专利名称：一种β-内酰胺抗生素中三乙胺残留量的检测方法
技术领域：
本发明涉及ー种0 -内酰胺抗生素中三こ胺残留量的检测方法。
背景技术：
三こ胺是P -内酰胺抗生素合成中广泛使用的试剂，对呼吸道有強烈的刺激性，吸入后可引起肺水肿甚至死亡。相关毒理学资料急性毒性LD50460mg/kg(大鼠经ロ )，570mg/kg (兔经皮)；LC50 6000mg/m3，2小时(小鼠吸入);刺激性家兔经眼:250 y g (24小吋)，重度刺激。亚急性和慢性毒性 兔吸入420mg/m3，7小吋/次，每周5次，6周，见肺充血、出血，支气管周围炎，心肌变性，肝肾充血、变性、坏死。生殖毒性家兔经ロ最低中毒剂量(TDLO) :6900 yg/kg(孕I 3天)，对发育有影响。鉴于三こ胺的安全性问题，根据EMEA相关规定，三こ胺在产品中的残留量限度应为彡320ppm,即0. 032%。残留溶剂的測定方法一般采用气相色谱法，进样方式有顶空进样和直接进样两种。顶空进样可以避免样品沉积在进样口受高温分解而污染进样ロ，以及样品的裂解产物在色谱系统中产生干扰峰。但是由于三こ胺的特殊性，在气相的进样管路特别是传输管线存在显著的吸附，导致三こ胺残留量无法有效检测检出灵敏度很低(0. 032%限度的三こ胺不能检出)，即使提高浓度后重现性也很差，出峰时间也不固定，主要原因在于三こ胺在管道反复吸附后缓慢洗脱。如果采用将样品溶解后直接进样，由于进样ロ的高温条件，青霉素、头孢菌素以及大环内酯等抗生素样品沉积在进样ロ，由于本身性质不稳定，在进样ロ的高温条件下(进样ロ温度至少在100°C以上，以保证分析物能够气化分离检测)样品分解产生众多干扰峰，掩盖和干扰三こ胺的检測。由于三こ胺的分子结构特点，也不适合其他分析检测方法如HPLC、IC等。因此，低限度的三こ胺残留量(0. 032%以下)检测一直是业内非常棘手的问题。虽然目前有ー些文献报道用顶空气相法測定头孢或大环内酯抗生素中残留的三こ胺，但如果不对进样通道系统进行彻底改造(改成惰性管路)，根本无法检测0. 032%限度的残留量，然而对成套精密仪器管路的改造绝非易事。另外也有文献报道用氯仿提取三こ胺后直接測定，但氯仿毒性较大，对操作者以及环境的污染都较大，氯仿提取后氯仿层在下面，分液取样困难，而且氯仿出峰位置与三こ胺出峰临近，高浓度的氯仿和残留物都很有可能干扰微量三こ胺的检測。因此，目前急需ー种能够安全有效地检测P -内酰胺抗生素中三こ胺残留量的方法。

发明内容
本发明的目的在于提供ー种从￠-内酰胺抗生素中更好地检测三こ胺残留量的方法。本发明提供了ー种P -内酰胺抗生素中三こ胺残留量的检测方法，它是通过气相色谱法进行測定的，具体操作如下
( I)供试品溶液的制备取待测样品，在氢氧化钠或氢氧化钾溶液中溶解，再加甲苯萃取，取上层溶液作为供试品溶液；(2)标准溶液的制备取三こ胺，在氢氧化钠或氢氧化钾溶液中溶解，再加甲苯萃取，取上层溶液作为标准溶液；(3)将供试品溶液、标准溶液分别注入气相色谱仪中进行測定，其中，色谱条件如下
进样方式直接进样；色谱柱非极性、弱极性或中等极性填料的毛细管柱；柱温30 50°C保持 3 lOmin，按 20 60°C /min 升温至 200°C，保持 2min ；检测器温度150 250°C ；进样ロ温度110 200で。上述方法中，采用甲苯为溶剂，其毒性较低，提取分离操作更方便，且在气相色谱中不能干扰三こ胺出峰；该方法还采用直接进样，可有效避免三こ胺在顶空进样器中的残留，检测更准确；同时，在改变提取溶剂的情况下，必须采用上述色谱条件进行检测，否则无法得到准确的检测結果。其中，步骤(I)中，待测样品与甲苯的重量体积比为(0.5 2. 0):(0. 5 2.0);步骤(2)中，三こ胺与甲苯的重量体积比为(1. 5 6. 0) X Kr4 : (0. 5 2. 0)。其中，步骤(3)中，所述色谱柱尺寸为(20 50)mX (0. 32 0. 5)mmX (0. 25
