专利名称：衍生提取法测定食品中甲醛的方法
技术领域：
本发明涉及一种液相色谱法测定食品中甲醛的测定方法，尤其涉及进出口水产、蔬菜(包括香菇)、谷类制品、乳制品、啤酒等中甲醛的测定方法。

背景技术：
甲醛俗称福尔马林，是无色、具有强烈气味的刺激性气体，其35％～40％的水溶液通称福尔马林。甲醛是原浆毒物，能与蛋白质结合，吸入高浓度甲醛后，会出现呼吸道的严重刺激和水肿、眼刺痛、头痛，也可发生支气管哮喘。皮肤直接接触甲醛，可引起皮炎、色斑、坏死。经常吸入少量甲醛，能引起慢性中毒，出现粘膜充血、皮肤刺激症、过敏性皮炎、指甲角化和脆弱、甲床指端疼痛，孕妇长期吸入可能导致新生婴儿畸形，甚至死亡，男子长期吸入可导致男子精子畸形、死亡，性功能下降，严重的可导致生殖能力缺失，全身症状有头痛、乏力、胃纳差、心悸、失眠、体重减轻以及植物神经紊乱等。
2001年日本炮制香菇中“甲醛事件”日本及境外媒体大量宣传我国出口香菇含致癌甲醛，对香菇进行”进口限量“和”反倾销调查“。我国香菇全部停止出口，造成巨大经济损失。近年来鱿鱼等制品中的“甲醛超标问题”，严重影响了鱿鱼加工产业的发展和鱿鱼制品出口。浙江舟山市作为主要出口基地，受损严重。2007年菲律宾检测大白兔奶糖等4种糖果含有甲醛，菲律宾及海外市场相关产品遭遇撤架，食品安全性再次受到全球性质疑。
由于甲醛具有较高的反应活性，可以和带有-OH(羟基)、-SH(巯基)、-NH2(氨基)基团的分子发生亲核加成反应，动物体的细胞内、酶系统中存在着大量的上述基团，接触甲醛后会立即发生反应，产生细胞毒性，使蛋白质变性。甲醛超强的杀菌能力正是原自这种反应。试样中富含蛋白质时，添加的甲醛易与蛋白质中基团结合，形成甲醛-蛋白质复合物。因此，对食品中内源性甲醛产生机理进行研究，提出一种灵敏度高、操作简便的甲醛测定方法将为我国食品出口突破国际“绿色壁垒”做出贡献。
现有技术中食品中甲醛测定方法如下 1、AOAC 931.08(第17版)蒸馏法，铬变酸定性。
2、SCT 3025-2006水产品中甲醛的测定水蒸气蒸馏法，分光光度法、HPLC法测定。
3、NYT 1283-2007香菇中甲醛含量的测定水蒸气蒸馏法，比色法测定。
4、DB33T 555-2005植物源食品中甲醛残留量的测定高效液相色谱法60℃水浴提取，香菇中甲醛用乙酸锌溶液提取，HPLC法测定。
5、GBT 5009.49-2003发酵酒卫生标准的分析方法水蒸气蒸馏法，比色法测定。
6、SNT 1547-2005进出口食品中甲醛含量测定液相色谱法40℃水浴提取，HPLC法测定。
对于水蒸气蒸馏法利用甲醛易挥发，在酸性条件下，可蒸馏分离得到试样中游离态和可逆结合态的甲醛。但高温可能导致内源性甲醛的产生，而且水蒸气蒸馏法对实验装置的气密性要求高，操作复杂，不利于大批量试样的检测。
对于SN/T 1547-2005采用水浸法提取甲醛用水充分提取试样中甲醛，再将提取液与2，4-二硝基苯肼衍生反应，直接液相色谱测定。水浸法能有效提取试样中游离态的甲醛，但试样(如水产、乳制品等)富含蛋白质时，添加的甲醛易与蛋白质中基团结合，形成甲醛-蛋白质复合物，使得水浸法测定富含蛋白质试样中甲醛的回收率不佳。SN/T 1547-2005采用了甲醛的校正工作溶液，在甲醛含量低的基质中添加不同浓度水平的甲醛，按试样提取操作后液相色谱测定，使得甲醛回收率提高。但是实际操作中，空白基质的选择、甲醛校正工作曲线的制作、不同实验室间结果的比对等，都存在一定的难度。


发明内容
