专利名称：一种用模式生物斑马鱼研究黄酮化合物Ⅱ相代谢的新方法
技术领域：
本发明涉及一类化合物的代谢研究方法，具体涉及一种用模式生物斑马鱼研究黄酮化合物II相代谢的新方法 。
背景技术：
黄酮类化合物(flavonoids)是具有2_苯基色原酮(flavone)结构的化合物。黄酮类化合物在植物体中通常与糖结合成苷类或游离态(苷元)的形式存在。绝大多数植物体内都含有黄酮类化合物，具有重要的生物活性，如保护心血管系统、抗菌及抗病毒、抗肿瘤活性、抗炎、抗氧化及保肝等活性，但黄酮类化合物生物利用度低，在体内难以达到起效浓度。黄酮在体内的葡萄糖醛酸化和硫酸化结合反应的II相代谢是黄酮生物利用度低的一个重要原因。药物代谢通常分为I相代谢(氧化、还原、水解等)和II相代谢(结合反应)，黄酮化合物特别是黄酮苷元的代谢以II相代谢为主，研究方法亦采用常见的药物代谢研究方法体内实验法和体外实验法。体内实验法动物给药后，在一定时间内将动物处死，取消化道各部分内容物进行分析，并检查血液、尿、粪便、胆汁，检测代谢物的结构变化，研究药物的代谢转化，并推断其在消化道内的代谢过程。体内代谢试验能客观的反应药物在体内的转化，但一般药物用量较大，不利于少量药物的快速代谢研究；有些体内成分含量低微，即使采用现代分析手段有时也难以满足体内复杂体系的检测需求，而加大药量或进一步富集、纯化样本等手段对结果的改善也是有限的；体内代谢劳动强度相对较大，常需多人合作完成。体外实验法体外肝细胞、肝或肠微粒体及葡萄糖醛酸结合酶、硫酸转移酶代谢。肝细胞代谢取肝匀浆、肝或肠细胞微粒体、或葡萄糖醛酸结合酶、硫酸转移酶与药物共孵育，检查原型成分及其代谢物的种类和含量。体外实验法虽然较有效的模拟了药物在体内代谢的不同环节，有益于富增、制备代谢产物，但脱离了完整的代谢体系对药物的作用，难以体现在体代谢的综合结果；体外实验条件要求相对较高，需保证肝细胞、微粒体及酶的活性，一般实验室难以进行。因此，建立一种既能体现在体代谢的综合效应，又能实现条件简单，低劳动强度，化合物用量少的高通量代谢研究方法具有重要意义。斑马鱼是一种极好的模式生物，是取代青蛙、果蝇、小白鼠等作为研究对象的优良试验模式鱼。斑马鱼喂养和维持的费用更便宜，所需空间场地不大，易于室内大规模繁殖。成体鱼长3 4cm，养殖成本仅为养小鼠的0.斑马鱼同人类基因的相似度与小鼠相当，且在蛋白质水平上，其关键部位的同源性几乎是100%，所以可用斑马鱼模拟人类疾病[P. Goldsmith, Curr Opin Pharmacol, 4, 504-12 (2004)]。目前，人们已成功的用斑马鱼建立许多人类疾病模型，如神经系统、循环系统、听觉、视觉、癌症等方面的疾病[S. Sumanasand S.Lin，DDT :TARGETS，3，89-96 (2004) ]。如中国专利 200810019040. 5 公开了一种用斑马鱼研究药物毒性的方法；专利200780051025. 2公开了一种通过干细胞营养进行的器官的形成和以及酒精损伤器官的再生方法，200310108710. 8公开了利用斑马鱼基因治疗截瘫等疾病；我们在201010258459. 