专利名称：一种评价cd20靶位治疗药物及手段的体外检测方法
技术领域：
本发明属于生物医药技术领域，具体涉及一种评价CD20靶位治疗药物及手段的体外检测方法。
背景技术：
淋巴瘤是一组起源于淋巴结或其他淋巴组织的恶性肿瘤。近年来在我国的发病率 逐年上升，死亡率约为I. 5/10万，占所有恶性肿瘤死亡率的第11 13位。淋巴瘤可分为霍奇金淋巴瘤(简称HD)和非霍奇金淋巴瘤(简称NHL)两大类，其中NHL是最常见的血液系统恶性肿瘤，也是发病率增长最快的恶性肿瘤之一。在NHL患者中，约85% 90%是B细胞淋巴瘤，严重危害人类健康，并且以目前的医疗水平即使用大量的放化疗或造血干细胞移植等治疗手段依然不能解决这一难题。研究表明，CD20是B淋巴细胞和B淋巴瘤细胞表面专有的膜表面蛋白，表达于早期B细胞和成熟B细胞阶段，分化为浆细胞后CD20表达消失。CD20分子在非霍奇金淋巴瘤和多发性骨髓瘤等疾病中的表达量异常增高。超过90%的B细胞淋巴瘤患者的瘤细胞膜上有⑶20分子表达，且表面密度很高。由此可见，⑶20分子是治疗非霍奇金淋巴瘤(NHL)理想的靶分子。研制具有新型治疗机制且毒副作用较低的抗CD20单克隆抗体就可能专一性地杀伤B淋巴瘤细胞，达到较好的治疗效果。在生物治疗药物及手段的开发过程中，为了便于大量具有生物活性治疗药物及手段的筛选，研究人员需要建立一种快速、高效的检测手段来准确考察待选治疗药物及手段的生物活性、效果及其稳定性。这种方法必须满足下列几个条件首先，该方法最好是体夕卜实验，基于细胞水平，如 ADCC (Antibody-Dependent Cell-Mediated Cytotoxicity),Q)C (Complement Dependent Cytotoxicity)、直接效应等,或基于酶促反应；其次,该方法的实验机理与该药物及手段在体内的作用机理应尽可能一致，通过体外实验能够真实的反应该治疗药物及手段在体内作用的疗效，包括在细胞系的选择上也应尽量与真实病患情况接近；第三，该方法必须通过方法验证，满足方法专属性、准确性、精密度以及耐用性等方面的要求，如针对同一样品检测的重复性、日间差人员操作误差等结果的RSD应该满足小于10%，在此基础上，才能保证生物活性检测结果的可靠，并用于指导治疗药物及手段筛选工作；最后，在相同的实验条件下，该方法越简单、操作步骤越少越好，因为这样的方法更加灵活，更有利于推广，并且适用于高通量工作。以基于靶分子⑶20进行生物治疗药物及手段的研发为例，B淋巴瘤细胞过量表达CD20,以CD20为靶抗原，在体内杀伤B淋巴瘤细胞的作用有三，分别是ADCC作用、CDC作用和细胞凋亡，其中最主要机制之一为CDC作用，即通过特异性抗体与细胞膜表面相应抗原结合，形成复合物而激活补体经典途径，所形成的攻膜复合物对靶细胞发挥裂解效应。根据实验设计作用机理一致性原则，研究人员通常利用该治疗药物及手段对高表达CD20细胞的体外杀伤作用来评价其生物活性及效果。常用的高表达CD20的细胞系主要是人B淋巴瘤细胞Daudi。然而到目前为止，从文献报道来看，该杀伤的细胞学活性方法并未得到公认或标准化，例如细胞系的选择，细胞铺板密度，治疗药物及手段作用时间，显色时间以及显色方式等都各不相同。更重要的是，在已经报道的杀伤活性方法中，也缺乏对检测体系专属性、准确性、重复性等方面的相关评价 ，包括对实验结果的评价方式也存在不同，难以保证检测结果的稳定性与可靠性。

发明内容
本发明所要解决的技术问题是针对以上存在的问题与不足，提供一种在评价CD20靶位治疗药物及手段过程中，对具有生物活性治疗药物及手段进行筛选以及稳定性评价的细胞杀伤生物活性检测方法。该方法能够满足方法验证过程中对专属性、准确性、精密度包括重复性、日间差、人员操作误差，以及耐用性等方面的要求，能够对大量生物活性治疗药物及手段进行快速、准确、高通量的筛选，满足治疗药物及手段在研发过程中的需求。为此，本发明公开了一种评价⑶20靶位治疗药物及手段的体外检测方法，包括下列步骤