0.5) u m。进ー步地，步骤(3)中，所述色谱柱为填料为5% ニ苯基、1%こ烯基和94% ニ甲基硅氧烷的毛细管柱，30mX0. 32mmX0. 25iim ;或，填料为5% ニ苯基和95% ニ甲基硅氧烷的毛细管柱，50mX0. 5mmX0. 5iim ;或色谱柱填料为100%聚ニ甲基硅氧烷的毛细管柱，20mX0. 32mmX0. 25iim ;或色谱柱填料为50% ニ苯基和50% ニ甲基硅氧烷的毛细管柱，30mX 0. 5mmX 0. 32 u m。更进一歩地，步骤(3)中，所述色谱条件如下色谱条件A :色谱柱填料为5% ニ苯基、1%こ烯基和94% ニ甲基硅氧烷的毛细管柱，30mX0. 32mm ;柱温40°C保持5min，按40°C/min升温至200°C，保持2min ;检测器温度2000C ;进样ロ温度180°C ；或，色谱条件B :色谱柱填料为5% ニ苯基和95% ニ甲基硅氧烷的毛细管柱，50mX0. 5mm ;柱温50°C保持 3min，按 60°C /min 升温至 200°C，保持 2min ;检测器250°C ；进样ロ =IlO0C ；或，色谱条件C :色谱柱填料为100%聚ニ甲基硅氧烷的毛细管柱，20mX0. 32mm ；柱温30°C保持lOmin，按20°C /min升温至200°C，保持2min ;检测器150°C ;进样ロ 200 0C ；或，色谱条件D :色谱柱填料为50% ニ苯基和50% ニ甲基硅氧烷的毛细管柱，30mXO. 5mm ;柱温35°C保持 6min，按 50°C /min 升温至 200°C，保持 2min ;检测器220°C ；进样ロ 150°Co
更进ー步地，步骤(3)中，进样量0. 5 2 ii I ;分流比5:1 10:1 ;流速1 3mi/min。进ー步优选地,所述色谱条件A中,进样量2li I ;分流比5 1 ;流速2ml/min ；所述色谱条件B中,进样量ly I ;分流比10:1 ;流速3ml/min ；所述色谱条件C中，进样量0. 5 U I ;分流比5:1 ;流速lml/min ；所述色谱条件D中，进样量1. 5iil ;分流比8 1 ;流速2. 5ml/min。其中，步骤(I)的具体操作如 下取待测样品0. 5 2. 0g，加5 20ml水和I 5mol/L氢氧化钠或氢氧化钾溶液0. 5 2ml,混合使溶解,再加0. 50 2. Oml甲苯萃取,取上层溶液作为供试品溶液。其中，步骤(2)的具体操作如下取含三こ胺(1. 5 6. 0) XioVml的溶液1ml，加4 19ml水和I 5mol/L氢氧化钠或氢氧化钾溶液0. 5 2ml,混合使溶解,加0. 50 2. Oml甲苯萃取，取上层溶液作为标准溶液。其中，所述待测样品为头孢噻肟钠、头孢曲松钠、头孢妥仑钠、头孢美唑钠、头孢呋辛钠、头孢匹胺钠、头孢尼西钠、头孢地嗪钠、头孢孟多酯钠、头孢哌酮钠、头孢唑肟钠、头孢唑啉钠、头孢替唑钠、头孢噻吩钠或头孢噻利、比阿培南、法罗培南、厄他培南、氨苄西林、阿莫西林。本发明检测方法中，以甲苯为提取溶剂，在适当色谱条件的匹配下，能够准确有效的測定三こ胺的残留量，为￠-内酰胺抗生素中三こ胺残留量的检测提供了更为简便可行的新方法。


图1 :空白溶剂色谱图；图2 :三こ胺对照色谱图；图3 :样品色谱图(BD080701)；图4:样品色谱图(BD080702)；图5 :样品色谱图(BD080703)；图6方法专属性一标准溶液色谱图(正己烷提取)；图7方法专属性一空白溶液色谱图(正己烷提取)。