3公开了利用斑马鱼研究丹参中丹参酮IIA、隐丹参酮和丹参酮I相代谢的新方法，发现丹参酮IIA、隐丹参酮和丹参酮I的羟基化和脱氢反应的I相代谢产物，此方法建立系根据斑马鱼具有药物代谢的细胞色素P450s相关酶系目前已克隆到的斑马鱼P450s基因主要包括CyplA、Cyp2K6、Cyp3a65和Cyp3Cl、CypllaUCyp 19, Cyp26Al、Cyp26Bl和Cyp26Dl几个家族的成员，它们与人类相应基因的同源性约为40% 73% [P. Collodi, C. L. Miranda, X. Zhao, D. R. Buhler, D. ff. Barnes. Xenobiotica,24 (6), 487-493 (1994)] o近年研究表明，斑马鱼尚具有II相代谢酶[Y. Morcillo,G. Janer，S. C. M. Oj Hara, D. R. Livingstone, C. Porte. Environmental Toxicology and Chemistry,23 (4), 990-996 (2004) ；D. V. Almeida, B. F. Nornberg, L. A. Geracitano, D. M. Barros,J. M. Monserrat, L. F. Marins. Fish Physiol Biochem. 36 (3) :347-53 (2010)],这为斑马鱼用于药物的II相代谢提供了依据，国内在这方面的研究尚属空白。

发明内容
发明目的本发明所要解决的技术问题是克服现有技术的不足，提供一种操作方 便、成本低、化合物用量少、劳动强度低，且仅需在一般实验室就可进行的快速模式生物斑马鱼研究药物如黄酮化合物II相代谢的新方法。技术方案为了实现以上目的，本发明采取的技术方案为—种用模式生物斑马鱼研究药物如黄酮化合物II相代谢的新方法，它包括以下步骤(I)取斑马鱼的成体鱼放入盛有水的容器里，分为空白溶剂组、空白鱼组、空白黄酮化合物组和黄酮化合物鱼组，空白鱼组和黄酮化合物鱼组斑马鱼数量相等，将受试黄酮化合物配成所需浓度，加入到黄酮化合物鱼组的水溶液中，空白鱼组加入等量的溶媒，空白溶剂组只加等量溶媒不放斑马鱼、空白黄酮化合物组加溶媒溶解的等量黄酮化合物不放斑马鱼，在黄酮化合物鱼组的斑马鱼暴露于药液后Oh 48h，在不同时间点取鱼药液，于_70°C冰箱放置；在末次取鱼药液24h或48h时间点将鱼取出，用纯净水迅速洗涤2 3次，处死，去除鱼鳍和鱼磷，称重，于-70°C冰箱放置，空白溶剂组、空白鱼组和空白黄酮化合物组于0h、24h或48h时同法取样，备用；(2)取步骤⑴得到的各时间点鱼药液冷冻干燥或氮气、空气吹干，残渣加适量50% -100%甲醇或乙腈溶解，过0. 45 y m或0. 22 u m滤膜或15000转/min离心10 20min,取滤液或上清液进行高效液相色谱HPLC分析或高效液相色谱与质谱联用LC-MS分析；取24h或48h时间点斑马鱼鱼体剪碎，称重，匀浆，匀浆液加甲醇或乙腈除蛋白，3000 4000转/min离心10 20min取上清；或匀浆液离心后直接用有机溶剂萃取药物成分，离心取有机溶剂萃取液，合并萃取液，将除蛋白离心上清液或萃取液用氮气或空气吹干，残渣加50% 100%甲醇溶解，过0. 45 u m或0. 22 u m滤膜或约15000转/min离心10 20min,,滤液或上清液进行HPLC分析或LC-MS分析。作为优选方案，以上所述的用模式生物斑马鱼研究药物代谢的新方法，其中步骤
(I)中的空白溶剂组、空白鱼组、空白黄酮化合物组和黄酮化合物鱼组均平行设3个组，保证实验的科学性。作为优选方案，以上所述的用模式生物斑马鱼研究药物代谢的新方法，步骤(I)中药物鱼组的斑马鱼暴露于药液后0h，2h，4h，6h，8h，12h，18h，24h时间点取鱼药液，必要时可将取样时间延长至48h。采用连续时间间隔点取样可以充分明确药物的代谢方式和代谢特点，为指导药物的临床用药和药物剂型的选择提供科学依据。作为优选方案，其中步骤(I)所述的溶媒为水或者是含有0 1%二甲基亚砜助溶剂的水溶液。