为了解决上述的甲醛含量的测定方法中存在的技术缺陷，本发明的目的是提供一种衍生提取法测定食品中甲醛的方法，该方法直接提取衍生样品中甲醛，将甲醛校正工作溶液改为甲醛标准工作溶液，提高了富含蛋白质试样中甲醛的回收率，测定低限改为“液体类试样中 甲醛的测定低限为2.0mg/L，固体类试样中甲醛的测定低限为5.0mg/kg”。
为了实现上述的目的，本发明的衍生提取法测定食品中甲醛的方法由以下的步骤构成 (1)提取 ①固体类试样称取试样2g，精确至0.01g，置于50mL具塞塑料离心管中，准确加入20.0mL衍生液；旋紧塞子，混匀后置于60℃恒温振荡器中，150r/min振摇，间隔20min取出混匀，振摇1h后取出冷却；上述的衍生液为2，4-二硝基苯肼乙腈溶液与pH 5的缓冲溶液构成的混合溶液，2，4-二硝基苯肼乙腈溶液的浓度为0.6g/L，衍生液中乙腈∶缓冲溶液的体积比为1∶1；； ②液体类试样移取试样1mL，精确至0.1mL，置于10mL具塞比色管中，加入4.0mLpH 5的缓冲溶液，用2，4-二硝基苯肼乙腈溶液定容至10mL，盖上塞后混匀，60℃水浴加热1h，取出冷却；上述的2，4-二硝基苯肼乙腈溶液的浓度为0.6g/L； (2)净化 ①固体类试样将上述制得的固体类试样提取液，以不低于4000r/min离心5min；对于离心后溶液澄清，过微孔滤膜后，直接供HPLC测定；对于离心后溶液浑浊，在提取液中加入8g硫酸铵，混匀，以不低于4000r/min离心5min，移取上清液，下层溶液用10mL乙腈重复萃取1次，合并萃取液，用乙腈定容至20mL，混匀后过微孔滤膜，滤液供HPLC测定； ②液体类试样提取液的净化方法与固体类试样相同，所用试剂量减半； (3)甲醛标准工作溶液的制备 分别取5档或以上不同浓度的甲醛标准工作溶液，甲醛标准工作溶液的制备方法如下移取试样1mL，精确至0.1mL，置于10mL具塞比色管中，加入4.0mLpH 5的缓冲溶液，用2，4-二硝基苯肼乙腈溶液定容至10mL，盖上塞后混匀，60℃水浴加热1h，取出冷却；冷却后过微孔滤膜，滤液供HPLC测定；上述的2，4-二硝基苯肼乙腈溶液的浓度为0.6g/L； (4)测定 根据样液中甲醛浓度的情况选定峰面积相近的标准工作溶液系列，标准工作溶液和样液中甲醛衍生物的响应值均应在仪器检测的线性范围内，标准工作溶液和样液等体积参插进样测定，用保留时间定性，外标法定量； (5)空白试验 除不加试样外，均按上述(1)～(4)操作步骤进行； (6)结果计算和表述 按以下公式计算试样中甲醛的残留量或采用色谱数据处理系统计算，计算结果需扣除空白值 式中 X——试样中甲醛的残留量，单位为mg/kg； A——样液中甲醛衍生物的峰面积； c——标准溶液中甲醛衍生物的浓度，单位为mg/L； V——样液最终定容体积，单位为mL； As——标准溶液中甲醛衍生物的峰面积； m——试样溶液所代表的试样质量，单位为g。
作为进一步改进的方案，上述的液相色谱条件为 a)色谱柱C18柱，250mm×4.6mm(内径)，5μm，或相当者； b)流动相甲醇-水(70+30，V+V)， c)流速1.0mL/min； d)检测波长365nm； e)进样量20μL。
作为进一步改进的方案，对于步骤(2)固体类试样中脂肪含量较高，用乙腈饱和的正己烷液-液分配除脂净化。
作为进一步改进的方案，上述的pH 5的缓冲溶液采用称取2.64g乙酸钠，以适量水溶解，加入1.0mL冰乙酸，用水定容至500mL制成。
作为优选，上述的试样为银鱼、香菇、面粉、奶粉、奶糖、奶油、乳饮料或啤酒。
