专利名称：人类真核翻译延伸因子eEF1α1基因工程菌的制作方法
技术领域：
本发明属于分子生物学、基因工程技术领域，具体涉及一种含有人类真核翻译延 伸因子(eEFla 1 )的克隆载体构建，表达人类真核翻译延伸因子(eEFl a 1)蛋白的重组质 粒构建、基因工程表达菌株，蛋白质表达形式分析与两种纯化方法比较。
背景技术：
人类真核翻译延伸因子lA(eEFl a )是一个主要的翻译因子，eEFl a GTP催化 氨酰tRNA结合到核糖体的A位点。eEFl a不仅仅是翻译必须的蛋白，而且是一个重要的 多功能蛋白。eEFl a参与许多重要的细胞过程和疾病，包括信号传导、翻译控制、凋亡、细 胞骨架组成、病毒复制及癌基因转化等。该基因在人类许多肿瘤如结肠癌，膀胱癌，子宫颈 癌，乳腺癌中含量很高，而在其对应的正常组织中表达量很少。体外表达eEFla 1蛋白，对 于研究其与凋亡相关的蛋白P53和骨架蛋白的关系有重大意义，作为长寿药物的开发也有 广泛的前景。

发明内容
本发明的目的在于通过构建人类真核翻译延伸因子(eEFla 1 )蛋白的重组质粒， 并采用基因工程表达菌表达出可溶性的eEFl a 1融合蛋白，使其具有表达量高、成本低的 特点，并且使表达获得的重组人eEFl a 1融合蛋白有酶学活性和免疫学活性，纯化步骤简 便，易于操作，得率高，为人类真核翻译延伸因子在体外的功能研究提供很好的基础。本发明首先从人胎肝总RNA中反转录扩增出人类真核翻译延伸因子eEFl a 1。本发明还构建分泌性表达eEFl a 1基因的重组质粒pet22b (+) -A,并利用转化基 因工程表达菌株，成功获得分泌性表达eEFl a 1蛋白的基因工程菌。具体而言，该基因工程 菌的构建方法包括设计RT-PCR上游和下游引物，从人胎肝总RNA中反转录扩增a 1基 因编码序列，克隆到T载体以及成功构建eEFl a 1重组分泌表达质粒pet22b_A，并通过表 达载体转化到大肠杆菌获得高效分泌重组人eEFl a 1的基因工程菌。本发明还成功表达出高纯度、高产量的6His tagged eEFl a 1蛋白及其鉴定。本发明还提供一种新颖的eEFl a 1分泌表达与包涵体表达两种表达形式的分析 与判断方法。即分别在37°C，30°C和25°C条件下，SDS-PAGE分析诱导表达菌的包涵体与胞 浆蛋白组分，进而确定最优分泌性表达条件和最优包涵体表达条件。本发明还提供His-Trap亲和层析柱纯化高纯度eEFl a 1蛋白的方法。即含20mM 咪唑Binding buffer与含500mM咪唑Elution buffer线性洗脱的方法。本发明还提供该基因工程菌表达并纯化出的蛋白的Mass spectrum结果，结果表 明其为人类翻译延伸因子eEFl a 1。因此上述工作，本发明提供了一种含有站7全长编码基因的重组pUcm-T载 体克隆质粒，以及包含此重组质粒的克隆菌株XLl-Blue。本发明还提供了一种含有eEFl a 1全长编码基因的重组表达质粒pet22b(+)_A，以及包含此重组质粒的表达菌株BL21(DE3)。重组质粒pet22b(+)-A的基因序列见SEQ ID NO. 2。本发明还提供了一种基因工程菌表达出的eEFl a 1蛋白，其N末端有6XHis蛋 白，与eEFl a 1 (462个氨基酸残基)形成融合蛋白，利用His-Trap亲和纯化，eEFl a 1蛋 白分子量为49. 8kD，等电点为9. 1 ；其融合蛋白分子量为50. 5kDa，其氨基酸序列为SEQ ID NO. 3。本发明还提供了一种用于分析和判断eEFl a 1蛋白表达形式的方法，其关键在 于，根据不同温度下IPTG诱导的重组表达菌株包涵体与胞浆成分分析，图片如图3所示。本发明还提供了一种得到高纯度6His Tagged-eEFl a 1蛋白的His-Trap亲和层 析纯化方法，蛋白纯化前后结果SDS-PAGE电泳分析如图4，纯化后蛋白Western Blot鉴定 图片如图5。本发明还提供了一种用于该融合蛋白的质谱分析，其结果表明该蛋白为人类翻译 延伸因子eEFl a 1蛋白。本发明提供的基因工程菌分泌表达出的eEFl a 1蛋白，可应用于外源标记的蛋白 功能研究，也可作为抗原免疫动物研究与该蛋白相关的免疫研究，也可以作为蛋白标准品
等应用。


图1为pet22b-eEFlAl重组质粒示意图。图2为eEFlAl基因PCR扩增产物、菌液PCR和双酶切鉴定电泳图。图3为不同温度下重组表达菌株包涵体与胞浆成分SDS-PAGE分析图。图4为重组蛋白纯化前后SDS-PAGE电泳分析图。图5为纯化后蛋白SDS-PAGE分析与Western Blot鉴定图。图6为Bradford法蛋白测定BSA标准曲线。图7为重组蛋白质谱可能Mowse分数图。图8为重组蛋白质谱中最大Mowse分数蛋白解读图。