对于水溶性较差的药物，采用二甲基亚砜助溶，可以有效提高药物的水溶性，使药物均匀分散于水溶中。作为优选方案，以上所述的用模式生物斑马鱼研究黄酮化合物代谢的新方法，步骤(2)根据被分析药物的性质，根据相似相溶原则选择溶剂溶解或萃取受试药物，如药液残渣加50% -100%甲醇或乙腈溶解，斑马鱼鱼体剪碎，称重，匀浆，匀浆液加甲醇或乙腈除蛋白，或匀浆液离心后直接用溶剂如乙酸乙酯、氯仿或二氯甲烷萃取药物成分萃取药物成分，离心取有机溶剂层萃取液，合并萃取液，氮气或空气吹干，残渣加50 % -100 %甲醇溶 解。本发明考察了将药液减压回收至干、直接冷冻干燥及氮气或空气吹干三种方法， 结果表明将药液直接冻干或氮气、空气吹干可最大限度的减少样品处理过程的损失及误差，实验结果更准确，因此步骤(2)优选将各时间点鱼药液冷冻干燥或氮气、空气吹干，50% -100%甲醇溶解干燥残渣，然后过滤或离心处理后上清液进行高效液相色谱HPLC分析或高效液相色谱与质谱联用LC-MS分析。本发明所述的用模式生物斑马鱼研究黄酮化合物II相代谢的新方法，其中步骤(2)采用Agilent 1100型系列高效液相色谱仪或采用灵敏度高的Waters Alliance2695-ZQ 2000高效液相色谱-质谱联用仪来测定斑马鱼水溶液中黄酮化合物及代谢物和斑马鱼体内组织中黄酮化合物及代谢物的含量和结构的变化情况。作为优选方案，本发明所述的用模式生物斑马鱼研究黄酮化合物II相代谢的新方法，筛选的受试药物可为黄酮苷元、黄酮苷及其它能发生II相代谢反应的化合物等。如5-羟基黄酮、7-羟基黄酮或白杨素。5_ 轻基黄丽(5-hydroxyf Iavone)和 7_ 轻基黄丽(7-hydroxyf Iavone)均为重要的单羟基黄酮化合物，5-羟基黄酮具有抗氧化性能、对光致辐射具有稳定性、兴奋状态质子转移反应，以及抗冠脉痉挛、冠脉缺血危象等药理作用；一些7-位带有羟基的黄酮类化合物具有扩张血管、增加心脏冠脉流量、增加脑血流量、抗血小板凝集及抗炎作用；白杨素(Chrysin)为5，7-双羟基黄酮，具有广泛的药理活性，如抗肿瘤、放疗增敏作用、抑制芳香酶活性、抗炎、抗氧化、防治心脑血管疾病。因此研究5-羟基黄酮、7-羟基黄酮或白杨素的代谢情况，可以有效了解黄酮类化合物的体内代谢情况。与小鼠、大鼠、犬等哺乳动物不同，斑马鱼的体积较小，口服或注射给药方式很困难，因此，步骤(I)中本发明将受试药物溶解于斑马鱼所生活的水中，斑马鱼会自主连续的从溶液中吸收受试药物并在体内进行代谢，药物的代谢物也会随着斑马鱼的排泄物被连续的排到水中，这样就可通过分析溶液中药液的成分变化来掌握药物的部分代谢信息；斑马鱼成体鱼长约3 4cm，其体内血液量极微量，难以实现采血，通过取血来分析血样的可行性存在问题，而对整体鱼内成分进行分析也能掌握药物在鱼体内的变化情况，这样，就能通过定时取样分析药物在斑马鱼体内及体外的变化规律来较为全面的探索斑马鱼对药物的代谢情况，此法简单可行。
有益效果本发明提供的用模式生物斑马鱼研究黄酮类化合物代谢的新方法和现有技术相比具有以下优点本发明提供的用模式生物斑马鱼研究黄酮类化合物II相代谢的新方法，选用斑马鱼作为药物代谢研究的对象，通过优化的实验分组方法，保证实验结果的准确性，尤其是对药物给药方式的优选、药物经斑马鱼代谢后提取方法和分析方法的优选，整个实验方法可操作性强，能客观的反应药物在体内的真实代谢情况，实验结果准确度高，能克服一般体外代谢实验条件苛刻，且难以体现在体代谢综合结果的缺点，且能克服一般哺乳动物体内代谢实验所用药量大、劳动强度大的缺点，且实验方法可重复性强，尤其是所需受试药物量少，成本低，劳动强度低，应用范围广泛，且可成批量进行实验研究，工作效率高。