本发明采用2，4-二硝基苯肼的乙腈-醋酸缓冲液(50+50，V+V)，直接衍生提取试样中甲醛，液液萃取净化后，液相色谱测定。60℃水浴提取试样中甲醛的同时，进行衍生化反应。2，4-二硝基苯肼与蛋白质中基团竞争反应溶液中的甲醛，能有效抑制甲醛与试样中蛋白质结合，从而比水浸法有较高的甲醛回收率。该方法直接提取衍生样品中甲醛，将甲醛校正工作溶液改为甲醛标准工作溶液，提高了富含蛋白质试样中甲醛的回收率。该方法能够有效提取香菇中甲醛，同时又能阻断香菇中酶反应，抑制内源性甲醛的释放，提高了检测值的稳定性和重现性。该方法将提取步骤和衍生化反应相结合，有效提高了检测效率。测定低限改为“液体类样品中甲醛的测定低限为2.0mg/L，固体类样品中甲醛的测定低限为5.0mg/kg”。



图1～图4为试验例3中不同体系香菇中甲醛的测定结果图；其中 图1为纯水体系，图2为乙腈/水(1/1)体系，图3为乙腈/水(2/1)体系和乙腈，图4为乙腈/水(1/1)衍生体系。
图5为浓度0.2μg/mL甲醛标准衍生溶液的色谱图。
图6～图13分别为各空白样品和添加标样后的样品色谱图；其中 图6(a)银鱼空白样品和图6(b)添加5.0mg/kg甲醛样品色谱图； 图7(a)香菇空白样品和图7(b)添加5.0mg/kg甲醛样品色谱图； 图8(a)面粉空白样品和图8(b)添加5.0mg/kg甲醛样品色谱图； 图9(a)奶粉空白样品和图9(b)添加5.0mg/kg甲醛样品色谱图； 图10(a)奶糖空白样品和图10(b)添加5.0mg/kg甲醛样品色谱图； 图11(a)奶油空白样品和图11(b)添加5.0mg/kg甲醛样品色谱图； 图12(a)乳饮料空白样品和图12(b)添加2.0mg/L甲醛样品色谱图； 图13(a)啤酒空白样品和图13(b)添加2.0mg/L甲醛样品色谱图。

具体实施例方式 实施例1 下面对本发明的具体实施方式
做一个详细的说明。
1.1 方法提要 直接提取衍生试样中的甲醛。液液萃取净化后，在365nm波长处液相色谱测定，外标法定量。
1.2 试剂和材料 除另有说明外，所用试剂均为分析纯。所用水为煮沸10min后冷却的超纯水。
1.2.1 乙腈色谱纯。
1.2.2 正己烷色谱纯。
1.2.3 硫酸铵。
1.2.4 乙酸钠。
1.2.5 冰乙酸 1.2.6 缓冲溶液(pH 5)称取2.64g乙酸钠，以适量水溶解，加入1.0mL冰乙酸，用水定容至500mL制成。
1.2.7 2，4-二硝基苯肼纯度≥99％。
1.2.8 2，4-二硝基苯肼溶液称取2，4-二硝基苯肼300mg，用乙腈溶解定容至500mL。
1.2.9 衍生液取100mL缓冲溶液(1.2.6)和100mL 2，4-二硝基苯肼溶液(1.2.8)，混匀。
1.2.10 甲醛标准溶液(100μg/mL)GSB07-1179。
1.2.11 甲醛标准工作溶液移取适量甲醛标准溶液(1.2.7)，用缓冲溶液(1.2.3)稀释至适当浓度。
1.2.12 微孔滤膜0.45μm，有机相。
1.3 仪器和设备 1.3.1 高效液相色谱仪配有二极管阵列检测器或紫外检测器。
1.3.2 捣碎机。
1.3.3 恒温振荡器。
1.4 测定步骤 1.4.1 提取 1.4.1.1 固体类试样 称取试样2g(精确至0.01g)，置于50mL具塞塑料离心管中，准确加入20.0mL衍生液(1.2.9)。旋紧塞子，混匀后置于60℃恒温振荡器中，150r/min振摇，间隔20min取出混匀，振摇1h后取出冷却。
1.4.1.2 液体类试样 移取试样1mL(精确至0.1mL)，置于10mL具塞比色管中，加入4.0mL缓冲溶液(1.2.6)，用2，4-二硝基苯肼溶液(1.2.8)定容至10mL，盖上塞后混匀，60℃水浴加热1h，取出冷却。
