专利名称：一种高效价、高特异性抗人神经巢蛋白单克隆抗体及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及生物工程技术领域，特别涉及一种高效价、高特异性抗人神经巢蛋白单克隆抗体及其应用。
背景技术：
人神经巢蛋白简称Nestin，是一个中等纤维骨架蛋白，属于第VI类中间丝蛋白，因其在中枢神经系统发育过程中的瞬时性表达而被克隆，一直被作为神经干细胞特异性的标志。随着分子生物学和基因治疗技术的飞快发展，采用神经干细胞移植治疗脊髓损伤(SCI)已被公认为最新、最有前途的治疗方法之一。由于国内外科研机构将主要精力放在神经干细胞的体外培养、扩增、移植方面，因此，建立神经干细胞检测体系尤为重要。抗人Nestin 单克隆抗体是对人神经干细胞进行鉴定最特异的方法，完全符合分子免疫学原理，但是，高效价、高特异性的抗人神经巢蛋白单克隆抗体目前尚未见到报道。

发明内容
本发明的目的在于提供一种高效价、高特异性抗人神经巢蛋白单克隆抗体及其应用。本发明的整体技术构思是利用细胞融合、亚克隆及多例多种组织和细胞的特异性筛选技术，获得高效价、高特异性抗人神经巢蛋白单克隆抗体，由于此单抗效价高、特异性好，可直接应用于基础医学研究，或制成多种体外诊断试剂盒进行神经干细胞的鉴定和神经干细胞移植后的疗效评价。本发明所述抗人神经巢蛋白单克隆抗体，其重链可变区氨基酸序列如SEQ IDNO. I所示，其轻链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO. 2所示；或其重链可变区由SEQ ID NO. I所示的氨基酸序列经过取代、缺失、或添加一个或几个氨基酸衍生的与SEQ ID NO. I的氨基酸序列至少有95%的一致性，轻链可变区由SEQ ID NO. 2所示的氨基酸序列经过取代、缺失、或添加一个或几个氨基酸衍生的与SEQ ID NO. 2的氨基酸序列至少有95%的一致性且所述单克隆抗体具有特异性结合Nestin的活性。作为优选，所述单克隆抗体包括单链抗体、双链抗体、嵌合抗体、人源化抗体、以及上述抗体的衍生物、功能等同物和同源物，也包括抗体片段和含有抗原结合结构域的任何多肽。本发明所述“抗体”应该解释为涵盖具有所需特异性的结合结构域的任意特异性结合因子。因而，这个术语涵盖了与之同源的抗体片段、衍生物、人源化抗体以及抗体的功能等同物和同源物，也包括含有抗原结合结构域的任何多肽，无论是天然的还是合成产生的。抗体的实例是免疫球蛋白亚型(如IgG，IgE, IgM, IgD和IgA)及其亚型亚类；也可以是包含抗原结合结构域的片段如Fab、scFv、Fv、dAb、Fd ;和双链抗体(diabodies)。融合至另一多肽的、包含抗原结合结构域的嵌合体分子或者等同物也包括在其中。嵌合抗体的克隆与表达在EP. A-0120694和EP. A. 0125023中描述。本发明所述单克隆抗体可以是，例如，单价的或是单链抗体、双链抗体、嵌合抗体、人源化抗体、以及上述抗体的衍生物、功能等同物和同源物，也包括抗体片段和含有抗原结合结构域的任何多肽。抗体可以通过许多方式修饰，可用DNA重组技术来产生保留原来抗体特异性的其它抗体或嵌合分子。这种技术可以包括将编码抗体的免疫球蛋白可变区或互补性决定区(⑶Rs)的DNA引入不同免疫球蛋白的恒定区或恒定区加框架区。参见，EP. A. 184187,GB2188638A或.EP. A. 239400。还可以对杂交瘤细胞或产生抗体的其它细胞进行遗传突变或其它改变，这可以改变或者不改变所产生抗体的结合特异性。