具体实施例方式实施例1头孢噻肟钠中三こ胺残留量的测定样品信息头孢噻肟钠，广西壮族自治区桂林市大华药业有限公司，批号BD080701、BD080702、BD080703。Agilent 6890 N Network GC System ；工作站Agilent chemstation ；Agilent HP-5,30m*0. 32mm*0. 25 u m ；SPH-300氢气发生器，北京中惠普；XffK-1II无油空气泵，天津市华生分析仪器厂；天平SartoriusALC-210. 4, ALC-210. 3, Sartorius cp225D ；
甲苯成都科龙化工试剂厂，070704，分析纯；2mol/L氢氧化钠溶液称去氢氧化钠8g，置烧杯中，加水适量、搅拌使溶解完全，加水稀释至100ml。供试品溶液精密称取3批样品各1. Og,置20ml具塞试管中，分别加IOml水和2mol/L氢氧化钠溶液1ml，混合使溶解，加1. Oml甲苯混合，強烈振摇2min，取上层溶液作为供试品溶液；三こ胺标准原液精密称取30mg三こ胺，置IOOml量瓶中，加水稀释至刻度，作为三こ胺标准原液；三こ胺标准溶液精密量取三こ胺标准原液1. 0ml，置20ml具塞试管中，加9ml水和2mol/L氢氧化钠溶液Iml,混合使溶解,加1. Oml甲苯混合,强烈振摇2min,取上层溶液作为标准溶液；空白溶液在20ml具塞试管中，分别加IOml水和2mol/L氢氧化钠溶液1ml，加1.Oml甲苯混合，強烈振摇2min，取上层溶液作为空白溶液；色谱条件色谱柱HP-5(5% ニ苯基 1% こ烯基 94% ニ 甲基硅氧烷)，30m*0. 32mm*0. 25 u m ；柱温4CTC(5min) — 4CTC/min — 20CTC (2min)；检测器200°C；进样ロ180°C ；进样量2ill;分流比5:1;流速2ml/min。结果空白溶剂不干扰三こ胺的检测，三批样品三こ胺残留量检验结果见表I。表I头孢噻肟钠三こ胺残留量检测结果 L0067」
权利要求
1.一种β-内酰胺抗生素中三乙胺残留量的检测方法，其特征在于它是通过气相色谱法进行测定的，具体操作如下(1)供试品溶液的制备取待测样品，在氢氧化钠或氢氧化钾溶液中溶解，再加甲苯萃取，取上层溶液作为供试品溶液；(2)标准溶液的制备取三乙胺，在氢氧化钠或氢氧化钾溶液中溶解，再加甲苯萃取，取上层溶液作为标准溶液；(3)将供试品溶液、标准溶液分别注入气相色谱仪中进行测定，其中，色谱条件如下进样方式直接进样；色谱柱非极性、弱极性或中等极性填料的毛细管柱；柱温30 50°C保持3 lOmin，按20 60°C /min升温至200°C，保持2min ；检测器温度150 250°C ；进样口温度110 200°C。
2.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于步骤(I)中，待测样品与甲苯的重量体积比为(O. 5 2. 0):(0. 5 2. O);步骤(2)中，三乙胺与甲苯的重量体积比为(1. 5 6.O) X 10_4 : (O. 5 2. O)。
3.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于步骤(3)中，所述色谱柱尺寸为 (20 50)mX (O. 32 O. 5)mmX (O. 25 O. 5) μ m。
4.根据权利要求1或3所述的检测方法，其特征在于步骤(3)中，所述色谱柱为填料为5% 二苯基、1%乙烯基和94% 二甲基硅氧烷的毛细管柱，30mX O. 32mmX0. 25 μ m ；或，填料为5% 二苯基和95% 二甲基硅氧烷的毛细管柱，50mX O. 5mmX0. 5ym；或，色谱条件C :色谱柱填料为100%聚二甲基硅氧烷的毛细管柱， 20mX O. 32mmX O. 25 μ m ；或，色谱条件D :色谱柱填料为50% 二苯基和50% 二甲基硅氧烷的毛细管柱， 30mX O. 5mmX O. 32 μ m。
