专利名称：一种乳糖酶膜的制备方法
技术领域：
本发明涉及生物传感器领域，更具体的说，是涉及一种乳糖酶膜的制备 方法。
背景技术：
乳糖含量的测定方法主要有还原糖测定法(碘量法)、旋光测定法、 近红外光语法、核磁共振法、和高效液相色镨、超声波法等，这些方法耗 时、繁瑣，检测起来既费时又费力。因此，现在普遍看好酶的测定法即乳糖 生物传感器法，这种方法具有灵敏、快速、简便、特异性强等特点，而且对 样品几乎不用任何预处理。
乳糖传感器的研制为乳糖的现场快速检测提供有利的手段。目前已经出 现了各种各样的生物传感器，其中电流型的酶传感器依然是研究最多，也是 商品化最为成功的传感器类型，而这类传感器的核'd'元件就是固定化酶膜。 酶膜性能的优劣主要决定于固定化材料的选取和固定方法的选择。
目前在电极上固定化酶的方法主要有吸附法、共价结合法、交联法、聚 合物包埋法、组合法等。
为实现乳糖测定，国外已经发明了一些酶电极，这些酶电极主要是通过 固定化酶的4支术。通过将两种酶^-GAL和G0D，固定在Clark-型氧电极 上，和商业化的氢氧型传感器或白金(Pt)电极上，制成乳糖生物传感器。 在这类传感器上直接通过测定过氧化物来计量电化学反应。另外一些电极中 酶作用在电极上和一个介导物，例如苯醌结合，这是另一种类型的解决方案。 酶也可以和介导物一起固定在电极上，例如Tetrathiafulvalinium、 Tetracyanoquinodimethanide ( TCNQ )和过氧化物酶(G0D)。介导物增力口 了酶促反应速率，从而放大了电信号(FerdaGurtas, 1997)。 Jan Tka， et al. (2000)采用 一种安培计传感器研制出乳糖生物传感器，适合于新鲜原料乳中 乳糖的测定。该传感器采用改良玻璃碳电极(GC)，在其上面安排三种酶 "-GAL, G0D， 和山葵过氧化物酶(POD)，进行固定化。上述方法中是将酶
直接固定到电极上，必须使用相匹配的电极，从而不具有普遍适用性。

发明内容
本发明是为了克服现有技术中将酶直接固定到电极上，从而不具有普遍 适用性等不足之处，提供了一种可以和不同氧化还原电极配合使用，并适合 于乳糖在线监控的 一个核心部件-核-微孔固定化酶膜。
本发明通过下述技术方案实现
一种乳糖酶膜的制备方法，其特征是，包括下述步骤 (1)称取(3-环糊精溶解于含有戊二醛的低浓度氢氧化钠溶液中，室温 放置，使之交联成固体状态，用蒸馏水沖洗析出的晶体直到沖洗液的pH值 为中性，避光晾干后碾磨，便制得醛基化P-环糊精微球；其中p-环糊精与 含有戊二醛的低浓度氢氧化钠溶液的质量体积比为1: 5;
(2 )取上述醛基化P -环糊精微球作为固定材料与混合酶溶液充分混合 后，4摄氏度下放置8分钟使酶固定化；取0. lg上述固定化的酶均匀涂抹 于两张聚碳酸酯微孔膜上，再滴上1滴2%的海藻酸钠溶液，制成三明治结 构的酶膜后，浸入CaCl2溶液后取出，用緩冲液沖洗3遍以上，制成乳糖酶 膜；其中固定材料与混合酶溶液的质量体积比为10:1，所述混合酶溶液由 葡萄糖氧化酶、P-平乳糖苷酶、牛血清白蛋白混合而成。
其中，低浓度氢氧化钠溶液中含有体积百分比为0. 5-1. 5°/。的戊二醛。 所述CaCh溶液重量百分比浓度为5-7%。晾千后碾磨的颗粒直径为lnm左右。 所述混合酶溶液由0. 003-0. 007g葡萄糖氧化酶、1ML P -半乳糖芬酶、0. Olg 牛血清白蛋白混合而成。