用于本发明的单克隆抗体也可用杂交瘤方法制得，因为编码本发明人源化抗体的DNA序列可用本领域技术人员熟知的常规手段，如根据本发明公开的氨基酸序列人工合成或用PCR法扩增得到，因而也可用重组DNA方法，可用本领域熟知的各种方法将该序列连入 合适的表达载体中。最后，在适合本发明抗体表达的条件下，培养转化所得的宿主细胞，然后本领域技术人员应用熟知的常规分离纯化手段纯化得到本发明的单克隆抗体。如上所述，本发明还提供了用于实施本发明抗体的试剂、试剂盒或芯片。试剂、试剂盒或芯片至少包括如下一种或多种根据以上方法制成的抗体，编码该抗体的核苷酸，或包含该抗体的真核细胞、原核细胞和病毒以及任选的缓冲溶液。本发明还具体公开所述抗人神经巢蛋白单克隆抗体的制备方法，它包括如下工艺步骤(I)动物免疫将高纯度的人神经巢蛋白片段(LASTPIP PTPQAPSPAV) Iml充分乳化，免疫与所用骨髓瘤细胞同源的BALB/c健康小鼠，每只腹腔注射乳化后的高纯度人神经巢蛋白，用酶联免疫吸附实验方法测定其抗血清；(2)分离脾细胞取未免疫的BALB/c健康小鼠腹腔巨噬细胞，铺植96孔培养板，将换液后的Sp2/0细胞调整为细胞悬液，分离免疫的小鼠脾细胞并制成细胞悬液；(3)细胞融合将具有较高活性Sp2/0骨髓瘤细胞与脾细胞悬液按I :10比例混合，30秒内逐渐加入45%PEG (分子量4000)，静止90秒，使细胞彼此融合，在两种细胞的混合细胞悬液中滴加培养液，以HAT选择培养基进行细胞培养；(4)筛选杂交肿瘤细胞待融合的细胞培养至第七天时，吸取96孔培养板的孔中出现克隆细胞簇的培养上清用酶联免疫吸附实验方法检测抗体含量，经有限稀释进行三次亚克隆筛选，依抗体的分泌情况筛选出高效价的抗体分泌孔，将孔中细胞扩大培养，然后进行抗原特异性免疫组织化学原位测定，选高效价，高特异性的细胞株再扩大培养并冻存；(5)单克隆抗体特异性筛选选经酶联免疫吸附实验检测抗体效价大于I :10000的阳性孔的上清，与体外培养的人胚神经干细胞、多种成人正常组织、肿瘤组织、人胚胎组织及人体外培养细胞株进行免疫组化特异性筛选。(6)单克隆抗体纯化保存选用BALB/c小鼠或其亲代小鼠，先用降植烷或液体石蜡行小鼠腹腔注射，后将杂交瘤细胞接种到小鼠腹腔中，一周后收集小鼠的腹水，使用AKTA-FPLC蛋白纯化仪将小鼠IgG单克隆抗体腹水溶液在A280nm时收集，I. 44 (吸光单位)浓度为lmg/ml。本发明还提供所述的单克隆抗体在制备用于鉴定神经干细胞的试剂中的用途。
本发明的另一个目的是提供一种试剂、试剂盒或芯片，包含所述的单克隆抗体。本发明所取得技术进步在于所获得的抗人神经巢单克隆抗体效价高、特异性非常好，可直接标记多种示踪物，借助目前先进的检测仪器如流式细胞仪、化学发光检测仪、磁性分选仪等进行神经干细胞的阳选。本发明将高纯度人神经巢蛋白经免疫动物、细胞融合、克隆化培养、以及大量的组织细胞原位特异性筛选从而获得高效价、高特异性的抗人Nesting单克隆抗体,此抗体可直接应用于临床检测和基础研究。单克隆抗体在生物学和医学研究领域中具有极大的应用价值，是亲和层析中重要的配体，是免疫组化中主要的抗体，是免疫检验中的新型试剂，是生物治疗的导向武器。作为神经干细胞的检测试剂，抗人神经巢蛋白单克隆抗体可以充分发挥其优势。单克隆抗体的特异性强，可将抗原抗体反应的特异性大大提高，减少了可能的交叉反应，使试验结果可信度更大。单克隆抗体的均一性和生物活性单一性使抗原抗体反应结果便于质量控制，利于标准化和规范化。
