专利名称：一种离子对色谱法测定吡咯并喹呤醌含量的分析方法
技术领域：
一种离子对色谱法测定吡咯并喹呤醌含量的分析方法，属于色谱分析技术领域。 吡咯并喹呤醌(pyrroloquinoline quinine PQQ)是一种新的氧化还原酶辅基， 其分子量为330，主要分布于原核生物以及部分植物和哺乳动物之中，在牛奶尤其母乳中含 量较高。其化学结构中邻位的醌和三个羧基是其重要的功能基团(结构式如下所示)。其 作为电子的受体或供体参与酶催化的氧化还原过程，并能影响呼吸链功能与体内自由基水 平，被认为是体内必需的维生素之一。具有促进动植物和微生物细胞的生长、促进神经细胞 和生长因子合成、降解乙醇防治肝损伤、调解机体自由基水平、保护脑功能、提高毒性和辐 射耐受性等多种生理功能。最新研究报道(Mol NeurOdegener，2010)PQQ对β淀粉斑块、 α-突触核蛋白C端变异引起的毒性具有较强的抑制作用，有望成为帕金森病的强有力的 候选治疗药物，具有广泛的开发应用前景。PQQ的制备方法有化学合成法和生物合成法，化 学合成法步骤多，产率低；生物合成法大多用细菌发酵；而且其化合物本身具有较活泼的 活性基团，容易与各类化合物发生反应，因此，要得到高纯度的药用级的产品，必须采用有 效的分析手段，确保产品质量。 PQQ结构式
PQQ的分析方法有气-质联用、免疫法、毛细管电泳法、重组酶法。这些分析方法均需 要特殊仪器，而且成本较高，不易于推广应用。较常用的高效液相色谱法，文献报道采用甲 醇-水或乙腈-水(0. 1%三氟乙酸)梯度洗脱，不能将其中的杂质有效地加以分离，而且PQQ 峰拖尾，保留时间16min左右(微生物学报，2007)。本法采用离子对高效液相色谱法对合成 和发酵生产的PQQ进行定量分析，方法简单，制备过程中有可能产生的杂质得到了有效的 分离。本发明的目的是提供一种离子对色谱法测定吡咯并喹呤醌含量的分析方法。本发明的技术方案一种离子对色谱法测定吡咯并喹呤醌PQQ含量的分析方法 仪器=WATERS 600型高效液相色谱仪，WATERS 2487紫外检测器，色谱柱Amethyst
C18-P (5μπι, 4. 6X250mm)；
流动相30%-35%乙腈+70%-65%缓冲液，所述缓冲液为pH2. 8、含IOmM的四丁基溴化铵 TABA的20mM磷酸二氢钾溶液；使用前经0. 45 μ m有机滤膜抽滤并脱气，流速1. OmL/min ；
背景技术：

发明内容
3样品进样体积5 μ L ；柱温室温；检测波长256nm ；
精密称取干燥恒重的PQQ对照品，用二甲亚砜DMSO溶解配制成含PQQ 1. Omg/mL的溶 液，记为W5iw，作为对照溶液；精密称取被测样品，用DMSO配制成浓度为1. Omg/mL的溶液， 记为W#s，作为供试品溶液；测定所得峰面积分别为SWM、S#s，按外标法计算被测样品中 PQQ的含量为(S样品/S对照)X (W对照/W样品)X 100%，最小检出量为2. Ong, S/N彡3。本发明的有益效果本发明采用离子对高效液相色谱法对合成或发酵生产的PQQ 进行定量分析，所得回归方程为y = 4E+06x + 627846，R2 = 0. 9995，R为线性回归方程的 相关参数，在2 12μ g/mL试验范围内呈线性，最小检出量为2. Ong(S/N彡3)。本发明方 法简单，制备过程中有可能产生的杂质得到了有效的分离。


图1溶剂和检测波长的选择色谱图。图2 pH值对保留时间的影响。图3不同离子对的选择的色谱图。图4线性关系与检测限测定图。
具体实施例方式色谱条件优化
1、溶剂和检测波长的选择
用甲醇、乙腈、氯仿、乙酸乙酯、二甲亚砜(DMSO)等溶剂溶解，并进行光谱扫描，在乙腈、 氯仿、乙酸乙酯等溶剂中，PQQ没有明显的紫外特征吸收峰；在甲醇溶剂中，PQQ在210nm、 248nm,365nm处有三个特征吸收峰，在DMSO溶剂中，PQQ在256nm、322nm处有两个明显的特 征吸收峰，而且响应值是在甲醇中的2. 1倍。选择DMSO作溶剂，选择较高响应值的256nm 作为检测波长。2、流动相的选择表i不同比例的缓沖液ι的影响
权利要求
1. 一种离子对色谱法测定吡咯并喹呤醌PQQ含量的分析方法，其特征在于 仪器=WATERS 600型高效液相色谱仪，WATERS 2487紫外检测器，色谱柱Amethyst C18-P ；流动相30%-35%乙腈+70%-65%缓冲液，所述缓冲液为pH2. 8、含IOmM的四丁基溴化铵 TABA的20mM磷酸二氢钾溶液；使用前经0. 45 μ m有机滤膜抽滤并脱气，流速1. OmL/min ； 样品进样体积5 μ L ；柱温室温；检测波长256nm ；精密称取干燥恒重的PQQ对照品，用二甲亚砜DMSO溶解配制成含PQQ 1. Omg/mL的溶 液，记为W5iw，作为对照溶液；精密称取被测样品，用DMSO配制成浓度为1. Omg/mL的溶液， 记为W#s，作为供试品溶液；测定所得峰面积分别为SWM、S#s，按外标法计算被测样品中 PQQ的含量为(S样品/S对照)X (W对照/W样品)X 100%，最小检出量为2. Ong, S/N彡3。
全文摘要
一种离子对色谱法测定吡咯并喹呤醌含量的分析方法，属于色谱分析技术领域。本发明采用离子对高效液相色谱法对合成或发酵生产的PQQ进行定量分析，所得回归方程为y=4E+06x+627846，R2=0.9995，在2～12μg/mL试验范围内呈线性，最小检出量为2.0ng(S/N≥3)。本发明方法简单，制备过程中有可能产生的杂质得到了有效的分离。
文档编号G01N30/34GK102072942SQ20101055723
公开日2011年5月25日 申请日期2010年11月24日 优先权日2010年11月24日
发明者周杏琴, 孔艳艳, 张建康, 曹国宪, 钦晓峰 申请人:江苏省原子医学研究所