1.4.2 净化 1.4.2.1 固体类试样 将1.4.1.1提取液，以不低于4000r/min离心5min。如离心后溶液澄清，过微孔滤膜(1.2.12)后，直接供HPLC测定。如离心后溶液浑浊，在提取液中加入8g硫酸铵(1.2.3)，混匀，以不低于4000r/min离心5min，移取上清液，下层溶液用10mL乙腈重复萃取1次，合并萃取液，用乙腈定容至20mL，混匀后过微孔滤膜(1.2.12)，滤液供HPLC测定。
注若试样中脂肪含量较高，可以用10mL乙腈饱和的正己烷液-液分配除脂净化。
1.4.2.2 液体类试样 1.4.1.2 提取液的净化参见1.4.2.1，所用试剂量减半。
1.4.3 甲醛标准工作溶液的制备 分别取5档或以上不同浓度的甲醛标准工作溶液(1.2.11)，按1.4.1.2操作，冷却后过微孔滤膜(1.2.12)，滤液供HPLC测定。
1.4.4 测定 1.4.4.1 液相色谱条件 液相色谱条件为 a)色谱柱C18柱，250mm×4.6mm(内径)，5μm，或相当者； b)流动相甲醇-水(70+30，V+V)； c)流速1.0mL/min； d)检测波长365nm； e)进样量20μL。
1.4.4.2 色谱测定 根据样液中甲醛浓度的情况选定峰面积相近的标准工作溶液系列。标准工作溶液和样液中甲醛衍生物的响应值均应在仪器检测的线性范围内。标准工作溶液和样液等体积参插进样测定。用保留时间定性，外标法定量。在上述色谱条件下甲醛衍生物的保留时间约为6.5min。
1.4.5 空白试验 除不加试样外，均按上述操作步骤进行。
1.5 结果计算和表述 按式(1)计算试样中甲醛的残留量或采用色谱数据处理系统计算。计算结果需扣除空白值。
式中 X——试样中甲醛的残留量，单位为毫克每千克(mg/kg)； A——样液中甲醛衍生物的峰面积； c——标准溶液中甲醛衍生物的浓度，单位为毫克每升(mg/L)； V——样液最终定容体积，单位为毫升(mL)； As——标准溶液中甲醛衍生物的峰面积； m——试样溶液所代表的试样质量，单位为克(g)。； 试验例1 动物源食品中甲醛的测定 甲醛具有较高的反应活性，可以和带有-OH(羟基)、-SH(巯基)、-NH2(氨基)基团的分子发生亲核加成反应，动物体的细胞内、酶系统中存在着大量的上述基团，接触甲醛后会立即发生反应，产生细胞毒性，使蛋白质变性。甲醛超强的杀菌能力正是原自这种反应。试样中富含蛋白质时，添加的甲醛易与蛋白质中基团结合，形成甲醛-蛋白质复合物。
本方法采用实施例1所述的技术方案测定甲醛用2，4-二硝基苯肼的乙腈/pH5醋酸缓冲液(1/1，v/v)溶液，直接衍生提取试样中甲醛，液相色谱测定。60℃水浴提取试样中甲醛的同时，进行衍生化反应。2，4-二硝基苯肼与蛋白质中基团竞争反应溶液中的甲醛，能有效抑制甲醛与试样中蛋白质结合，从而比水浸法有较高的甲醛回收率。
选择银鱼、奶粉空白基质，添加5mg/kg、10mg/kg、20mg/kg三档浓度水平的甲醛，分别用水浸法和衍生提取法操作处理，甲醛标准溶液作为校正曲线，平行测定3次取平均值，结果对比见表1。衍生提取法和水浸法的空白测定值相近，表明衍生提取法未导致含蛋白试样中内源性甲醛的明显产生；水浸法银鱼中甲醛回收率为35～46％，衍生提取法银鱼中甲醛回收率70～74％；水浸法奶粉中甲醛回收率为66～74％，衍生提取法奶粉中甲醛回收率82～88％，表明衍生提取法能较好的提取试样中甲醛。
表1 水浸法和衍生提取法测定含蛋白试样中甲醛对比

