专利名称：一种用于肺癌早期诊断的蛋白质指纹质谱模型的制作方法
技术领域：
本发明属于医学诊断技术领域，是一种可用于诊断早期肺癌的模型，为肺癌的早期诊断提供实验基础。
背景技术：
肺癌发生于支气管粘膜上皮，亦称支气管癌。近50年来许多国家都报道肺癌的发病率明显增高，在男性癌瘤病人中，肺癌已居首位，女性发病率也迅速增高，占女性常见恶性肿瘤的第2位或第3位。肺癌起源于支气管粘膜上皮，癌肿可向支气管腔内或(和)邻近的肺组织生长，也可通过淋巴、血行或经支气管转移扩散。癌肿的生长速度和转移扩散的情况与癌肿的组织学类型、分化程度等生物学特性有一定关系。Hutchens等提出的表面加强激光解析电极一飞行时间质谱技术(SELDI-T0F-MS) 是最近几年发展起来的一种新的蛋白质组学研究方法，它能够将蛋白质保留在特殊的固相层析表面，经离子化后用飞行时间质谱仪对其进行检测，直接从未处理的生物样品获取蛋白质组图谱。基于此技术开发的蛋白质芯片可以非特异性或特异性地结合各种蛋白质，并在质谱仪中受到激光轰击，各种结合蛋白质会被激发而形成气化离子，根据不同电离子在电场中飞行的时间长短，形成强弱不同的质谱峰，进而形成图谱用于分析。近年来该技术在差异表达蛋白质组、蛋白质相互作用及疾病检测方面得到了广泛的应用，但在肺癌早期诊断方面目前尚未有较好的诊断模型，本发明利用该技术，从血清角度建立了该诊断模型。

发明内容
本发明利用Bio-Rad公司的蛋白质飞行时间质谱仪系统，检测早期肺癌和健康人血清的蛋白质谱，利用软件分析早期肺癌与正常人血清对照蛋白质组的不同之处，发现新的肺癌相关性蛋白质，制作成指纹质谱模型，用于诊断早期肺癌。本发明将早期肺癌和健康人血清分别利用Bio-Rad公司蛋白质芯片检测，得到数据利用该公司的Biosystems软件的Biomarker wizard功能，分别对肺癌和正常组样品的蛋白质波谱进行比较，得出特异的蛋白质图谱，再根据统计分析发现肺癌与正常组有统计学显著差异(P< 10-e5)的蛋白质峰，并使用MathWorks公司的Matlab 2009a软件对肺癌与对照组差异显著特异蛋白质进行分析，选取2个质谱峰建立了肺癌与正常人蛋白质指纹图谱模型。利用该指纹质谱模型，将受检人血清中相应的蛋白质的质荷比与本发明指纹图谱模型逐一进行比对，可为早期肺癌诊断提供辅助指导。血清模型的检测方法如下1.血清标本制备早期肺癌患者术前血和正常对照外周静脉血采集后立即放入4°C冰箱保存，备用。 检测时，融解冰冻血清，离心，取血清样品加缓冲液，振摇。2.平衡芯片
将醋酸钠溶液加入芯片的加样孔中，平衡芯片2次，每次5min。3.血清样品稀释取血清样品，加入尿素，振荡30min，加入醋酸钠溶液中，混勻稀释。4.芯片上样取稀释后的血清样品加入平衡好的芯片加样孔，置芯片于摇床孵育90min。5.样品洗脱取醋酸钠溶液加入芯片加样孔，洗脱2次，每次5min。取去离子水冲洗芯片。6.芯片和蛋白质结合反应取能量吸收剂加入芯片加样孔，待自然挥发后再重复加吸收剂一次。7.芯片检测将芯片置于蛋白芯片阅读机中，用加有标准蛋白质的芯片校正仪器。设置芯片阅读仪参数，用CipheEgen Pmteinchip 3. 1. 1软件收集数据。其中纵坐标为蛋白质相对含量，横坐标为蛋白质质荷比(M/Z)。经过临床试用，该决策树模型可以较好地区分早期肺癌和正常对照，该决策树正确率为71 %。


图1早期肺癌与正常人鉴别的蛋白质指纹质谱诊断模型图中m/z表示特异蛋白的质荷比，C代表早期肺癌病人，NC代表正常人。