具体实施例方式本发明公开了一种高效价、高特异性抗人神经巢蛋白单克隆抗体及其应用，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的产品及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。在进一步阐述本发明之前，我们有必要认识到，本发明并不局限于描述的特定的实施方案，也就是说，在具体形式上可能存在着变化。还有一点需要提醒的是，由于本发明的范围受附加的权利要求书的限制，因此，本文使用的术语只是为了描述特定实施方案的目的，而不是为了限制本发明的目的。术语“抗体”和“免疫球蛋白”在本文中可以互换使用。这些术语均为本领域技术人员所熟知的术语，具体是指由能特异结合抗原的一种或多种多肽构成的蛋白质。抗体的一种形式构成了抗体的基本结构单元。这种形式是四聚物，它由两对完全相同的抗体链构成，每一对都有一个轻链和一个重链。在每对抗体链中，轻链和重链的可变区联合在一起共同负责结合抗原，而恒定区则负责抗体的效应器功能。目前已知的免疫球蛋白多肽包括K和X轻链，以及a，Y (IgG1, IgG2, IgG3, IgG4), S，e和ii重链或它们的其它类型等价物。全长的免疫球蛋白“轻链”(大约25kDa或大约214个氨基酸)包含一个由NH2-末端上大约110个氨基酸形成的可变区，以及一个COOH-末端上的K或\恒定区。全长的免疫球蛋白“重链”(大约50kDa或大约446个氨基酸)，同样包含一个可变区(大约116个氨基酸)，以及重链恒定区之一，例如Y (大约330个氨基酸)。术语“抗体”和“免疫球蛋白”包括任何同型体的抗体或免疫球蛋白，或保持与抗原特异结合的抗体片段，包括但不限于Fab，Fv, scFv和Fd片段、嵌合抗体、人源化抗体、单链抗体以及包含抗体的抗原结合部分和非抗体蛋白质的融合蛋白质。抗体可以被标记和检测，例如，可以通过放射性同位素、能产生可检测物的酶、荧光蛋白质、生物素等等进行标记并被检测。抗体还可以结合于固相载体，包括但不限于聚苯乙烯平板或珠粒等等。该术语还包括Fab’、Fv、F(ab’)2和/或其它能与抗原特异性结合的抗体片段和单克隆抗体。抗体还可以以多种形式存在，例如包括Fv、Fab和(Fab’)2，以及双功能杂合抗体(例如文献，Lanzavecchia 等，Eur. J. Immunol. , 1987 ; 17，105)以及以单链形式(例如，Huston 等,Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A.，1988 ;85，5879 和 Bird 等,Science, 1988 ；242, 423,在此引用作为参考)存在。免疫球蛋白的重链或轻链可变区由三个超变区(也称为“互补决定区”或⑶R)组成，这些超变区被框架区(FR)间隔。框架区和互补决定区的范围已被精石角定义(参见〃Sequences of Proteins of Immunological Interest, 〃E. Kabat等，U. S. Department of Health and Human Services, 1991)。此处所讨论的所有抗体氨基酸序列的排序都参照Kabat系统。同一物种不同的轻链和重链框架区序列相对保守。抗体的框架区用于定位和校准CDR。CDR主要负责结合抗原的表位。嵌合抗体是其重链和轻链基因经过构建的抗体，特别是利用基因工程改造的属于不同物种的抗体可变区和恒定区基因。例如，可以将鼠单克隆抗体基因的可变区片段连接到人抗体恒定区片段如Y I和Y3。