a取对数生长期表达CD20的细胞，用基础培养基制成细胞悬液，计数并计算细胞密度及活率，调整至合适的活细胞密度为nX IO5个/ml，n=6_10，将细胞悬液等体积加入细胞培养板孔中，同时设立空白对照孔，空白对照孔加入等体积基础培养基；
b取对照品及待测样品，用基础培养基进行系列梯度稀释，得到系列稀释浓度的对照品及待测样品；
c将系列稀释浓度的对照品及待测样品依次加入步骤a所述细胞培养板孔中，空白对照孔则加入等体积的基础培养基，然后将细胞培养板放置于37°C、5% 二氧化碳培养箱中培养 10-20min ；
d取人血清，用基础培养基进行稀释，依次加入步骤c所述细胞培养板孔和空白对照孔中，使人血清的浓度为3%-7%，然后将细胞培养板放置于37°C、5% 二氧化碳培养箱中培养45_75min ；
e采用检测活细胞或死细胞量的检测体系对细胞培养板进行显色反应；f显色反应完成后，测定显色反应的结果，并根据测定结果计算待测样品的细胞杀伤生物活性。本发明术语“对照品”是指已公知其对表达⑶20的细胞表现出细胞杀伤作用活性的化合物或组合物。在一些实施例中，所述及CD20靶位治疗药物是单克隆抗体、激酶抑制剂、反义寡核苷酸、化合物、中药提取物或中药复方提取物中之一或它们的任何组合，其中优选为单克隆抗体。在一些实施例中，所述对数生长期表达⑶20的细胞是人B淋巴瘤细胞Daudi。在一些实施例中，所述基础培养基是RPMI1640培养基。在一些实施例中，所述系列梯度稀释是2倍系列梯度稀释。在一些实施例中，在步骤e中，所述检测活细胞或死细胞量的检测体系包括四唑类化合物氧化还原检测体系、ATP总量检测体系或LDH释放量检测体系等。在一些实施例中，所述四唑类化合物为阶1\10^、00(-8，其中优选为00(-8。相对于其他四唑类化合物如MTT，MTS而言，CCK-8所形成的还原显色物质可直接溶于水相，无需添加DMSO助溶，因此使用更加方便，检测灵敏度也较高。
在一些实施例中，所述细胞培养板为96孔细胞培养板，以便于高通量地进行药物评价。本发明能够快速、准确、高效的对针对CD20靶位治疗药物及手段的细胞杀伤生物活性进行检测。该方法专属性好、特异性强、准确性高，活性测定范围达到50%-150% ;精密度高，重复性、日间差以及人员操作误差RSD均小于10%，并且双复孔的CV%小于20%，4参数拟合的拟合常数R2均大于O. 98。此外，本发明并不需要十分昂贵的仪器和繁琐的操作，便于推广以及高通量操作，完全能够满足其在进行具有针对CD20靶位，通过CDC作用杀伤细胞，具有生物活性治疗药物及手段的筛选及其稳定性评价的需要。


图I Rituximab及参考品4参数拟合图。图2 Infliximab 4 参数拟合图。
图3加入1%和5%补体保留正常人血清条件下100%参考品和75%参考品4参数拟合图。图4加入20%和5%补体保留正常人血清条件下100%参考品和75%参考品4参数拟合图。
具体实施例方式以下结合具体实施例，进一步阐述本发明。这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或按照制造厂商所建议的条件。除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明方法中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。一、材料和试剂
材料针对0)20靶位单克隆抗体药物Rituximab(产于Roche，批号B6109)，针对CD20靶位单克隆抗体药物参考品(嘉和生物药业制备)，针对CD20靶位单克隆抗体药物待测样品(嘉和生物药业制备)，不针对⑶20祀位的单克隆抗体药物Infliximab (产于强生,批号AM05014)。试剂染色液CCK-8(Dojindo，Cat. No. CK04-20)，RPMI1640 培养基粉末(GIBCO，Cat. No. 31800-022)，链霉素 / 青霉素双抗(GIBCO，Cat. No. 15070-063)，FBS (GIBCO,Cat. No. 10099-141)。溶液配制
