专利名称：同时检测兰花病毒CyMV和ORSV免疫胶体金试纸条的制备方法
技术领域：
本发明涉及一种免疫胶体金试纸条的制备方法，特别是一种可同时检测兰花 病毒CyMV和ORSV免疫胶体金试纸条的制备方法。
背景技术：
兰花由于其品种丰富、花色艳丽、花期长等特点，深受民众喜爱，成为盆花中最流 行的品种，近几年来，兰花在我国的发展速度之快，远远超出了人们的预计。但是兰花及易 染上病毒病，病毒在兰花植株上造成全身系统性感染，使兰株生长缓慢，叶片出现条纹、斑 块、坏疽或绿色分布不均的嵌纹病征。人工栽培蝴蝶兰时所采取的任何可以造成机械性伤 口的机会、栽培过病株的盆钵、甚至灌溉水均可以导致病毒的传播，加上近年来兰花产业逐 渐规模化以后，为了达到快速繁殖种苗所采用的组培技术，更加速了病毒的全面蔓延。
在各种已知的兰花病害中以病毒病(Virusdiseases)特别容易随无性分生繁殖 而散布到后代种苗。可以感染兰花之病毒种类至少有四种。但普遍发生的只有建兰花叶 病毒(Cymbidium mosaic virus,简禾尔 CymMV)、齿兰轮斑病毒(Odontoglossumringspot virus,简称0RSV)、和黄瓜花叶病毒(Cucumber mosaic virus,简称CMV)等三种。不过多 项调查报告显示感染情况最普遍，对全球兰花产业影响最严重的是CyMV及0RSV。据估计， 当前我国生产者使用的蝴蝶兰种苗几乎90%以上携带这两种病毒，台湾地区生产的蝴蝶兰 种苗中，这两种病毒的携带率也在70%左右。因此能有效提高兰花病毒的检测效率，不仅可 以提高兰花种苗的经济效益，也可以提高国内兰花产业的竞争力。
目前对兰花病毒的检测方法主要包括指示植物法、电镜观察法、血清学方法和分 子检测技术的研究，包括RT-PCR、分子探针等。
1.指示植物法指示植物法虽然简单，但存在很多不足。在实际鉴定中多为几种 病毒复合侵染，症状表现变化较大，且不同时期指示植物上的症状表现也有差异，从而增加 了检测难度；检测速度慢，周期性长，需要时间3-20几天不等，且灵敏度较低；接种后的症 状表现受季节的限制和外界环境的影响较大，维护指示植物园费用也高。
2.电镜观察法这种方法简便快捷，适用于大量样品的检测，但由于电镜技术需 要较高倍数的电子显微镜，而且样品的制备费用较高，提取病毒难度较大，所以电子显微镜 技术受到一定的限制。
3.血清学方法利用抗原抗体的免疫学反应来检测植物是否带病毒的方法。目前 主要是采用酶联免疫吸附法(ELISA)和点免疫结合试验(DIBA)，存在以下缺点a只适用 于大量样品的检测，不能实现单一样品的检测；b需要专门的仪器设备和专业的技术操作 人员，不利于推广；c操作过程相对复杂，检测时间长，4-12小时不等。现也有开发了兰花 病毒胶体金检测试剂纸，这是血清学方法的一种，是近年来兰花检测中较新的一种方法。由 于只能进行病毒的单一检测，成本较高，没有得到推广。
4.分子检测技术目前常用的分子生物学技术包括核酸分子杂交技术和RT-PCR3方法。RT—PCR方法检测植物病毒具有灵敏、快速、特异性强等优点，其专一性和灵敏性则 优于免疫学方法，且目前已开发了两种病毒的多重检测。但由于兰花病毒为RNA病毒，RNA 很容易降解，提取和操作过程对于环境和技术要求较高，实验时需要昂贵的试剂和特殊的 设备，只能在较好的实验室内进行，不利于普及。
5.国内2007年福建农林大学的林志铿、吴祖建等曾发明应用于兰花病毒的单种 病毒检测试纸条，虽然其采用相同的原理，但是其采用的多克隆抗体，灵敏度较单克隆抗体 要弱，特异性较差，同时不能同时检测两种病毒，需要分开检测，整体耗时长，并浪费耗材。发明内容
本发明的目的是要提供一种可同时检测兰花病毒CyMV和ORSV的免疫胶体金试纸 的制备方法，该试纸可以一次性快速检测CyMV和ORSV两种病毒，减少多次采样对兰花样品 的污染，也可以减少不必要的耗材浪费。