例如治疗用嵌合抗体是一种嵌合蛋白质，它由来源于兔抗体可变区片段或抗原结合区片段和人抗体恒定区或效应区结合(如由A. T. C. C.保藏登 记号CRL 9688的细胞制备的抗Tac嵌合抗体)，当然，嵌合抗体的基因来源也可以使用其它哺乳动物物种。可以理解本发明设计和生产的人源化抗体可能会替代某些保守性氨基酸，这些氨基酸对抗原结合或抗体其他功能基本上没有影响。换而言之，gly和ala ;val、ile和Ieu ；asp和glu ；asn和gin ；ser和thr ；lys和arg ；phe和tyr,以上各组合内部的氨基酸可相互取代。抗体重链或轻链的“可变区”是该链的N端成熟区域。所有区域、CDR和残基编号均以序列比对、按已有的结构知识为基础进行定义。框架区和CDR残基的鉴定和编号按 Chothia 和他人所述(Chothia, Structural determinants in the sequences ofimmunoglobulin variable domain. J Mol Biol. 1998 ;278,457)。VH是抗体重链的可变区。VL是抗体轻链的可变区，它可能具有K和\同种型。K-I抗体具有K -I同种型而K-2抗体具有K -2同种型，VA是可变的入轻链。“相应的氨基酸”，是指当两个或多个氨基酸序列比对时，位于相同位置(也就是它们彼此对应)的氨基酸残基。抗体序列比对和编号的方法在Chothia，见上，Kabat，见上和其他中得到详尽阐述。本领域普通技术人员已知(参见如Kabat 1991Sequences of Proteinsof Immunological Interest, DHHS, Washington, DC),有时可以在抗体的一个或两个氨基酸中制造一个、两个或三个缺口和/或插入1、2、3或4个残基或者至多约15个残基(特别是在L3和H3⑶R中)，从而完成一次比对。“可取代位置”，指的是抗体的一个特殊位置，其可以被不同的氨基酸取代而不会使抗体的结合活性显著降低。鉴定可取代位置的方法和它们可以被如何取代在下面将进行更加详细的描述。可取代位置也可以称为“变异耐受位置”。为了使本领域的技术人员更好地理解本发明的技术方案，下面结合具体实施例对本发明作进一步的详细说明。实施例I :本发明所述单抗的制备本发明所述高效价、高特异性抗人神经巢蛋白单克隆抗体的制备，包括如下工艺步骤(I)动物免疫将高纯度的人神经巢蛋白片段(LASTPIP PTPQAPSPAV，自主设计合成序列)lml充分乳化，免疫与所用骨髓瘤细胞同源的BALB/c健康小鼠，每只腹腔注射乳化后的高纯度人神经巢蛋白，用酶联免疫吸附实验方法测定其抗血清；(2)分离脾细胞取未免疫的BALB/c健康小鼠腹腔巨噬细胞，铺植96孔培养板，将换液后的Sp2/0细胞调整为细胞悬液，分离免疫的小鼠脾细胞并制成细胞悬液；(3)细胞融合将具有较高活性Sp2/0骨髓瘤细胞与脾细胞悬液按I :10比例混合，加入PEG使细胞彼此融合，在两种细胞的混合细胞悬液中滴加培养液，以HAT选择培养基进行细胞培养；(4)筛选杂交瘤细胞待融合的细胞培养至第七天时，吸取96孔培养板的孔中出现克隆细胞簇的培养上清用酶联免疫吸附实验方法检测抗体含量，经有限稀释进行三次亚克隆筛选，依抗体的分泌情况筛选出高效价的抗体分泌孔，将孔中细胞扩大培养，然后进行 抗原特异性免疫组织化学原位测定，选高效价，高特异性的细胞株再扩大培养并冻存；(5)单克隆抗体特异性筛选选经酶联免疫吸附实验检测抗体效价大于I :10000的阳性孔的上清，与多种成人正常组织、肿瘤组织、人胚胎组织及人体外培养细胞株进行免疫组化特异性筛选。