RPMI1640培养基取IOOOml烧杯，倒入RPMI1640培养基粉末I袋，碳酸氢钠2. 0g，力口入约900ml超纯水，避光磁力搅拌直至溶解，用稀盐酸调pH值至7. 00 ±0. 05，将溶液倒入量筒，定容至1000ml，经0. 22 μ m滤膜无菌过滤即得，分装后4°C避光保存。细胞株Daudi细胞株(购于中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库，目录号TCHuI40)。二、检测方法步骤
O细胞铺板取对数生长期Daudi细胞用RPMI1640基础培养基制成单细胞悬液。计数并计算细胞密度及活率，调整活细胞密度至6. 0-10. OX IO5个/ml，以100 μ I/孔加入96孔细胞培养板中。空白对照孔则以100 μ I/孔加入RPMI1640基础培养基。2)参考品及待 测样品稀释取对照品及待测样品，根据标不浓度，用RPMI1640基础培养基稀释至合适浓度，在新的96孔细胞培养板中做2倍系列梯度稀释，得到11个稀释度。3)加样取步骤I)中的细胞培养板，将稀释好的系列稀释浓度的对照品及待测样品以50 μ I/孔依次加入铺好细胞的细胞培养板孔中，空白对照孔则以50 μ I/孔加入基础培养基，2-3复孔。完成后将细胞培养板放置于37°C、5% 二氧化碳培养箱中培养10-20min。4)取人血清，用基础培养基稀释至合适浓度，然后以50 μ I/孔加入步骤3)中的细胞培养板孔和空白对照孔中，使得人血清的浓度为3%-7%。5)显色采用CCK-8显色体系分别于细胞培养板中对照品孔、待测样品孔、空白对照孔中以20 μ I/孔加入CCK-8，完成后将细胞培养板放置于37°C、5% 二氧化碳培养箱中继续孵育3. 5-4. 5h。6)读数取出细胞培养板混匀，放入酶标仪，以650nm为参比波长，在450nm下测
定对照品孔、待测样品孔及空白对照孔的OD45tl.,记录测定结果。7)结果分析分别用对照品孔和待测样品孔OD值与加药浓度的量效关系进行4参数拟合，确定对照品与待测样品的EC5tl值，曲线拟合常数R2，复孔CV%。按照下列公式计算待测样品的细胞杀伤生物活性
A+· 丨样 π U* AK UJ_ ,、对照品 EC53 值
_样品生物活性CO =隱......—
实施例I评价CD20靶位治疗药物及手段的体外检测方法
以参考品和Rituximab为材料，Rituximab作为对照品，用RPMI1640基础培养基稀释至合适浓度，在新的96孔细胞培养板中做2倍系列梯度稀释，得到11个稀释度，采用上述检测方法步骤考察参考品相对Rituximab的生物学活性。结果如图I所示，Rituximab及参考品4参数拟合情况良好，曲线拟合常数R2均满足> O. 98，不同加药稀释浓度下3复孔检测OD值的CV%均满足< 20%。通过与RituximabEC5tl值的比较，参考品的细胞杀伤生物活性为95%。实施例2专属性评价试验
以Infliximab为材料，用RPMI1640基础培养基稀释至合适浓度，在新的96孔细胞培养板中做2倍系列梯度稀释，得到11个稀释度，采用上述检测方法步骤检测其杀伤活性。结果如图2，将该方法应用于Infliximab时，尽管不同加药稀释浓度下3复孔检测OD值的CV%均满足< 20%，但无法对结果进行4参数拟合，该药物并不能对高表达CD20的人B淋巴瘤细胞Daudi产生杀伤作用。相对的，图I中参考品的检测结果则能够正常进行4参数拟合，同时满足拟合常数R2 > O. 98，3复孔的CV% < 20%。该实验结果表明，本发明所述方法具有特异性。实施例3准确性评价试验