试验例2 植物源食品(除香菇外)中甲醛的测定 采用实施例1所述的技术方案测定甲醛，选择面粉、脱水甘蓝空白基质，添加5mg/kg、10mg/kg、20mg/kg三档浓度水平的甲醛，分别用水浸法和衍生提取法操作处理，甲醛标准溶液作为校正曲线，平行测定3次取平均值，结果对比见表2。衍生提取法和水浸法的空白测定值相近，表明衍生提取法未导致植物源性试样中内源性甲醛的明显产生；水浸法的甲醛回收率为75～88％，衍生提取法的甲醛回收率90～99％，表明衍生提取法能较好的提取试样中甲醛。
表2 水浸法和衍生提取法测定植物源性试样中甲醛对比
试验例3 香菇中甲醛的测定 香菇中甲醛被证明是香菇子实体自身代谢产生的。日本学者Yasumotoc及Fujimoto等人分离出参与香菇甲醛代谢的关键酶及其前体物质一香菇精，认为甲醛是香菇特征风味物质酶学代谢的副产物。因此，香菇的运输、保存等过程中，均可能分解释放甲醛。
香菇中甲醛的提取方法，采用较多的有鲜香菇匀浆或粉碎后再通过蒸馏提取甲醛，蒸馏过程中香菇中活性酶可能不断释放甲醛而影响测定结果。日本官方的检测方法注解提及香菇类食品，由于加酸水解或酶解可使试样中的成分生成甲醛，这种情况有时采用冷水提取，立即作为试验溶液进行测定。国内学者改进的方法有，60℃水浴萃取香菇中甲醛同时用乙酸锌溶液灭酶活性，以及鲜香菇匀浆后沸水浴热灭酶后再蒸馏提取等，通过灭酶活性以阻断香菇中甲醛的不断释放。
香菇甲醛的测定方法，存在分歧较多，测定结果重现差等问题。如何提取使甲醛提取效率最高，同时能有效阻断香菇中酶反应，我们以甲醛含量较高的香菇干为研究对象，进行了系列研究。将香菇干样品粉碎均匀后，用塑料袋密封储存，以备试验用。采用实施例1所述的技术方案测定甲醛 1、提取溶剂的选择 称取1.0g样品，分别用20mLpH2水、pH5水、pH7水、乙腈/pH2水(1/1)、乙腈/pH5水(1/1)、乙腈/pH7水(1/1)、乙腈/pH2水(1/2)、乙腈/pH5水(1/2)、乙腈/pH7水(1/2)和乙腈作为提取剂，室温条件下，均质匀浆30s后4000rpm/min离心5min，取2mL滤液，采用“1甲醛与2，4-二硝基苯肼反应条件”衍生，其中pH7滤液调至pH5衍生。将上述10种匀浆液涡旋混匀后，放置60℃水浴振摇提取，分别在0.5h，1h，2h，3h取2mL滤液衍生，衍生液用液相色谱测定。
测定结果见图1～3，香菇均质提取后立即衍生测定即t＝0时，酶促反应释放甲醛对测定影响较小，此时基本可以考察不同提取试剂对甲醛的萃取效果；比较不同提取试剂t＝0.5～3h时与t＝0时测定结果，可以考察提取过程中酶反应活性对甲醛测定的影响。
如图1所示，香菇均质匀浆后立即衍生测定即t＝0时，pH2、pH5、pH7水提取液甲醛含量分别为34.0、26.5、94.9mg/kg，初步说明香菇水溶液中酶活性pH5＜pH2＜pH7。随提取时间增加，pH7提取液甲醛含量最高，pH2提取液次之，pH5提取液最低，进一步证明了上述观点。pH5提取液酶反应活性较低，甲醛含量随提取时间增加而缓慢增加，提取3h达到最高值198mg/kg。pH2、pH7提取液酶反应活性较高，振摇0.5h甲醛含量分别达到最高值390、806mg/kg，提取时间增加至1h～3h，甲醛含量反而越来越低。推测香菇样品经均质后，细胞充分破碎，较高的酶反应活性使得振摇0.5h甲醛已充分释放；随着萃取时间增加，甲醛可能参与香菇基体代谢反应，使得甲醛含量降低。