具体实施例方式下面结合具体实施实例进一步阐释本发明。应理解，这些实例仅以用于说明本发 明而不用于限制本发明的范围。下列实例中未注明具体的实验方法，均可按照常规方法 进行。如 Sambrook 等分子克隆实验手册(New York: Cold Spring Harbor Labortary Press, 1989)中所述条件，或按照制造生产厂商的使用说明。实施例1
人类真核翻译延伸因子lA(eEFl a 1)基因的克隆。1人胎肝总RNA从上海申能博采生物有限公司购买，保存在-20°C。反转录试剂盒 从TaKaRa公司购买，保存于_20°C。2基因克隆从人胎肝总RNA中反转录(RT-PCR)扩增人胎肝cDNA，以逆转录的 cDNA第一链为模板，利用正向引物和反向引物进行PCR，获得eEFl a 1编码基因全长，并成 功克隆pUCm-T-A重组质粒(克隆菌株为XLl-Blue)。
4
实施例2
含目的基因eEFl a 1表达载体的构建。1根据人类真核翻译延伸因子eEFl a 1基因全长编码序列，设计扩增出完整编码 阅读框的引物，并在正反向引物A1，A2上分别引入限制性内切酶识别位点(引物序列见SEQ ID NO. 1)，以便构建表达载体。以实施例1中获得的pUCm-T-A质粒为模板，在5’端和3’端 分别加入Afcol和及酶切位点，构成重组质粒图如图1。经和Afcol私BamHl双酶切的PCR 产物与经过同样双酶切的pet22b (+)原核表达载体连接，YC法转化，重组质粒pet22b (+) -A 的PCR与酶切双重鉴定后的阳性克隆，送上海生工测序，确保开放读框正确。PCR扩增产物 电泳图片、菌液PCR和双酶切鉴定结果见图2. A, B, C，重组质粒pet22b (+) -A的基因序列见 SEQ ID NO. 2。实施例3
eEFl a 1基因工程菌的获得。用YC法将实施例2中重组表达质粒pet22b(+)_A转化到原核表达菌株五coil BL21(DE3)中，经转化子鉴定后获得基因工程菌。YC法感受态细胞制备(实验室建立此方法)
1、LBmedium 至 0D 为 0. 4 ；
2、4°C , 6000rpm, 5min，弃上清收菌；
3、重悬于原培养体积1/10的TSB中；
4、冰置10分钟，分装为每管50ul，-80°C冻存待用。YC法转化(实验室建立此方法)
1、pet22b(+)-A质粒liil、5xKCM溶液10yl、双蒸水39 yl，混勻，置冰上；
2、从-80°C冰箱中取1只感受态细胞冰置，溶化后立即加入上述混合液，轻轻吹打混
勻；
3、冰置20分钟，室温放置10分钟；
4、加入500ul LB, 200rpm,37°C,45-60min ；
5、6000rpm，5分钟收菌，留150ul上清，吹打均勻；
6、涂板，37°C过夜。TSB 和 5 X KCM 配方见 Table. 1
转化子鉴定采用菌液PCR和双酶切鉴定。实施例4
IPTG诱导eEFl a 1表达形式的分析。1、取转化子鉴定阳性的单克隆表达菌株8株最为诱导表达实验组，对照组为 pet22b (+)空载体表达菌株。2、分别接种到5ml LB/Amp液体培养基中37°C 200rpm摇床培养至0D600=0. 6时 (约6 8h)，加入0. 4mM IPTG诱导蛋白表达4h。3、SDS-PAGE电泳分析基因工程菌表达情况，依据目的条带位置大小处蛋白的量 定性判断筛选高表达菌株(eEFl a 1分子量在49. 8kD，N端加上6XHis融合标签后，约为 50kD)。4、高表达菌株 pet22b(+)_A 2# 在不同温度(37°C，30°C，25°C )下经 IPTG 诱导 4h后，离心获得菌体经超声破菌后，目的蛋白存在形式(包涵体和胞浆)进行SDS-PAGE电泳分 析。电泳图片见图3.A，B，C，D，其中1指胞浆组分，2指包涵体组分。5、由4结果分析目的蛋白在30°C下诱导4h后，蛋白分泌表达在胞浆内。实施例5
eEFl a 1蛋白用His-Trap亲和层析柱纯化方式。1、30°C大量培养pet22b(+)_A 2#表达菌株(500ml)，经IPTG诱导后，离心获得的 菌体经超声破菌，获得胞浆部分。2、用His-Trap层析纯化柱的线性洗脱方式洗脱目的蛋白。其步骤为 Binding buffer (pH9. 5)禾口 Elution buffer (pH9. 5)参照 GE Healthcare
Instructions 11-0008-88 AC。过柱前用ddH20冲洗机器lOmin ；
装上His-Trap柱子，检查密闭性，并用Binding buffer冲洗柱子lOmin，此时A、B泵 同时用Binding buffer冲洗lOmin，流速为5ml/min，梯度设为50%,时间改为0 ； 蛋白上样前梯度改为0，蛋白由A泵进样，流速改为2ml/min ；
A泵上样之后，B泵放入Elution buffer中，梯度设为50%，时间改为30min，大约在48% 时(即咪唑浓度约为250mM时)，开始出现蛋白峰，收集洗脱流出液； 蛋白保存于-20°C。实施例6 eEFl a 1蛋白活性。eEFl a 1活性测定利用Western Blot实验技术，检测其抗原-抗体结合反应的特性。eEFl a 1蛋白SDS-PAGE电泳，一份PAGE胶进行考马斯亮蓝染色，一份转膜到醋酸 纤维素膜上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类型及其生 物学活性不变。利用抗原-抗体竞争性结合原理，以固相载体上的蛋白质作为抗原，与对应 的抗体起免疫反应，再与酶或同位素标记的第二抗体起反应，经过底物显色或放射自显影 以检测eEFl a 1蛋白。其中，一抗采用eEFl a 1蛋白C末端300aa的人抗兔多抗，二抗用 羊抗兔IgG多抗-HRP。实施例7
蛋白浓度测定及得率计算。1、Brodford法测定蛋白浓度
(1)首先用不同浓度的BSA蛋白作为标准曲线，Bradford法测定(0D595)值，测得数据 见Table. 2，BSA标准曲线见图6。(2)原液、稀释5倍和稀释10倍的eEFl a 1蛋白分别取100 yl，加入lml Bradford工作液，2min后测0D595值，测得数据见Table. 3。(3)把eEFl a 1 0D595值代入标准曲线方程y=0. 763x_0. 0059，计算得蛋白浓度 为:620mg/L
2、蛋白得率计算
500ml菌液，超声波菌后，胞浆部分过柱纯化蛋白，纯化后获得蛋白量10ml，浓度为 620mg/Lo
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得率(蛋白浓度X蛋白量)/培养菌液量=12. 4mg/L 实施例8
eEFl α 1蛋白质谱分析。1、蛋白送复旦大学生物医学研究院蛋白质谱分析实验室进行质谱分析检测，分析 结果表明图中最高峰292分处(分数>82为有统计学意义)表示该蛋白最大可能为人类翻 译延伸因子 eEFlAl[Homo sapiens] (gi4503471)，质谱结果见图 7，8。
表1 YC法转化所需试剂配方
权利要求
一种含有eEF1α1 全长编码基因的重组pUcm T载体克隆质粒，以及包含此重组质粒的克隆菌株XL1 Blue。
2.一种含有站F7〃7全长编码基因的重组表达质粒pet22b(+)-A，以及包含此重组 质粒的表达菌株BL21 (DE3)，重组质粒pet22b(+)-A的基因序列为SEQ ID NO. 2。
3.一种基因工程菌表达出的eEFla 1蛋白，其特征在于，N末端有6XHis蛋白，与 eEFla 1形成融合蛋白，利用His-Trap亲和纯化，eEFla 1蛋白分子量为49. 8kD，等电点为 9. 1 ；其融合蛋白分子量为50. 5kDa，其氨基酸序列为SEQ ID NO. 3。
4.一种用于分析和判断eEFla 1蛋白表达形式的方法，其特征在于，分别在37°C， 30°C和25°C条件下，SDS-PAGE分析诱导表达菌的包涵体与胞浆蛋白组分，进而确定最优分 泌性表达条件和最优包涵体表达条件。
5.一种如权利要求3所述的基因工程菌分泌表达出的eEFla 1蛋白，作为外源标记蛋 白的应用，或作为抗原免疫动物研究与该蛋白相关的免疫研究的应用，或作为蛋白标准品 的应用。
全文摘要
本发明属于分子生物学、基因工程技术领域，具体为一种人类真核翻译延伸因子eEF1α1基因工程菌。包括该延伸因子的克隆载体构建，延伸因子蛋白的重组质粒构建，基因工程表达菌株及其表达形式分析与纯化方法等。其中基因工程表达菌株为大肠杆菌DH5α、BL21或Rosetta-gami中的任意一种，重组质粒为含eEF1α1基因的质粒pET22b(+)。本发明提供的基因工程菌可用于生产可溶的eEF1α1蛋白，具有表达量高、成本低，表达获得的重组人eEF1α1融合蛋白有酶学活性和免疫学活性，纯化步骤简便，易于操作，得率高等特点；该重组蛋白可用于外源标记的蛋白功能研究，或用于抗原免疫动物研究与该蛋白相关的免疫研究，或作为蛋白标准品的应用。
文档编号G01N27/447GK101974552SQ201010504169
公开日2011年2月16日 申请日期2010年10月12日 优先权日2010年10月12日
发明者朱乃硕, 郭艳荣, 魏勋斌 申请人:复旦大学