以参考品(同实施例I)为材料，用RPMI1640基础培养基将其稀释成效价水平分别为50%、75%、100%、125%、150%的待测样品，3名实验人员(Analystl、2、3)各自独立的采用上述检测方法步骤对这5个待测样品进行细胞杀伤生物活性检测。结果如表1，对效价水平分别为50%、75%、100%、125%、150%的5个待测样品，3名不
同实验人员利用本发明方法对这些样品的检测结果均满足参考品的4参数拟合曲线的拟合常数R2 > O. 98，3复孔的CV%均满足< 20%，并且不同人员对不同效价水平的实测值相对于理论值的平均偏差均满足< 10%。这说明在检测针对CD20靶位生物治疗药物及手段的细胞杀伤生物活性时，本发明方法对活性范围在50%-150%内待测样品，能够达到准确性要求。
表I.针对CD2i)靶位单克隆抗体药物细胞杀伤生物活性检測准确性评价结果汇总表
权利要求
1.一种评价CD20靶位治疗药物及手段的体外检测方法，包括下列步骤 a取对数生长期表达CD20的细胞，用基础培养基制成细胞悬液，计数并计算细胞密度及活率，调整活细胞密度为ηX IO5个/ml，将细胞悬液等体积加入细胞培养板孔中，同时设立空白对照孔，空白对照孔加入等体积基础培养基； b取对照品及待测样品，用基础培养基进行系列梯度稀释，得到系列稀释浓度的对照品及待测样品； c将系列稀释浓度的对照品及待测样品依次加入步骤a所述细胞培养板孔中，空白对照孔则加入等体积的基础培养基，然后将细胞培养板放置于37°C、5% 二氧化碳培养箱中培养 10-20min ； d取人血清，用基础培养基进行稀释，依次加入步骤c所述细胞培养板孔和空白对照孔中，使人血清的浓度为3%-7%，然后将细胞培养板放置于37°C、5% 二氧化碳培养箱中培养45_75min ； e采用检测活细胞或死细胞量的检测体系对细胞培养板进行显色反应；f显色反应完成后，测定显色反应的结果，并根据测定结果计算待测样品的细胞杀伤生物活性。
2.如权利要求I所述的体外检测方法，其特征在于所述CD20靶位治疗药物是单克隆抗体、激酶抑制剂、反义寡核苷酸、化合物、中药提取物或中药复方提取物中之一或它们的任何组合。
3.如权利要求I所述的体外检测方法，其特征在于所述n=6-10。
4.如权利要求I所述的体外检测方法，其特征在于所述对数生长期表达CD20的细胞是人B淋巴瘤细胞Daudi。
5.如权利要求I所述的体外检测方法，其特征在于所述基础培养基是RPMI1640基础培养基。
6.如权利要求I所述的体外检测方法，其特征在于所述系列梯度稀释是2倍系列梯度稀释。
7.如权利要求I所述的体外检测方法，其特征在于所述人血清是补体保留正常人血清。
8.如权利要求I所述的体外检测方法，其特征在于在步骤e中，所述检测活细胞或死细胞量的检测体系包括四唑类化合物氧化还原检测体系、ATP总量检测体系或LDH释放量检测体系等。
9.如权利要求8所述的体外检测方法，其特征在于所述四唑类化合物为MTT、MTS或CCK-8。
10.如权利要求I所述的体外检测方法，其特征在于所述细胞培养板为96孔细胞培养板。
全文摘要
本发明属于生物医药技术领域，具体涉及一种评价CD20靶位治疗药物及手段的体外检测方法。本发明公开的体外检测方法，能够快速、准确、高效的对CD20靶位治疗药物及手段的细胞杀伤生物活性进行检测，该方法专属性好、特异性强、准确性高，活性测定范围达到50%-150%；精密度高，重复性、日间差以及人员操作误差RSD均小于10%，并且三复孔的CV%小于20%，4参数拟合的拟合常数R2均大于0.98。此外，本发明并不需要十分昂贵的仪器和繁琐的操作，便于推广以及高通量操作，完全能够满足其在进行具有针对CD20靶位、抑制肿瘤细胞生长活性的治疗药物及手段的筛选及其稳定性评价的需要。
文档编号G01N33/15GK102967692SQ201210535899
公开日2013年3月13日 申请日期2012年12月13日 优先权日2012年12月13日
发明者王安, 王少雄, 吕品, 刘培培, 陈香 申请人:嘉和生物药业有限公司