本发明具有下述技术效果
本发明采用和国外研究不同的适合于核微孔膜的固定化酶方法制成固 定化酶的核微孔膜，而不是直接固定到电极上，从而适合于山东省科学院生 物研究所生产的SBA-40C生物传感分析仪，也可以灵活地和其它氧化还原 电极配合使用，具有普遍适用性。该乳糖电极在0. 2-2%和4-10%内有良好的 线性关系，响应时间40s,半衰期15-20天。葡萄糖电极的线性范围0-1%, 分辨率达到0. 001°/。，响应时间20s，半衰期大于60天。该系统可同时测定样 品中乳糖和葡萄糖的含量，乳糖电极的葡萄糖干扰用差分法消除。
具体实施例方式
以下结合具体实施例对本发明详细说明。 实施例1
称取p-环糊精20g，加到100ml含有体积百分比为1%戊二醛的0. 2M氢 氧化钠溶液中加热溶解搅拌20分钟，室温放置12小时，进行交联反应，之 后用蒸馏水沖洗析出的晶体直到冲洗液的pH值降到7. 0左右，避光晾干后 将其充分碾磨，碾磨的颗粒直径为lnm左右，便制得醛基化p -环糊精微球。 装入1. 5毫升的离心管中避光保存。
取固定材料0. 2g与20微升的混合酶溶液充分混合后，4摄氏度下放置 8分钟，取0. lg上述固定化的酶均匀涂抹于两张聚碳酸酯微孔膜上，再滴 上一滴2%的海藻酸钠溶液，制成三明治结构的酶膜后，浸入重量百分比浓 度为6%的CaCl2溶液10秒钟后取出，用緩沖液沖洗3遍以上，制成乳糖酶 膜，即可装到SBA-40C生物传感分析仪上用于分析测试。其中混合酶液由 0. 005g葡萄糖氧化酶、1ML|3-半乳糖苷酶与0. Olg牛血清白蛋白混合而成。
储存条件在膜上滴一滴甘油，4度保存。
实施例2
称取p-环糊精20g，加到100ml含有体积百分比为1.5%戊二醛的0. 2M 氢氧化钠溶液中加热溶解搅拌20分钟，室温放置12小时，进行交联反应， 之后用蒸馏水沖洗析出的晶体直到沖洗液的pH值降到7. 0左右，避光晾干 后将其充分碾磨，碾磨的颗粒直径为lnm左右，便制得醛基化P-环糊精微 球。装入1.5毫升的离心管中避光保存，
取固定材料O. 2g与20微升的混合酶溶液充分混合后，4摄氏度下放置 8分钟，取0. lg上述固定化的酶均勻涂抹于两张聚碳酸酯微孔膜上，再滴 上一滴2%的海藻酸钠溶液，制成三明治结构的酶膜后，浸入重量百分比浓 度为7%的CaCl2溶液10秒钟后取出，用緩冲液沖洗3遍以上，制成乳糖酶 膜，即可装到SBA-40C生物传感分析仪上用于分析测试。其中混合酶液由 0. 007g葡萄糖氧化酶、半乳糖苷酶与0. Olg牛血清白蛋白混合而成。 储存条件在膜上滴一滴甘油，4度保存。
实施例3
称取|3-环糊精20g，加到100ml含有体积百分比为0. 5%戊二醛的0. 2M 氢氧化钠溶液中加热溶解搅拌20分钟，室温放置12小时，进行交联反应， 之后用蒸馏水沖洗析出的晶体直到沖洗液的pH值降到7. 0左右，避光晾干 后将其充分碾磨，碾磨的颗粒直径为lnm左右，便制得醛基化p-环糊精微 球。装入1.5毫升的离心管中避光保存。
取固定材料0. 2g与20微升的混合酶溶液充分混合后，4摄氏度下放置 8分钟，取0. lg上述固定化的酶均匀涂抹于两张聚碳酸酯微孔膜上，再滴 上一滴2%的海藻酸钠溶液，制成三明治结构的酶膜后，浸入重量百分比浓 度为5%的CaClr溶液10秒钟后取出，用緩冲液沖洗3遍以上，制成乳糖酶 膜，即可装到SBA-40C生物传感分析仪上用于分析测试。其中混合酶液由 0. 003g葡萄糖氧化酶、lML0-半乳糖苷酶与0. Olg牛血清白蛋白混合而成。
