专利名称：一种检测SARS－Cov病毒的荧光定量PCR试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种检测SARS-Cov病毒的试剂盒，具体地说涉及一种检测SARS-Cov病毒的荧光定量PCR试剂盒，还涉及该试剂盒在检测SARS-Cov病毒中的应用。
背景技术：
SARS-Cov病毒(severe acute respiratory syndrome associated coronavirus；严重急性呼吸综合症相关的冠状病毒)是严重急性呼吸系统综合征(SARS)的病原体，是一种新出现的正链RNA冠状病毒，为冠状病毒的变种。该病毒已知的冠状病毒基因序列的同源性约为60％，但在抗原性上二者没有交叉，所以虽然正常人群中存在已知的冠状病毒的抗体，但对此种病毒却没有保护作用，导致人群的普遍易感。人体感染后会有严重呼吸症状，死亡率较高，对人类的健康有严重危害，世界卫生组织将其定义为严重急性呼吸系统综合征，我国称之为“非典型肺炎”。到目前为止，在世界数十个国家已经出现了数千病例，虽然现在该病已经得到了有效控制，但仍存在爆发的危险。因此快速检测SARS-Cov病毒感染方法，对于尽快确定疑似病例是否感染SARS-Cov病毒，SARS-Cov病毒相关基础研究以及疫苗研究有重要意义。
随着对SARS-Cov的研究深入，针对SARS-Cov的诊断试剂大量出现，现在已经有免疫荧光诊断试剂盒、PCR诊断试剂盒、酶联免疫诊断试剂盒等，这些试剂盒为定性检测，不能对病毒进行定量检测，目前尚未见到用于检测SARS-Cov病毒的荧光定量PCR试剂盒的报道。

发明内容
本发明提供了一种检测SARS-Cov病毒的荧光定量PCR试剂盒，该试剂盒能够在生物样品中快速检测SARS-Cov病毒RNA拷贝数，为一种反转录定量PCR试剂盒。
本发明的试剂盒包括以下部分(1)RNA抽提试剂，(2)逆转录酶，(3)Taq DNA聚合酶，(4)标准阳性DNA模板(5)逆转录反应液(6)荧光定量反应液。
RNA抽提试剂有多种，其中TRIzol是强变性剂，它既可以从生物样品中抽提纯化出SARS-Cov病毒的RNA，还可以灭活生物样品中可能存在的SARS-Cov病毒，因为含有SARS-Cov活病毒的生物样品的操作需要在BSL-3实验室中进行，用TRIzol试剂处理后就可以在普通实验室中进行，故本发明试剂盒的RNA抽提试剂优选采用TRIzol试剂。
逆转录反应液包括逆转录反应液1和逆转录反应液2，其中逆转录反应液1由引物2、5×第一链缓冲液、dNTP混合物、DTT和DEPC处理的去离子水组成。逆转录反应液2由引物4、5×第一链缓冲液、dNTP混合物、DTT和DEPC处理的去离子水组成。
荧光定量反应液包括荧光定量反应液1和荧光定量反应液2。其中荧光定量反应液1由Taq DNA聚合酶的10×Buffer(含6-ROX)、dNTP混合物、引物1、引物2、TaqMan探针1和去离子水组成。
荧光定量反应液2由Hot-start Taq酶的10×Buffer(含6-ROX)、dNTP混合物、引物3、引物4、TaqMan探针2和去离子水组成。TaqMan探针1、2的5’端都标记有荧光报告基团FAM(5-carboxyfluorescein)，3’端都标记有荧光淬灭基团TAMRA(6-carboxytetramethylrhodamine)，FAM和TAMRA基团为市售产品，在探针合成时标记。定量PCR检测应用了荧光共振能量转移(fluorescence resonance energy transfer，FRET)技术，TaqMan探针5’-FAM荧光报告基团被3’-TAMRA荧光淬灭基团淬灭，PCR反应时，探针退火到模板上，然后链延伸反应过程中，由于Taq酶有5’-3’的外切活性，TaqMan探针被切割，释放出FAM荧光报告基团，释放到反应液中的FAM基团的量与PCR反应产物的累积量成比例，荧光定量PCR仪通过测量PCR反应液的荧光值进行定量。Hot-start Taq酶的10×Buffer中所含的6-ROX(6-carboxy-X-rhodamine)是作为荧光内对照，用于消除定量PCR仪检测时各个孔之间的误差。
上面所述的引物1具有序列表中序列1所示的核苷酸序列，引物2具有序列表中序列2所示的核苷酸序列，TaqMan探针1具有序列表中序列3所示的核苷酸序列，引物3具有序列表中序列4所示的核苷酸序列，引物4具有序列表中序列5所示的核苷酸序列，TaqMan探针2具有序列表中序列6所示的核苷酸序列。
标准阳性模板是质粒pT-N和pT-S，分别是在质粒pGEM-T(Promega公司)中插入了SARS-Cov病毒的Nucleocapsid和Spike基因片段，两基因片段的DNA序列分别见序列表中序列7和序列8。pT-N和pT-S两个质粒的制备方法包括以下步骤1、培养SARS-COV病毒，提取病毒RNA进行逆转录反应制备病毒cDNA，作为PCR反应模板；2、设计引物，进行PCR反应，扩增spike和nucleocapsid基因片段；3、琼脂糖凝胶电泳纯化回收上述PCR反应产物，将其分别连接到克隆载体上，构建重组质粒；4、将重组质粒转化感受态细胞，挑阳性克隆培养，提取质粒，获得质粒pT-S和pT-N。
两个质粒都可以在大肠杆菌中扩增。试剂盒中的质粒浓度分别为107拷贝数/μl、105拷贝数/μl和103拷贝数/μl。
本发明的试剂盒还包括RNasin RNA酶抑制剂。
用本发明的试剂盒检测SARS-Cov病毒包括如下步骤1、病毒RNA的提取。将Vero-E6细胞接种病毒后培养一定时间，取细胞培养上清，加到TRIzol试剂中，然后加入氯仿，振摇后离心取上层溶液，加入异丙醇，室温放置后离心，用乙醇洗RNA沉淀，离心后晾干，溶于DEPC处理的去离子水中。
2、逆转录反应。将逆转录反应液1或逆转录反应液2，RNA溶液，RNasinRNA酶抑制剂，逆转录酶，混匀，进行逆转录反应。
3、荧光定量PCR反应。将荧光定量PCR反应液1或荧光定量PCR反应液2，逆转录产物或阳性标准模板，Taq DNA聚合酶混匀，进行PCR反应。
4、读取阳性标准和检测样品的拷贝数。
本发明的试剂盒，可以在加入TRIzol试剂将病毒灭活后在普通实验室进行检测，安全方便。本发明的试剂盒对SARS-Cov病毒能定量检测，在病毒拷贝数在100以上时都能检测到，灵敏度高。可用于检测SARS感染者的样品如血液、唾液、呼吸道擦拭物等中的SARS-Cov病毒，也可用于SARS-Cov病毒的基础研究及疫苗研制、生产过程中病毒滴度的检测，具有良好的应用前景。
具体实施例方式
实施例一 SARS-Cov病毒的荧光定量PCR试剂盒组成