本发明是这样实现的，所述同时检测兰花病毒CyMV和ORSV免疫胶体金试纸条的 制备方法，包括如下步骤a)CyMV单克隆抗体的制备通过同源克隆方法获得CyMV病毒外壳蛋白基因，构建原 核表达载体，通过诱导表达获得CyMV-CP的外源融合蛋白，或者将表达纯化好的外源融合 蛋白注射小鼠，制备融合细胞，并通过筛选，制备特异性高的单克隆抗体，提纯抗体，纯度不 小于95% ；b)ORSV单克隆抗体的制备通过同源克隆方法获得ORSV病毒外壳蛋白基因，构建原核 表达载体，通过诱导表达获得ORSV-CP的外源融合蛋白，或者将表达纯化好的外源融合蛋 白注射小鼠，制备融合细胞，并通过筛选，制备特异性高的单克隆抗体，提纯抗体，纯度不小 于 95% ；c)胶体金将IOOml0. 01%氯化金用2-3ml的1%柠檬酸三钠还原成15nm_60nm的胶 体金溶液；d)胶体金复溶液1%牛血清白蛋白，0.5%脱脂干奶粉，0. 05%叠氮化钠NaN3，1%吐 温-20，0. 01MpH7. 0磷酸缓冲液，0. 22U膜过滤，置2— 8°C备用，有效期15天；e)CyMV免疫胶体金溶液用0. lmol/LK2C0d#胶体金溶液的pH值调至7-8. 5，将胶体金 溶液按IOOml胶体金溶液中加入0. 5mg-2mg CyMV单克隆抗体，混合均勻，并加入牛血清白 蛋白进行封闭，使其终浓度为0. 5%- ，离心去上清液，加入十分之一体积的胶体金复溶液， 得到CyMV免疫胶体金溶液；f)ORSV免疫胶体金溶液用0. ImoVLK2COdf胶体金溶液的pH值调至7-8. 5，将胶体金 溶液按IOOml胶体金溶液中加入0. 5mg-2mg ORSV单克隆抗体，混合均勻，并加入牛血清白 蛋白进行封闭，使其终浓度为0. 5%- ，离心去上清液，加入十分之一体积的胶体金复溶液， 得到ORSV免疫胶体金溶液；g)将e)步骤的CyMV免疫胶体金溶液和f)步骤的ORSV免疫胶体金溶液混合并加入一 定量的胶体金复溶液，直至在电子显微镜下观察到CyMV和ORSV免疫胶体金溶液均勻混合， 将上述混合溶液每毫升均勻铺在22-50cm2的玻璃纤维上，干燥后形成CyMV和ORSV免疫胶 体金垫；h)将CyMV和ORSV单克隆抗体溶液分别按顺序点在硝酸纤维膜的检测线上，羊抗兔多克隆抗体点在硝酸纤维膜的质控线上；i)分别将由吸水滤纸制成的样品垫、CyMV和ORSV免疫胶体金垫、硝酸纤维素膜和吸水 纸依次粘贴到一张带不干胶的PVC胶板上，成为试纸条；并在试纸条上粘上带有插入液体 液面最高限位的指示线MAX的透明不干胶； j)将干燥的试纸条用铝箔密封包装保存。
本发明的有益效果是，本发明所用的免疫抗原为原核表达抗原，是针对特异的病 毒外壳蛋白设计并表达的抗原，其免疫原性高，所制备的抗体能特异性识别病毒外壳蛋白， 从而提高检测的灵敏度和准确性；用本发明检测兰花病毒，检测时间短，检测成本低，检测 精度尚°


图1为本发明示意图。
图2、3为本发明包装上的样板图。
图中1.吸水滤纸制成的样品垫，2. CyMV和ORSV免疫胶体金垫，3.硝酸纤维素 膜，4.吸水纸，5. PVC胶板，6. CyMV单克隆抗体溶液点在检测线，7. ORSV单克隆抗体溶液 点在检测线，8.羊抗兔多克隆抗体点在质控线。
具体实施方式
