pixera Pro 600CL CCD数码照相。图像采集为1392X 1040象素，图像的 后期处理利用Photoshop 7. 0软件排版。核仁纤维蛋白由FITC标记，蓝光450 490nm激 发，呈绿色荧光(见图1中A1， Bl， C1)，细胞核由DAPI染色，紫外光355 425nm激发，呈 蓝色荧光(见图1中A2， B2， C2)。图1中A3， B3， C3为合成图。
实施例4
对比试验 银染技术(Ag-N0R染色技术)与本发明技术的比较试验 银染原理Ag-NOR染色技术能够特异地与细胞中核仁形成区(NOR)染色。当位于 此处的18S、28S核糖体RNA的基因(rDNA)具有转录活性时，应用银染技术可使NOR特异性 着色(棕黄色)。现已进一步证明银染物质不是rDNA，亦不是rRNA，可能是核仁形成区特异 的蛋白质，即和rRNA转录相联系的酸性蛋白。 材料培养以蚕豆为例，蚕豆根长约1.5cm时，用10iiM、50iiM、100iiM的Ccf+处理
24h、48h、72h。 实验步骤 (1)切取重金属处理后的根尖约2mm，于固定液(酒精醋酸=3 : 2)中固定lh。
(2)无离子水中洗3次(每次IO分钟)。 (3)置于6(TC恒温水浴锅中，用水解液(1NHC1 :酒精醋酸=5:3:2)水解 9min。 (4)无离子水中洗3次(每次10分钟)。 (5)根尖用45%乙酸压片，室温下干燥过夜，揭片。 (6)在干燥切片上加入1滴2 %明胶溶液和2滴50 % AgN03水溶液，混匀，加盖片，
室温下浸染。 (7)待核仁呈棕黄色、细胞质呈浅黄色时，用蒸馏水将染色液淋洗干净。
(8)在0.001%亚甲基兰水溶液复染，至染色质呈绿色。
(9)用蒸馏水将染色液淋洗干净，室温下干燥。
(10)光学树脂封片，显微镜下观察。 (11)显微镜观察及图像分析处理制片用VAN0X-AHB型Olympus显微镜(日本) 观察，Pixera Pro 600CL CCD数码照相。图像采集为1392X 1040象素，图像的后期处理利 用Photoshop 7. 0软件排版。经AgN03染色，核仁呈棕黄色、细胞质呈浅黄色，染色体由亚 甲基兰染色，呈绿色(见图2)。 银染方法结果未经重金属胁迫的细胞核仁呈深棕色处于细胞核中(图2a) 。 Cd2+ 处理后，发现一些与核仁银染反应相同的细小颗粒分布在细胞质内(图2b)。这些银染颗粒 的数量随着Cd2+浓度升高和处理时间的延长而增多(图2c)。 采用本发明的方法测定及结果图1A显示未经重金属胁迫的细胞中核仁纤维蛋 白位于核仁内。重金属胁迫后细胞中核仁纤维蛋白分布在核质(图1B)，并进一步外溢到细 胞质中(图1C)。
两种实验方法的比较 利用银染技术研究对重金属对植物细胞核仁结构的影B向，具有一定的科学价值。 但是，银染技术只能鉴定重金属胁迫后，从细胞核外溢到细胞质中的银染颗粒是核仁中嗜银的酸性蛋白，不能鉴定是哪些种核仁蛋白受到重金属胁迫的影响，对深入研究重金属毒 害机理有一定的局限性。 本发明通过免疫荧光定位技术，对重金属胁迫后的核仁纤维蛋白的变化进行精确 定位，具有特异性高、实验结果准确等特点。本发明的检测技术可以进一步深入检测重金属 对具体的核仁结构成分造成的影响。该方法为研究重金属等逆境胁迫下对细胞中蛋白质的 影响提供科学依据，为探讨重金属毒害细胞机理提供了精确的检测方法，其方法具有广阔 的应用前景。 在详细说明的较佳实施例之后，熟悉该项技术人士可清楚地了解，在不脱离上述 申请专利范围与精神下可进行各种变化与修改，凡依据本发明的技术实质对以上实施例所 作的任何简单修改、等同变化与修饰，均属于本发明技术方案的范围。且本发明亦不受说明 书中所举实例实施方式的限制。