其中Hot-start Taq DNA聚合酶购自天为时代公司，dNTP购自Promega公司，SuperScript II RNase H-逆转录酶(200U/μl)和TRIzol试剂购自Invitrogen公司，6-ROX购自Molecular Probes公司，各引物及探针均由博亚公司合成，氯仿、异丙醇、75％乙醇及DEPC为市售产品，DEPC处理的去离子水临用前配制。
如果标准阳性DNA模板用pT-N，则使用逆转录反应液1和荧光定量PCR反应液1；如果标准阳性DNA模板用pT-S，则使用逆转录反应液2和荧光定量PCR反应液2。
实施例二、质粒pT-S和pT-N的制备一、SARS-Cov病毒RNA的提取24孔细胞培养板培养的Vero-E6细胞接种病毒后一定时间，取100μlVero-E6细胞培养上清，加到1ml TRIzol试剂中，摇匀，静置5分钟。加入0.2ml氯仿，剧烈振摇15秒，然后以12000g常温离心15分钟。取上层溶液，加入0.5ml异丙醇，室温放置10分钟。12000g常温离心15分钟，小心倒掉液体。用1ml 75％乙醇(用DEPC处理的去离子水临用前配制)洗RNA沉淀，12000g常温离心5分钟。小心倒掉液体，室温下晾干。RNA溶于50μl DEPC处理的去离子水中。
二、逆转录PCR(RT-PCR)扩增spike和nucleocapsid基因片段1、逆转录反应，制备SARS-Cov病毒cDNA模板，逆转录反应条件如下


2、PCR反应扩增spike基因片段和nucleocapsid基因片段2.1 设计引物spike基因片段左侧引物其序列如序列表中序列9所示，右侧引物序列如序列表中序列10所示；nucleocapsid基因片段左侧引物其序列如序列表中序列11所示，右侧引物如序列表中序列12所示。
2.2 PCR反应组成

2.3 PCR反应条件按下列条件进行PCR，分别扩增spike和nucleocapsid基因片段94℃3分钟；(94℃30秒，56℃30秒，72℃2分钟)共25个循环；72℃7分钟。
三、琼脂糖凝胶电泳纯化回收上述PCR反应扩增得到的spike基因片段和nucleocapsid基因片段，按如下条件连接到pGEM-T(Promega公司)载体上