具体实施例方式1.材料1. 1检测血清取受试者静脉血5ml，在4度冰箱中静置2小时后离心(4000rpm，5min).取血清， 置低温冰箱(负80度)或液氮保存，备用。1. 2所需主要试剂与仪器乙酸钠、乙腈、三氟乙酸、白芥子酸(SPA)均购自上海化学试剂公司。CMW蛋白芯片和蛋白质芯片阅读机(PBS II型)购自美国Bio-Rad公司。2.方法2. 1平衡芯片取200ul 50mmol/L pH 4. 0的醋酸钠(NaAc)溶液加入芯片的加样孔中，平衡芯片2次，每次5min。2. 2血清样品稀释取6ul 血清样品，加入 12ul 9mmol/L 尿素，振荡 30min，加入 222ul 50mmol/L pH 为3. 0的NaAc溶液中，混勻稀释。2. 3.芯片上样取稀释后的血清样品200ul/孔加入平衡好的芯片加样孔，置芯片于摇床孵育 90mino2. 4.样品洗脱取50mmol/L pH 4. 0的NaAc溶液200ul/孔加入芯片加样孔，洗脱2次，每次5min。 取300ul/孔的去离子水冲洗芯片。
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2.5.芯片和蛋白质结合反应取能量吸收剂SPA (含饱和白芥子酸溶液与质量分数50%乙腈和0. 15%三氟乙酸)0. 5ul/孔加入芯片加样孔，待自然挥发后再重复加SPA —次。2. 6.芯片检测将芯片置于蛋白芯片阅读机中，用加有AU-in_0ne标准蛋白质的NP20芯片校正仪器至0. 1 %范围内。芯片阅读仪参数设置激光强度150，检测灵敏度7，优化范围1984. 2 9921u，最高分子量49605u，芯片上的每个点采集130次。用CipheEgenProteinchip 3. 1. 1 软件收集数据。其中纵坐标为蛋白质相对含量，横坐标为蛋白质质荷比(M/Z)。将分析得到的受检者的血清蛋白波谱根据指纹质谱模型(图1)中特异蛋白质质荷比进行比较，以判断受检者是否患有早期肺癌(见实施实例)。实验实例取受检者血清，经检验得到其血清蛋白图谱，按图1肺癌与正常组鉴别的蛋白质指纹质谱模型，观察蛋白质波峰，先看质荷比M/Z为5221的蛋白质，其波峰强度系数A是否 >3. 33,是则为对照组，否则再看M/Z为7832的蛋白质，其波峰强度系数A是否> 5. 67，是则为对照组，否则是病例组。以上是对本发明的描述而非限定，基于本发明思想的其它实施方式，均在本发明的保护范围之中。
权利要求
1.用于肺癌早期诊断的蛋白质指纹质谱模型，其特征在于由蛋白质芯片飞行时间质谱仪系统检测的血清蛋白质图谱经过软件统计分析得到肺癌患者多个特异蛋白质的质荷比 (m/z)及其蛋白质波峰强度系数A绘制而成，所说的特异蛋白质的质荷比(m/z)分别为m/ z5221, m/z7832。
全文摘要
本发明涉及医学诊断技术领域，是一种可以用于早期肺癌诊断的蛋白质指纹质谱模型。本发明用蛋白质芯片飞行时间质谱系统，检测正常人及早期肺癌病人的外周血清样品，找出与肺癌患者差异显著的特异蛋白质峰，根据各蛋白质峰的质荷比(m/z)，采用决策树算法，建立一个决策树的蛋白质指纹图谱模型。只要将检测人血清中相应的蛋白质的m/z与本发明的模型进行分析，就可以初步用于肺癌诊断。其预测准确率为71％。
文档编号G01N33/68GK102200537SQ20101022708
公开日2011年9月28日 申请日期2010年7月14日 优先权日2010年7月14日
发明者曾华宗 申请人:上海聚类生物科技有限公司