(6)单克隆抗体纯化保存选用BALB/c小鼠或其亲代小鼠，先用降植烷或液体石蜡行小鼠腹腔注射，后将杂交瘤细胞接种到小鼠腹腔中，一周后收集小鼠的腹水，使用AKTA蛋白纯化仪FPLC将小鼠IgG单克隆抗体腹水溶液在A280nm时收集，I. 44 (吸光单位)浓度为 lmg/mlo步骤(I)将高效价、高特异性抗人神经巢蛋白Iml加等量的完全福氏佐剂并经充分乳化，与所用骨髓瘤细胞同源的BALB/c健康小鼠，鼠龄在9周，每只腹腔注射0. 2ml，间隔2周注射一次；测定抗血清。步骤(2)进行完毕后采用酶联免疫吸附实验方法测定抗血清，该方法由如下操作步骤组成a、包被以50mmol/L、pH=9的碳酸盐缓冲液将步骤(I)中的高纯度人神经巢蛋白I :500稀释，包被96孔聚乙烯板，真空抽干，密封4°C保存备用。b、封闭每孔加入pH为7. 4的磷酸盐缓冲液200 U I洗涤、内含1%山羊血清；C、加样每孔加入第三次免疫后3天的小鼠外周血清50li I (1:5000稀释),每板设一正常对照、阳性对照及空白(磷酸盐缓冲液)，洗涤；d、加入酶标二抗每孔100 U 1，洗涤；e、显色每孔加入底物100 ill ;f、比色以空白调零，405nm波长测定光密度(0.D)；g、结果判断P/N=测定标本0. D均值/阴性血清0. D均值，P/N彡2. I为阳性。
步骤a中的聚乙烯板规格为200 U I/孔、真空抽干温度为4°C，洗涤采用0. 05%的Tween-20磷酸盐缓冲液洗漆3次。步骤b中的工艺参数为每孔加入pH=7. 4、含1%山羊血清磷酸盐缓冲液200 iil，温度为37°C、时间I小时，洗涤3次。步骤c中的工艺条件为每孔加入1:5000稀释后的第三次免疫后3天的小鼠外周血清50 u 1，每板设一正常对照、阳性对照及空白(磷酸盐缓冲液)，温度为37°C、时间为I小时，洗涤3次。步骤d中的工艺条件加入酶标二抗每孔100 iU，温度为37°C、时间为I小时，洗涤3次。步骤e中的工艺条件为室温、时间为10分钟，然后使用终止液终止反应，经酶标仪在波长450nm处读取光密度值。 步骤(3)中取未免疫的BALB/c健康小鼠腹腔巨噬细胞，铺植96孔培养板，将换液后15小时的Sp2/0细胞调整为9X 105/ml细胞悬液，分离免疫的小鼠脾细胞。步骤(4)中具有高活性的Sp2/0骨髓瘤细胞与脾细胞的比值按1:10的比例混合，加入PEG使细胞彼此融合，在两种细胞的混合细胞悬液中，第I分钟滴加4. 5ml培养液；间隔2分钟滴加5ml培养液，然后加培养液50ml，以HAT选择培养基按36%的孔为I个细胞/孔进行细胞培养。步骤(5)中是将细胞培养至覆盖10%孔底时，吸取培养上清用酶联免疫吸附实验方法检测抗体含量，依抗体的分泌情况筛选出高效价的抗体分泌孔，将孔中细胞再行克隆化，然后进行抗原特异的免疫组织化学测定，选高分泌特异性细胞株扩大培养或冻存。步骤(6)中选用的成人正常组织和人胚胎组织包括主要脏器和神经组织，肿瘤组织包括常见和多发肿瘤组织，与以上各种组织和细胞的阳性表达低于5%，与98%以上的从胚胎中分离的神经干细胞呈阳性表达。步骤(6)中选用BALB/c小鼠或其亲代小鼠，先用降植烷或液体石蜡行小鼠腹腔注射，一周后将5X IO5杂交瘤细胞接种到小鼠腹腔中去，在接种一周后有明显的腹水产生，每只小鼠可收集15ml的腹水，使用AKTA蛋白纯化仪FPLC将小鼠IgG单克隆抗体腹水溶液在A280nm时收集，吸光单位=1. 