如图2所示，t＝0时，乙腈/pH2(1/1)、乙腈/pH5(1/1)、乙腈/pH7水(1/1)甲醛含量分别为27.3、22.6、28.0mg/kg，与pH5水均质提取甲醛结果相近。说明如果忽略酶促反应的影响，乙腈/水(1/1)体系对香菇中甲醛的萃取效果跟纯水体系基本相当。随提取时间增加，甲醛含量没有明显增加，说明乙腈/水(1/1)体系能较好的抑制香菇中酶活性。图中3条曲线形状相似，而且非常相近，说明相对于水溶液pH值，乙腈对香菇酶活性的抑制起主要作用。
如图3所示，t＝0时，乙腈/pH2水(1/2)、乙腈/pH5水(1/2)、乙腈/pH7水(1/2)和乙腈中甲醛含量分别为8.52、8.00、10.4、2.84mg/kg。表明相比较乙腈/水(1/1)体系，乙腈/水(2/1)体系对香菇中甲醛的萃取效果较差，纯乙腈萃取效果最差。随提取时间增加，甲醛含量稍有增加，但低于图2乙腈/水(1/1)体系相对应值。推测提取溶剂中乙腈比例的增加，能有效抑制香菇中酶活性，但不利于甲醛的释放和提取。
综合考虑，乙腈/水(1/1)体系具有与纯水体系相当的对香菇中甲醛萃取效果，同时相比较纯水体系，能有效抑制香菇中酶反应活性，因此选择乙腈/水(1/1)体系作为香菇中甲醛提取试剂。乙腈/水(1/1)体系提取过程中，甲醛含量有上下波动，稳定性和重现性不佳，下面进一步考察乙腈/水(1/1)体系作为溶剂的2，4-二硝基苯肼衍生液的提取效果。
2、衍生提取法 考察不同pH值的乙腈/水(1/1)衍生剂溶液，对香菇中甲醛提取的影响。称取1.0g样品，分别加入20mL 2，4-二硝基苯肼的乙腈/pH2水(1/1)、乙腈/pH5水(1/1)、乙腈/pH7水(1/1)溶液，2，4-二硝基苯肼浓度为0.3g/L。均质匀浆30s后，60℃水浴振摇衍生提取，分别在0.5h，1h，2h，3h，4h取1mL滤液进行液相色谱测定。忽略pH值对衍生反应的影响，以甲醛的乙腈/pH5水(1/1)衍生液，60℃水浴振摇1h衍生后测定值作校准曲线，不同提取液的甲醛测定结果见图4。
由图4可知，乙腈/pH5水(1/1)衍生剂提取甲醛的最大值为40mg/kg，比图2中相对应溶剂提取最大值27mg/kg稍有增加，表明衍生剂的加入，能促使甲醛衍生反应平衡向右进行，以达到最大程度提取测定香菇中甲醛。乙腈/pH7水(1/1)衍生剂提取曲线跟乙腈/pH5水(1/1)衍生剂相似，但测定结果较低，分析原因可能是pH7条件下衍生反应灵敏度较低。乙腈/pH2水(1/1)衍生剂提取甲醛最大值为77mg/kg，比图2中相对应溶剂提取最大值39 mg/kg，增加1倍。表明pH2条件下，衍生剂的加入诱导了香菇中内源性甲醛的释放。
综上所述，乙腈/pH5水(1/1)衍生剂，具有和甲醛较高的衍生反应灵敏度，能够最大程度对香菇中甲醛进行衍生提取，而且未见明显导致香菇中内源性甲醛的释放，提取结果1h～4h都比较稳定。均质匀浆30s后水浴衍生1h与未匀浆直接衍生1h进行对比，实验结果相近。
因此，衍生提取法能够有效提取香菇中甲醛，同时又能阻断香菇中酶反应，将提取步骤和衍生化反应相结合，有效提高了检测效率，选择其为提取方法。
试验例4 净化条件的选择 乙腈/水(1/1)对水溶性样品和脂溶性样品都有较好的浸润性，选择试样量的10倍的提取溶剂量来进行甲醛的提取。植物源食品中，通常含有纤维、淀粉等化合物，样品用衍生剂提取稀释后，如离心溶液澄清，则不必净化处理，直接液相色谱测定，杂质干扰较少。但QQ糖果等富含明胶、矿物质和糖类等，衍生液不易过滤膜，需要净化处理。乳制品、动物源食品中，含有丰富的蛋白质、脂肪，衍生液需要沉淀蛋白和除脂净化。