图I为5-羟基黄酮药液经斑马鱼作用24h时的药液与鱼体总离子流图及5-羟基黄酮与其代谢产物的提取离子流图。图2为5-羟基黄酮的质谱图。图3为5-羟基黄酮葡萄糖醛酸结合物I的质谱图。图4为5-羟基黄酮葡萄糖醛酸结合物2的质谱图。图5为5-羟基黄酮硫酸结合物的质谱图。图6为7-羟基黄酮药液经斑马鱼作用24h时的药液与鱼体总离子流图及7_羟基黄酮与其代谢产物的提取离子流图。图7为7-羟基黄酮的质谱图。图8为7-羟基黄酮葡萄糖醛酸结合物的质谱图。图9为7-羟基黄酮硫酸结合物的质谱图。图10为白杨素药液经斑马鱼作用24h时的药液与鱼体总离子流图及白杨素与其代谢产物的提取离子流图。图11为白杨素的质谱图。图12为白杨素葡萄糖醛酸结合物I的质谱图。图13为白杨素葡萄糖醛酸结合物2的质谱图。图14为白杨素硫酸结合物的质谱图。
具体实施例方式根据下述实施例，可以更好地理解本发明。然而，本领域的技术人员容易理解，实施例所描述的具体的物料配比、工艺条件及其结果仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本发明。实施例一用模式生物斑马鱼研究5-羟基黄酮的代谢I.材料与仪器受试药物5_羟基黄酮配制方法称取相当于5-轻基黄酮I 2mg溶于Iml 二甲亚砜(DMSO)中，加250ml乐百氏纯净水，摇匀。动物斑马鱼，由南京大学模式生物研究所提供。
试剂乙腈、甲酸为色谱纯(德国，Merck公司)，二甲基亚砜(DMS0，国药集团化学试剂有限公司)，超纯水乐百氏纯净水。仪器Agilent 1100型系列高效液相色谱仪，包括G1311A四元梯度泵、G1313A自动进样器、G1316A柱温箱、G1315B DAD检测器；Chemstation 6. 01色谱工作站(美国，Agilent公司)。Waters Alliance 2695-ZQ 2000液相色谱-质谱联用仪,包括双高压泵，自动进样器，柱温箱，电喷雾离子化接口，2695型液相色谱仪，Masslynx 4. 0色谱工作站(美国，Waters 公司)。METTLER TOLEDO ABl35-S 分析天平(瑞士，MEITLERT0LED0 公司)，KQ3200DE型数控超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)。LABC0NC0冷冻干燥机(美国，LABC0NC0公司)，TGL-16G台式离心机(上海安亭科学仪器厂)。2.实验方法 2. I给药与取样方法取斑马鱼,分别置于含有30mL溶液的棕色瓶中，平均分成2组,每组5条鱼。其中I组为0. 4% DMSO纯净水(空白鱼组)，另一组为5-羟基黄酮0. 4% DMSO纯净水溶液(药物鱼组)。同时设空白溶剂组(0. 4% DMSO纯净水)和空白药物组(0. 4% DMSO 5-羟基黄酮纯净水溶液)。药物鱼组分别于斑马鱼暴露药液后0h，2h，4h，6h，8h，12h，18h，24h时间点每条鱼取药液0. 4ml，各时间点药液分别混合，于-70°C冰箱放置。于术次取样时间点24h同时将鱼取出，用纯净水迅速洗涤3次，处死，去除鱼鳍和鱼磷，称重，于_70°C冰箱放置(平行3次实验)。空白溶剂组，空白鱼组和空白药物组于0h，24h时同法取样。2. 2样品处理药液处理将不同时间点鱼药液各2mL，冷冻干燥，残渣加0. 5mL90%甲醇溶解，过0. 22um滤膜，滤液进样20 ii L进行HPLC-MS分析。