5.根据权利要求1-4任意一项所述的检测方法，其特征在于步骤(3)中，所述色谱条件如下色谱条件A :色谱柱填料为5% 二苯基、1%乙烯基和94% 二甲基硅氧烷的毛细管柱， 30mX O. 32mmX O. 25 μ m ;柱温:40°C保持 5min，按 40°C /min 升温至 200。。，保持 2min ;检测器温度200°C ;进样口温度180°C ；或，色谱条件B:色谱柱填料为5% 二苯基和95% 二甲基硅氧烷的毛细管柱， 50mX0. 5mmX0. 5μπι;柱温:50°C 保持 3min，按 60°C/min 升温至 200°C，保持 2min ;检测器 250°C ;进样口 IIO0C ；或，色谱条件C :色谱柱填料为100%聚二甲基硅氧烷的毛细管柱， 20mX0. 32mmX0. 25μπι;柱温30°C保持 lOmin，按 20°C /min 升温至 200°C，保持 2min ;检测器150°C ;进样口 :200°C ；或，色谱条件D :色谱柱填料为50% 二苯基和50% 二甲基硅氧烷的毛细管柱， 30mXO. 5mmXO. 32μπι;柱温35°C保持 6min，按 50°C /min 升温200°C，保持 2min ;检测器:220°C ;进样口 150°Co
6.根据权利要求1-5任意一项所述的检测方法，其特征在于步骤(3)中，进样量O.5 2 μ I ;分流比:5:1 10:1 ;流速1 3ml/min。
7.根据权利要求5或6所述的检测方法，其特征在于所述色谱条件A中,进样量2μ I ;分流比5 1 ;流速2ml/min ；所述色谱条件B中,进样量1μ I ;分流比10:1 ;流速3ml/min ；所述色谱条件C中,进样量0. 5μ I ;分流比5 1 ;流速lml/min ；所述色谱条件D中，进样量1. 5μ I ;分流比8 1 ;流速2. 5ml/min。
8.根据权利要求1-7任意一项所述的检测方法，其特征在于步骤(I)的具体操作如下取待测样品O. 5 2. Og,加5 20ml水和I 5mol/L氢氧化钠或氢氧化钾溶液O. 5 2ml，混合使溶解，再加O. 50 2. Oml甲苯萃取，取上层溶液作为供试品溶液。
9.根据权利要求1-7任意一项所述的检测方法，其特征在于步骤(2)的具体操作如下取含三乙胺(1. 5 6. O) X lCT4g/ml的溶液Iml,加4 19ml水和I 5mol/L氢氧化钠或氢氧化钾溶液O. 5 2ml,混合使溶解,加O. 50 2. Oml甲苯萃取,取上层溶液作为标准溶液。
10.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于所述待测样品为头孢噻肟钠、头孢曲松钠、头孢妥仑钠、头孢美唑钠、头孢呋辛钠、头孢匹胺钠、头孢尼西钠、头孢地嗪钠、头孢孟多酯钠、头孢哌酮钠、头孢唑肟钠、头孢唑啉钠、头孢替唑钠、头孢噻吩钠、头孢噻利、比阿培南、法罗培南、厄他培南、氨苄西林或阿莫西林。
全文摘要
本发明提供了一种β-内酰胺抗生素中三乙胺残留量的检测方法，它是通过气相色谱法进行测定的。本发明检测方法中，以甲苯为提取溶剂，在适当色谱条件的匹配下，可以准确有效的测定三乙胺的残留量，为β-内酰胺抗生素中三乙胺残留量的检测提供了更为简便可行的新方法。
文档编号G01N30/60GK103018387SQ201210548588
公开日2013年4月3日 申请日期2012年12月17日 优先权日2012年12月17日
发明者赵忠琼, 余佳, 徐国熙, 李明, 杨蕾, 梁隆, 王利春, 沈鑫, 程志鹏 申请人:四川科伦药物研究有限公司