蛋白质的沉淀剂有乙酸铅、三氯乙酸、盐类、乙腈等，乙酸铅和三氯乙酸的本底值较高，盐析法能够较好的沉淀蛋白质和水溶性杂质，乙腈/水比例为2～3时能较好的沉淀蛋白。为了简化操作步骤，选择乙腈饱和的正己烷脱脂、盐析沉淀蛋白和除水溶性杂质。在20mL衍生液中，加入10mL乙腈饱和的正己烷，涡旋后静置分层，除去上层溶液，即可除去大部分脂肪。在20mL衍生液中，加入约8g硫酸铵，盐析作用使得大部分蛋白质沉淀，水溶性杂质析出，同时使乙腈和水分层，甲醛衍生物进入乙腈层。离心后，提取乙腈层，再用10mL乙腈萃取水溶液中残留甲醛衍生物。合并乙腈溶液，定容至20mL，达到净化目的。纯乙腈进样，衍生物的色谱峰略变宽，但不影响甲醛的定量。用10mL浓度为1.0μg/mL的甲醛标准衍生物的乙腈/水(1/1)溶液，分别进行上述除脂、沉淀蛋白处理后测定浓度分别为0.96μg/mL和0.99μg/mL。
实施例1 的方法的三项指标测定 1、线性关系和检测限 在本方法确定的实验条件下，甲醛在0.20～5.00mg/L范围内与响应值有很好的线性关系，线性方程为y＝344.6x+7.222，相关系数为0.99999。本方法对液体类样品中甲醛的测定低限为2.0mg/L；对固体类样品中甲醛的测定低限为5.0mg/kg。
2、回收率和精密度 本方法的回收率试验是添加回收率的试验。选择银鱼、香菇、面粉、奶粉、奶糖、奶油空白样品，分别添加甲醛浓度为5.0mg/kg、10.0mg/kg、20.0mg/kg，平行测定6次。选择乳饮料、啤酒空白样品，分别添加甲醛浓度为2.0mg/L、5.0mg/L、10.0mg/L，平行测定6次。选择的空白样品中含有微量甲醛，回收测定值需减去空白样品本底值。回收率和精密度见表4～表11。
表4 银鱼中甲醛的添加回收率试验
表5 香菇中甲醛的添加回收率试验
表6 面粉中甲醛的添加回收率试验
表7 奶粉中甲醛的添加回收率试验
表8 奶糖中甲醛的添加回收率试验
表9 奶油中甲醛的添加回收率试验
表10 乳饮料中甲醛的添加回收率试验
表11 啤酒中甲醛的添加回收率试验
3.方法检出限 本方法对液体类样品中甲醛的测定低限为2.0mg/L，对固体类样品中甲醛的测定低限为5.0mg/kg。
在银鱼、香菇、面粉、奶粉、奶糖、奶油空白样品中分别添加5.0mg/kg甲醛标准品，在乳饮料、啤酒空白样品中添加2.0mg/L甲醛标准品，按实验方法操作，液相色谱测定。图5为浓度0.2μg/mL甲醛标准衍生溶液的色谱图，图6～图13分别为各空白样品和添加标样后的样品色谱图。
4.方法验证 选用银鱼、香菇、面粉、奶粉、奶糖、奶油、乳饮料、啤酒空白样品，分别请上海出入境检验检疫局、湖北出入境检验检疫局、宁波出入境检验检疫、海南出入境检验检疫和浙江工商大学食品与生物工程学院五家权威检测机构进行验证。验证方法采用标准加入法，添加浓度和检测结果汇总见表12。
表12 验证试验测定汇总


权利要求
1.衍生提取法测定食品中甲醛的方法，其特征在于该测定方法由以下的步骤构成
(1)提取
①固体类试样称取试样2g，精确至0.01g，置于50mL具塞塑料离心管中，准确加入20.0 mL衍生液；旋紧塞子，混匀后置于60℃恒温振荡器中，150r/min振摇，间隔20min取出混匀，振摇1h后取出冷却；上述的衍生液为2，4-二硝基苯肼乙腈溶液与pH5的缓冲溶液构成的混合溶液，2，4-二硝基苯肼乙腈溶液的浓度为0.6 g/L，衍生液中乙腈∶缓冲溶液的体积比为1∶1；
②液体类试样移取试样1mL，精确至0.1mL，置于10mL具塞比色管中，加入4.0mLpH5的缓冲溶液，用2，4-二硝基苯肼乙腈溶液定容至10mL，盖上塞后混匀，60℃水浴加热1h，取出冷却；上述的2，4-二硝基苯肼乙腈溶液的浓度为0.6g/L；