斑马鱼体处理取24h时斑马鱼平行组间混合，剪碎,称取Ig,加5mL生理盐水匀衆,3500r/min离心IOmin,上清液加4倍量甲醇润旋混勻除蛋白，3500r/min离心IOmin,上清液氮气吹干，残渣加lmL90%甲醇溶解制成Ig鱼/mL的溶液，过0. 22 y m滤膜，滤液进样20 u L进行HPLC-MS分析。2. 3分析条件液相条件AgilentC18 柱(5 u m, 150mmX4. 6mm)和 C18 预柱(4. 6X12. 5mm ID,5um);柱温32°C;流动相A为乐百氏纯净水(与质谱联用时改为0. 05%甲酸水)，B为乙腈(与质谱联用时改为0. 05%甲酸乙腈)，A十B = 100%，采用梯度洗脱0 5min，90%B，5 7min，90 80% B，7 20min，80 75% B，20 35min，75 25% B，35 37min，25 90% B，37 40min，90% B ;流速1. OmL/min ;全波长扫描检测；记录时间40min ;进样量为20 u L0 质谱条件毛细管电压2. 50kV,锥孔电压35V，干燥气流速320L/h，离子源温度120°C，辅助气温度310°C ;离子检测方式全扫描检测(SCAN)，离子极性正离子(positive)和负离子(positive)同时检测,提取离子流(TIC) [M-H]-, [M+H] +和[M+Na]+,离子化方式气动辅助电喷雾离子化(ESI)，扫描范围100-800m/z。3.实验结果采用HPLC-MS法正、负离子模式同时检测5_羟基黄酮经斑马鱼作用后的代谢产物，其中正离子模式灵敏。如图I所示，发现24h内5-羟基黄酮斑马鱼药液或斑马鱼体内中的5-羟基黄酮原形成分及5-羟基黄酮葡萄糖醛酸化、硫酸化的II相代谢产物(具体实验结果见表I)。已有大鼠口服5-羟基黄酮代谢研究文献表明，5-羟基黄酮在动物体内的代谢途径主要为葡萄糖醛酸化，大鼠体内检测到5-羟基黄酮葡萄糖醛结合物，这与斑马鱼作用的5-羟基黄酮葡萄糖醛结合物具一致性[CS Shia, SY Tsai, SC Kuo, YC Hou and PDChao. J Agric Food Chem，2009，57 (I) :83-89 ;韦英杰，姜金生，谭晓斌，陈斌，刘炜，胡春萍，马世平，贾晓斌.中国现代应用药学，2012，29 (I) :60-63.]，此外本研究还在负离子模式下检测到5-羟基黄酮硫酸结合物，表明正、负离子模式同时检测方式可较全面的检测代谢产物。采用本发明提供的用模式生物斑马鱼研究5-羟基黄酮代谢实验结果准确可靠，实验方法可行。表15-羟基黄酮经斑马鱼作用后的代谢产物鉴定
权利要求
1.一种用模式生物斑马鱼研究黄酮化合物II相代谢的新方法，其特征在于，包括以下步骤 (1)取斑马鱼的成体鱼放入盛有水的容器里，分为空白溶剂组、空白鱼组、空白黄酮化合物组和黄酮化合物鱼组，空白鱼组和黄酮化合物鱼组斑马鱼数量相等，将受试黄酮化合物配成所需浓度，加入到黄酮化合物鱼组的水溶液中，空白鱼组加入等量的溶媒，空白溶剂组只加等量溶媒不放斑马鱼、空白黄酮化合物组加溶媒溶解的等量黄酮化合物不放斑马鱼，在黄酮化合物鱼组的斑马鱼暴露于药液后Oh 48h，在不同时间点取鱼药液，于-70°c冰箱放置；在末次取鱼药液24h或48h时间点将鱼取出，用纯净水迅速洗涤2 3次，处死，去除鱼鳍和鱼磷，称重，于-70°C冰箱放置，空白溶剂组、空白鱼组和空白黄酮化合物组于0h、24h或48h时同法取样，备用； (2)取步骤⑴得到的各时间点鱼药液冷冻干燥或氮气、空气吹干，残渣加适量50% -100%甲醇或こ腈溶解，过O. 45 μ m或O. 22 μ m滤膜或15000转/min离心10 20min,取滤液或上清液进行高效液相色谱HPLC分析或高效液相色谱与质谱联用LC-MS分析；取24h或48h时间点斑马鱼鱼体剪碎，称重，匀浆，匀浆液加甲醇或こ腈除蛋白，3000 4000转/min离心10 20min取上清；或匀浆液离心后直接用有机溶剂萃取药物成分，离心取有机溶剂萃取液，合并萃取液，将除蛋白离心上清液或萃取液用氮气或空气吹干，残渣加50 % 100 %甲醇溶解，过O. 45 μ m或O. 22 μ m滤膜或约15000转/min离心10 20min,滤液或上清液进行HPLC分析或HPLC-MS分析。
2.根据权利要求I所述的用模式生物斑马鱼研究黄酮化合物代谢的新方法，其特征在于， 所述的高效液相色谱与质谱联用HPLC-MS分析条件为 液相条件规格为5 μ m, 150mmX4. 6mm的Agilent C18柱和规格为4· 6 X 12. 5mm ID,5μπι的C18预柱；柱温32°C;流动相A为O 1.0%甲酸水，B为O 1.0%甲酸こ腈，A十B = 100%，采用梯度洗脱0 5min，90% B，5 7min，90 80% B，7 20min，80 75%B, 20 35min，75 25 % B, 35 37min，25 90 % B, 37 40min，90 % B ；流速I. OmL/min ;全波长扫描检测；记录时间40min ;进样量为20 μ L ; 质谱条件毛细管电压2. 50kV，锥孔电压35V，干燥气流速320L/h，离子源温度120°C，辅助气温度310°C ;离子检测方式全扫描检測，离子极性正离子和负离子同时检测，离子化方式气动辅助电喷雾离子化，扫描范围100-800m/z。
3.根据权利要求I所述的用模式生物斑马鱼研究黄酮化合物代谢的新方法，其特征在于，步骤(I)中黄酮化合物鱼组的斑马鱼暴露于药液后011，211，411，611，811，1211，1811，2411或48h时间点取鱼药液，在末次取药液时间点24h或48h时同时取鱼体。
4.根据权利要求I所述的用模式生物斑马鱼研究黄酮化合物II相代谢的新方法，其特征 在于，步骤(I)所述的溶媒为水或者是含有O 1%ニ甲基亚砜助溶剂的水溶液。
5.根据权利要求I所述的用模式生物斑马鱼研究黄酮化合物II相代谢的新方法，其特征在于，步骤(2)所述的萃取溶剂为こ酸こ酷、氯仿或ニ氯甲烷。
6.根据权利要求I所述的用模式生物斑马鱼研究黄酮化合物II相代谢的新方法，其特征在于，所述的黄酮化合物为5-轻基黄酮、7-轻基黄酮或白杨素。
全文摘要
本发明公开了用模式生物斑马鱼研究黄酮化合物II相代谢的新方法，该方法通过选用斑马鱼作为药物代谢研究的对象，通过优化的实验分组方法进行实验分组设计，采用优选的药物给药方式进行给药，并采用优选的方法提取经斑马鱼代谢后的黄酮化合物代谢物，尤其采用优选的分析方法对代谢物进行分析，整个实验方法可操作性强，能客观的反应药物特别是黄酮化合物在体内的真实II相代谢情况，实验结果准确度高，能克服一般体外代谢实验难以体现在体代谢综合结果的缺点和一般体内代谢实验所用药量大、劳动强度高的缺点，实验方法可重复性强，所需受试药物量少，成本低，劳动强度低，应用范围广泛，且可成批量进行实验研究，工作效率高。
文档编号G01N30/88GK102707004SQ20121018719
公开日2012年10月3日 申请日期2012年6月8日 优先权日2012年6月8日
发明者孙娥, 李萍, 王长梅, 贾晓斌, 陈斌, 韦英杰, 齐炼文 申请人:中国药科大学, 江苏省中医药研究院