权利要求
一种快速检测重金属胁迫下植物细胞核仁纤维蛋白定位的免疫荧光方法，其特征在于，按如下的步骤进行(1)切取重金属处理后的植物根尖分生组织细胞，于4％多聚甲醛中固定1-2h；经PBS缓冲液洗；(2)采用2.5％纤维素酶+2.5％果胶酶酶液于37℃温箱酶解；经PBS缓冲液洗涤后压片；(3)将植物根尖转至离心管中，滴加PBS缓冲液，手摇震荡至多数细胞游离状态，用滴管吸取约0.1-0.2ml样品液，均匀涂于载玻片上分散成单个细胞，标记后自然风干后备用；(4)将(3)得到的载玻片放在1％TritonX-100浸泡15-20分钟；经PBS缓冲液洗涤；(5)在(4)得到的载片上滴入15-20μl配好的一抗，盖上盖玻片，37℃温箱孵育1h-1.5h；再经PBS缓冲液洗涤；(6)再将(5)得到的载片上滴入15-20μl配好的二抗，盖上盖玻片，37℃温箱孵育45min-1h；经PBS缓冲液洗涤；(7)再将(6)的载玻片上滴加15-20μl DAPI，盖上盖玻片；经PBS缓冲液洗涤；(8)用滤纸吸干多余PBS，滴加5-10μl防淬灭剂于载玻片材料上，盖上盖玻片，用指甲油将盖玻片四周封好，1-2h后在荧光显微镜下观察。
2. 权利要求l所述的检测方法，其中步骤(2)中酶解所用时间是指在镜检时如果观察到大部分细胞均分散开，成一层球形原生质体，其中少量细胞的细胞质已经解体，只剩下细胞核时，即结束酶解。
3. 权利要求l所述的检测方法，其中步骤(2)中所述的压片是指酶解后直接将样品制成悬浮液状态，然后，均匀地滴在载玻片上，不盖盖玻片，自然风干后备用。
4. 权利要求1所述的检测方法，其中所述的PBS缓冲液洗是指采用PBS缓冲液洗3次，每次10-15分钟。
5. 权利要求1所述的检测方法，其中的一抗为鼠抗核仁纤维单克隆抗体，其浓度为0. 5mg/ml 。
6. 权利要求l所述的检测方法，其中的二抗为FITC-兔抗鼠IgG其浓度为O. 75mg/ml。
7. 权利要求1所述的检测方法，其中DAPI的浓度为1 y g/ml。
8. 权利要求1所述的检测方法，其中的防淬灭剂为10Xlml。
9. 权利要求1所述的检测方法，其中的重金属为Cd、Cr、Cu、Hg、Mn、Ni、As、Pb、Co、Ag或Zn。
10. 权利要求1所述的检测方法，其中所述的植物细胞包括蚕豆、洋葱、向日葵或玉米。
全文摘要
本发明公开了一种检测重金属胁迫下植物细胞核仁纤维蛋白定位的免疫荧光方法。它是切取重金属处理后的植物根尖分生组织细胞，于4％多聚甲醛中固定1h；采用酶液酶解后；用滴管吸取约0.1ml样品液，均匀涂于载玻片上分散成单个细胞，标记后自然风干，放在1％TritonX-100浸泡15分钟；然后滴入15μl配好的一抗，盖上盖玻片，37℃温箱孵育1h；再滴入15μl配好的二抗，处理后滴加15μl DAPI，最后滴加5μl防淬灭剂于载玻片材料上，盖上盖玻片，用指甲油将盖玻片四周封好，1h后在荧光显微镜下观察。本发明的检测方法具有特异性高、实验结果准确，大大提高了观察细胞数目等特点。该方法为探讨重金属毒害细胞机理提供了精确的检测方法，其检测方法具有广阔的应用前景。
文档编号G01N33/68GK101782582SQ20101003132
公开日2010年7月21日 申请日期2010年1月11日 优先权日2010年1月11日
发明者刘东华, 张慧敏, 张闪闪, 秦蓉 申请人:天津师范大学