本发明所述同时检测兰花病毒CyMV和ORSV免疫胶体金试纸条的制备方法，如图 1、2、3所示，包括如下步骤a)CyMV单克隆抗体的制备通过同源克隆方法获得CyMV病毒外壳蛋白基因，构建原核 表达载体，通过诱导表达获得CyMV-CP的外源融合蛋白，或者将表达纯化好的外源融合蛋 白注射小鼠，制备融合细胞，并通过筛选，制备特异性高的单克隆抗体，提纯抗体，纯度不小 于 95% ；b)ORSV单克隆抗体的制备通过同源克隆方法获得ORSV病毒外壳蛋白基因，构建原核 表达载体，通过诱导表达获得ORSV-CP的外源融合蛋白，或者将表达纯化好的外源融合蛋 白注射小鼠，制备融合细胞，并通过筛选，制备特异性高的单克隆抗体，提纯抗体，纯度不小 于 95% ；c)胶体金将IOOml0. 01%氯化金用2-3ml的1%柠檬酸三钠还原成15nm_60nm的胶 体金溶液；d)胶体金复溶液1%牛血清白蛋白，0.5%脱脂干奶粉，0. 05%叠氮化钠NaN3，1%吐 温-20，0. 01MpH7. 0磷酸缓冲液，0. 22U膜过滤，置2— 8°C备用，有效期15天；e)CyMV免疫胶体金溶液用0. lmol/LK2C0d#胶体金溶液的pH值调至7-8. 5，将胶体金 溶液按IOOml胶体金溶液中加入0. 5mg-2mg CyMV单克隆抗体，混合均勻，并加入牛血清白 蛋白进行封闭，使其终浓度为0. 5%- ，离心去上清液，加入十分之一体积的胶体金复溶液， 得到CyMV免疫胶体金溶液；f)ORSV免疫胶体金溶液用0. ImoVLK2COdf胶体金溶液的pH值调至7-8. 5，将胶体金 溶液按IOOml胶体金溶液中加入0. 5mg-2mg ORSV单克隆抗体，混合均勻，并加入牛血清白 蛋白进行封闭，使其终浓度为0. 5%- ，离心去上清液，加入十分之一体积的胶体金复溶液，得到ORSV免疫胶体金溶液；g)将e)步骤的CyMV免疫胶体金溶液和f)步骤的ORSV免疫胶体金溶液混合并加入一 定量的胶体金复溶液，直至在电子显微镜下观察到CyMV和ORSV免疫胶体金溶液均勻混合， 将上述混合溶液每毫升均勻铺在22-50cm2的玻璃纤维上，干燥后形成CyMV和ORSV免疫胶 体金垫；h)将CyMV和ORSV单克隆抗体溶液分别按顺序点在硝酸纤维膜的检测线上，羊抗兔多 克隆抗体点在硝酸纤维膜的质控线上；i)分别将吸水滤纸制成的样品垫1、CyMV和ORSV免疫胶体金垫2、硝酸纤维素膜3和 吸水纸4依次粘贴到一张带不干胶的PVC胶板5上，成为试纸条；并在试纸条上粘上带有插 入液体液面最高限位的指示线MAX的透明不干胶；j)将干燥的试纸条用铝箔密封包装保存。
图1中在硝酸纤维膜3上标有CyMV单克隆抗体溶液点在检测线6上和ORSV单克 隆抗体溶液点在检测线7上，以及羊抗兔多克隆抗体点在质控线8上。
用本发明同时检测兰花病毒CyMV和ORSV免疫胶体金试纸条检测兰花病毒的方 法，包括以下步骤1、待测样品收集及处理称取兰花叶片(或是花、根)0. 5g于2ml样品管子里，加入 0. 01MpH7. 4磷酸缓冲液，用玻棒捣碎，然后SOOOrpm离心5分钟，取上清，即为待测样品溶液。
2、检测前将同时检测兰花病毒CyMV和ORSV免疫胶体金试纸条恢复至室温；3、在同时检测兰花病毒CyMV和ORSV免疫胶体金试纸条的样品区滴入3滴步骤1制备 的样品溶液，或将本试纸条插入步骤1制备的样品溶液，液面不超过指示线MAX(如图2、3);4、反应3-30分钟后判定结果。
在本发明包装物上设有样板图，如图2、图3所示，图2中仅有质控线红色条带，为 没有病毒的样板图；图3的左侧图中分别标有CyMV单克隆抗体显示区的红色条带、ORSV单 克隆抗体显示区的红色条带、质控线的红色条带，表明同时带有CyMV和ORSV病毒；图3的 右侧图中标有ORSV单克隆抗体显示区的红色条带、质控线的红色条带，表明仅有ORSV病
若在同时检测兰花病毒CyMV和ORSV免疫胶体金试纸条的质控线显红色条带、 CyMV单克隆抗体显示区内没有红色条带，说明样品溶液中没有CyMV病毒或是样品溶液中 所含的CyMV病毒量低于同时检测兰花病毒CyMV和ORSV免疫胶体金试纸条检测下限。