44时浓度为lmg/ml。实施例2 :本发明所述单抗各项指标检测将实施例I筛选的杂交瘤细胞株分泌的单抗进行序列分析，其重链可变区如下QLQESGGGAVQPGRSLRLSCAASGFTFSTNLMNWVRQAPGKGLEWVIAISTYGYSYKYADAAVKGRFTISRDNSKNTIYLQMNSLRAEDTAVYYCARGDYADEYMLDLWGNGTVTVSSL (如 SEQ ID No. I 所示)其轻链可变区如下DLNISQSPGSISVSIGEDATLSCRASQSISSYIAWYQQKPGQAPRLLIYSASTKVTGVPERFSGSASGTDFTLTITRLQPVDFAAYPCQQTSQFPPTFGYGTKVSIKRS (如 SEQ ID No. 2 所示)。实施例3 :对比试验参照现有技术申请号为200610012998. 2的说明书制备抗人神经巢蛋白单克隆抗体作为对照组，与本发明实施例I制备的抗人神经巢蛋白单克隆抗体进行比较，结果如下。对实施例I各个步骤的酶联免疫吸附实验效价进行检测，其各项指标如下I、本发明即所述单抗实施例I制备的阳性克隆，酶联免疫吸附实验效价为I :64000 ;对照组酶联免疫吸附实验效价为I :50000 ；2、用免疫组织化学方法进行阳性克隆孔特异性表达实验与人神经干细胞呈阳性表达，与其它组织细胞呈阴性表达，具体如下人体外原代培养细胞
权利要求
1.抗人神经巢蛋白单克隆抗体，其特征在于，其重链可变区氨基酸序列如SEQID NO. I所示，其轻链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO. 2所示；或其重链可变区由SEQ ID NO. I所示的氨基酸序列经过取代、缺失、或添加一个或几个氨基酸衍生的与SEQ ID NO. I的氨基酸序列至少有95%的一致性，轻链可变区由SEQ ID NO. 2所示的氨基酸序列经过取代、缺失、或添加一个或几个氨基酸衍生的与SEQ ID NO. 2的氨基酸序列至少有95%的一致性且所述单克隆抗体具有特异性结合Nestin的活性。
2.根据权利要求I所述的单克隆抗体，其特征在于，所述单克隆抗体包括单链抗体、双链抗体、嵌合抗体、人源化抗体、以及上述抗体的衍生物、功能等同物和同源物，也包括抗体片段和含有抗原结合结构域的任何多肽。
3.权利要求I至2任一项所述的单克隆抗体在制备用于鉴定神经干细胞的试剂中的用途。
4.一种试剂，包含权利要求I至2任一项所述的单克隆抗体。
5.一种试剂盒，包含权利要求I至2任一项所述的单克隆抗体。
6.一种芯片，包含权利要求I至2任一项所述的单克隆抗体。
全文摘要
本发明属于生物工程技术领域，公开了一种高效价、高特异性抗人神经巢蛋白单克隆抗体及其应用。本发明所述高效价、高特异性的单克隆抗体重链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，其轻链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，所述单抗效价及特异性高。本发明所述单克隆抗体的均一性和生物活性单一性使抗原抗体反应结果便于质量控制，利于标准化和规范化，可直接应用于临床检测和基础研究，在生物学和医学研究领域中具有极高的应用价值。
文档编号G01N33/577GK102827279SQ20121035498
公开日2012年12月19日 申请日期2012年9月21日 优先权日2012年9月21日
发明者李彬 申请人:李彬