(2)净化
①固体类试样将上述制得的固体类试样提取液，以不低于4000r/min离心5min；对于离心后溶液澄清，过微孔滤膜后，直接供HPLC测定；对于离心后溶液浑浊，在提取液中加入8g硫酸铵，混匀，以不低于4000r/min离心5min，移取上清液，下层溶液用10mL乙腈重复萃取1次，合并萃取液，用乙腈定容至20mL，混匀后过微孔滤膜，滤液供HPLC测定；
②液体类试样提取液的净化方法与固体类试样相同，所用试剂量减半；
(3)甲醛标准工作溶液的制备
分别取5档或以上不同浓度的甲醛标准工作溶液，甲醛标准工作溶液的制备方法如下
移取试样1mL，精确至0.1mL，置于10mL具塞比色管中，加入4.0mLpH5的缓冲溶液，用2，4-二硝基苯肼乙腈溶液定容至10mL，盖上塞后混匀，60℃水浴加热1h，取出冷却；冷却后过微孔滤膜，滤液供HPLC测定；上述的2，4-二硝基苯肼乙腈溶液的浓度为0.6g/L；
(4)测定
根据样液中甲醛浓度的情况选定峰面积相近的标准工作溶液系列，标准工作溶液和样液中甲醛衍生物的响应值均应在仪器检测的线性范围内，标准工作溶液和样液等体积参插进样测定，用保留时间定性，外标法定量；
(5)空白试验
除不加试样外，均按上述(1)～(4)操作步骤进行；
(6)结果计算和表述
按以下公式计算试样中甲醛的残留量或采用色谱数据处理系统计算，计算结果需扣除空白值
式中
X——试样中甲醛的残留量，单位为mg/kg；
A——样液中甲醛衍生物的峰面积；
c——标准溶液中甲醛衍生物的浓度，单位为mg/L；
V——样液最终定容体积，单位为mL；
As——标准溶液中甲醛衍生物的峰面积；
m——试样溶液所代表的试样质量，单位为g。
2.根据权利要求1所述的衍生提取法测定食品中甲醛的方法，其特征在于液相色谱条件为
a)色谱柱C18柱，250mm×4.6mm(内径)，5μm，或相当者；
b)流动相甲醇-水(70+30，V+V)；
c)流速1.0mL/min；
d)检测波长365nm；
e)进样量20μL。
3.根据权利要求1所述的衍生提取法测定食品中甲醛的方法，其特征在于对于步骤(2)固体类试样中脂肪含量较高，用乙腈饱和的正己烷液-液分配除脂净化。
4.根据权利要求1所述的衍生提取法测定食品中甲醛的方法，其特征在于pH5的缓冲溶液采用称取2.64g乙酸钠，以适量水溶解，加入1.0mL冰乙酸，用水定容至500mL。
5.根据权利要求1～4任意一项权利要求所述的衍生提取法测定食品中甲醛的方法，其特征在于试样为银鱼、香菇、面粉、奶粉、奶糖、奶油、乳饮料或啤酒。
全文摘要
本发明涉及一种液相色谱法测定食品中甲醛含量的测定方法，尤其涉及进出口水产、蔬菜(包括香菇)、谷类制品、乳制品、啤酒等中甲醛的测定方法。液相色谱法测定食品中甲醛含量的测定方法，该测定方法由(1)提取、(2)净化、(3)甲醛标准工作溶液的制备、(4)测定、(5)空白试验、(6)结果计算和表述步骤构成。本发明采用2，4-二硝基苯肼的乙腈/pH5醋酸缓冲液(1/1，v/v)溶液，直接衍生提取试样中甲醛，液相色谱测定。60℃水浴提取试样中甲醛的同时，进行衍生化反应。2，4-二硝基苯肼与蛋白质中基团竞争反应溶液中的甲醛，能有效抑制甲醛与试样中蛋白质结合，从而比水浸法有较高的甲醛回收率。
文档编号G01N30/02GK101762660SQ20101003960
公开日2010年6月30日 申请日期2010年1月8日 优先权日2010年1月8日
发明者吕春华, 陈笑梅, 刘海山, 史颖珠, 谢文, 黄超群, 朱晓雨 申请人:浙江出入境检验检疫局检验检疫技术中心