若在同时检测兰花病毒CyMV和ORSV免疫胶体金试纸条的质控线显红色条带、 ORSV单克隆抗体显示区内没有红色条带，说明样品溶液中没有ORSV病毒或是样品溶液中 所含的ORSV病毒量低于同时检测兰花病毒CyMV和ORSV免疫胶体金试纸条检测下限。
若在CyMV单克隆抗体显示区和ORSV单克隆抗体显示区均出现红色条带，则说明 样品溶液中含有CyMV和ORSV两种病毒，且含量均超过了检测下限。
若仅在CyMV单克隆抗体显示区有红色条带或是ORSV单克隆抗体显示区有红色条 带，则说明样品溶液中含有其中一种病毒且病毒量超过检测下线。权利要求
1.同时检测兰花病毒CyMV和ORSV免疫胶体金试纸条的制备方法，包括如下步骤a)CyMV单克隆抗体的制备通过同源克隆方法获得CyMV病毒外壳蛋白基因，构建原核 表达载体，通过诱导表达获得CyMV-CP的外源融合蛋白，或者将表达纯化好的外源融合蛋 白注射小鼠，制备融合细胞，并通过筛选，制备特异性高的单克隆抗体，提纯抗体，纯度不小 于 95% ；b)ORSV单克隆抗体的制备通过同源克隆方法获得ORSV病毒外壳蛋白基因，构建原核 表达载体，通过诱导表达获得ORSV-CP的外源融合蛋白，或者将表达纯化好的外源融合蛋 白注射小鼠，制备融合细胞，并通过筛选，制备特异性高的单克隆抗体，提纯抗体，纯度不小 于 95% ；c)胶体金将IOOml0. 01%氯化金用2-3ml的1%柠檬酸三钠还原成15nm_60nm的胶 体金溶液；d)胶体金复溶液1%牛血清白蛋白，0.5%脱脂干奶粉，0. 05%叠氮化钠NaN3，1%吐 温-20,0. 01MpH7. 0磷酸缓冲液，0. 22U膜过滤，置2— 8°C备用；e)CyMV免疫胶体金溶液用0. lmol/LK2C0d#胶体金溶液的pH值调至7-8. 5，将胶体金 溶液按IOOml胶体金溶液中加入0. 5mg-2mg CyMV单克隆抗体，混合均勻，并加入牛血清白 蛋白进行封闭，使其终浓度为0. 5%- ，离心去上清液，加入十分之一体积的胶体金复溶液， 得到CyMV免疫胶体金溶液；f)ORSV免疫胶体金溶液用0. ImoVLK2COdf胶体金溶液的pH值调至7-8. 5，将胶体金 溶液按IOOml胶体金溶液中加入0. 5mg-2mg ORSV单克隆抗体，混合均勻，并加入牛血清白 蛋白进行封闭，使其终浓度为0. 5%- ，离心去上清液，加入十分之一体积的胶体金复溶液， 得到ORSV免疫胶体金溶液；g)将e)步骤的CyMV免疫胶体金溶液和f)步骤的ORSV免疫胶体金溶液混合并加入一 定量的胶体金复溶液，直至在电子显微镜下观察到CyMV和ORSV免疫胶体金溶液均勻混合， 将上述混合溶液每毫升均勻铺在22-50cm2的玻璃纤维上，干燥后形成CyMV和ORSV免疫胶 体金垫；h)将CyMV和ORSV单克隆抗体溶液分别按顺序点在硝酸纤维膜的检测线上，羊抗兔多 克隆抗体点在硝酸纤维膜的质控线上；i)分别将吸水滤纸制成的样品垫、CyMV和ORSV免疫胶体金垫、硝酸纤维素膜和吸水纸 依次粘贴到一张带不干胶的PVC胶板上，成为试纸条；并在试纸条上粘上带有插入液体液 面最高限位的指示线MAX的透明不干胶；j)将干燥的试纸条用铝箔密封包装保存。
全文摘要
本发明所述同时检测兰花病毒CyMV和ORSV免疫胶体金试纸条的制备方法，将CyMV和ORSV单克隆抗体溶液分别按顺序点在硝酸纤维膜的检测线上，羊抗兔多克隆抗体点在硝酸纤维膜的质控线上；分别将吸水滤纸制成的样品垫、CyMV和ORSV免疫胶体金垫、硝酸纤维素膜和吸水纸依次粘贴到一张带不干胶的PVC胶板上，成为试纸条。本发明具有操作简单快速、结果准确、成本低廉的优点，减少多次采样对兰花样品的污染，也可以减少不必要的耗材浪费。
文档编号G01N33/569GK102043056SQ20101053920
公开日2011年5月4日 申请日期2010年11月10日 优先权日2010年11月10日
发明者郭莺 申请人:福建省亚热带植物研究所