储存条件在膜上滴一滴甘油，4度保存。
测定原理
乳糖+H20 ~~P- '- . . 卩-D-葡萄糖+ p-D-半乳糖
卩-D-葡萄糖+02 ,觸一 葡萄糖酸+ H202
乳糖在P -半乳糖苷酶的催化下水解为P-D-葡萄糖和|3-D-半乳糖，其中 的卩-D-葡萄糖在葡萄糖氧化酶的催化下生成葡萄糖酸和HA,其氧化还原反 应的化学计量学信号通过电极的电信号表现出来，从而达到对乳糖进行定量 测定的目的。
本发明利用淀粉、P -环糊精和海藻酸钠为混合固定材料的乳糖酶膜性 能良好，最低乳糖检出浓度为0. 0005%，响应时间20秒，0%-2°/。范围内线性 关系W达到0. 995以上，每天测样40次，1周以后酶膜活性没有明显下降。
权利要求
1、一种乳糖酶膜的制备方法，其特征是，包括下述步骤(1)称取β-环糊精溶解于含有戊二醛的低浓度氢氧化钠溶液中，室温放置，使之交联成固体状态，用蒸馏水冲洗析出的晶体直到冲洗液的pH值为中性，避光晾干后碾磨，便制得醛基化β-环糊精微球；其中β-环糊精与含有戊二醛的低浓度氢氧化钠溶液的质量体积比为1∶5；(2)取上述醛基化β-环糊精微球作为固定材料与混合酶溶液充分混合后，4摄氏度下放置8分钟使酶固定化；取0.1g上述固定化的酶均匀涂抹于两张聚碳酸酯微孔膜上，再滴上1滴2％的海藻酸钠溶液，制成三明治结构的酶膜后，浸入CaCl2溶液10秒钟后取出，用缓冲液冲洗3遍以上，制成乳糖酶膜；其中固定材料与混合酶溶液的质量体积比为10∶1，所述混合酶溶液由葡萄糖氧化酶、β-半乳糖苷酶、牛血清白蛋白混合而成。
2、 根据权利要求1所述的乳糖酶膜的制备方法，其特征是，低浓度氢 氧化钠溶液中含有体积百分比为0. 5-1. 5%的戊二醛。
3、 根据权利要求1所述的乳糖酶膜的制备方法，其特征是，所述CaCh 溶液重量百分比浓度为5-7%。
4、 根据权利要求1所述的乳糖酶膜的制备方法，其特征是，晾干后碾 磨的颗粒直径为lnm左右。
5、 根据权利要求1所述的乳糖酶膜的制备方法，其特征是，所述混合 酶溶液由0. 003-0. 007g葡萄糖氧化酶、lMLp-半乳糖苷酶、0. Olg牛血清白 蛋白混合而成。
全文摘要
本发明公开了一种乳糖酶膜的制备方法，旨在提供一种可以和不同氧化还原电极配合使用，并适合于乳糖在线监控的一个核心部件-核微孔固定化酶膜。该方法包括下述步骤称取β-环糊精溶解于含有戊二醛的低浓度氢氧化钠溶液中，室温放置，使之交联成固体状态，用蒸馏水冲洗析出的晶体，避光晾干后碾磨，便制得醛基化β-环糊精微球。取上述固定材料与混合酶溶液充分混合，4摄氏度下放置8分钟；取固定化的酶均匀涂抹于两张聚碳酸酯微孔膜上，再滴上海藻酸钠溶液，制成三明治结构的酶膜后，浸入CaCl₂溶液后取出，用缓冲液冲洗制成乳糖酶膜。本发明的方法制成的核微孔固定化酶膜可以灵活地和其它氧化还原电极配合使用，具有普遍适用性。
文档编号G01N27/327GK101191782SQ20071015119
公开日2008年6月4日 申请日期2007年12月21日 优先权日2007年12月21日
发明者庞广昌, 李家鹏 申请人:天津商业大学