四、连接产物转化Top10感受态细胞，挑阳性克隆培养，提质粒，获得质粒pT-S和pT-N。
五、标准阳性DNA模板的制备将质粒pT-N配成浓度分别为44pg/ul(107拷贝/ul)、0.44pg/ul(105拷贝/ul)和4.4fg/ul(103拷贝/ul)的水溶液，即为试剂盒中的标准阳性DNA模板pT-N；将质粒pT-S配成浓度分别为41pg/ul(107拷贝/ul)、0.41pg/ul(105拷贝/ul)和4.1fg/ul(103拷贝/ul)的水溶液。即为试剂盒中的标准阳性DNA模板pT-S。
实施例三 SARS-Cov病毒的荧光定量PCR试剂盒检测SARS-Cov病毒滴度1、病毒RNA的提取24孔细胞培养板培养的Vero-E6细胞接种病毒后一定时间，取100μlVero-E6细胞培养上清，加到1ml TRIzol试剂中，摇匀，静置5分钟。加入0.2ml氯仿，剧烈振摇15秒，然后以12000g常温离心15分钟。取上层溶液，加入0.5ml异丙醇，室温放置10分钟。12000g常温离心15分钟，小心倒掉液体。用1ml 75％乙醇(用DEPC处理的去离子水临用前配制)洗RNA沉淀，12000g常温离心5分钟。小心倒掉液体，室温下晾干。RNA溶于50μl DEPC处理的去离子水中。
2、逆转录反应

3、荧光定量PCR反应(在ABI PRISM 7000 Sequence Detection System中进行反应)

4、读取阳性标准和检测样品的拷贝数结果为标准阳性模板107拷贝数/μl、105拷贝数/μl和103拷贝数/μl的Ct值分别为19.54、26.56和35.49。
利用本发明的试剂盒，SARS-Cov病毒数在100拷贝以上都能检测到。
序列表<110> 中国人民解放军军事医学科学院生物工程研究所<120> 一种检测SARS-Cov病毒的荧光定量PCR试剂盒<130>
<160> 12<170> PatentIn version 3.2<210> 1<211> 19<212> DNA<213>
<400> 1caaacattgg ccgcaaatt 19<210> 2<211> 21<212> DNA<213>
<400> 2caatgcgtga cattccaaag a 21<210> 3<211> 26<212> DNA<213>
<400> 3cacaatttgc tccaagtgcc tctgca 26<210> 4<211> 21<212> DNA<213>
<400> 4tgtggaaagg gctaccacct t 21<210> 5<211> 26<212> DNA<213>
<400> 5catacgtgac atgtaggaag acaaca 26<210> 6<211> 21<212> DNA<213>
<400> 6tgtccttccc acaagcagcc c 21<210> 7<211> 68<212> DNA<213>
<400> 7caaacattgg ccgcaaattg cacaatttgc tccaagtgcc tctgcattct ttggaatgtc60acgcattg 68<210> 8<211> 76<212> DNA<213>
<400> 8tgtggaaagg gctaccacct tatgtccttc ccacaagcag ccccgcatgg tgttgtcttc60ctacatgtca cgtatg76<210> 9
<211> 20<212> DNA<213>
<400> 9atatggcgaa tgcctaggtg20<210> 10<211> 20<212> DNA<213>
<400> 10tgaaatgtcg ccaagatcaa20<210> 11<211> 23<212> DNA<213>
<400> 11atgtctgata atggacccca atc23<210> 12<211> 23<212> DNA<213>
<400> 12ttatgcctga gttgaatcag cag2权利要求
1.一种检测SARS-Cov病毒的荧光定量PCR试剂盒，其特征在于包含以下部分(1)RNA抽提试剂，(2)逆转录酶，(3)Taq DNA聚合酶，(4)标准阳性DNA模板，(5)逆转录反应液和(6)荧光定量反应液。
2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于所说的RNA抽提试剂为TRIzol，逆转录酶为SuperScript II RNase H-，Taq DNA聚合酶为Hot-start Taq DNA聚合酶。
3.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于标准阳性DNA模板包括标准阳性DNA模板1和标准阳性DNA模板2，其中标准阳性DNA模板1为含有SARS-Cov病毒Nucleocapsid片段的质粒pT-N，标准阳性DNA模板2为含有SARS-Cov病毒Spike片段的质粒pT-S。
4.根据权利要求1所述试剂盒，其中逆转录反应液包括逆转录反应液1和逆转录反应液2，荧光定量反应液包括荧光定量反应液1和荧光定量反应液2，其特征在于逆转录反应液1中含有引物2，其核苷酸序列如序列表中序列2所示，逆转录反应液2中含有引物4，其核苷酸序列如序列表中序列5所示，荧光定量反应液1中含有引物1，TaqMan探针1及引物2，其中引物1的序列如序列表中序列1所示，TaqMan探针1的序列如序列表中序列3所示，荧光定量反应液2中含有引物3，TaqMan探针2及引物4；其中引物3的序列如序列表中序列4所示，TaqMan探针2的序列如序列表中序列6所示。
5.根据权利要求4所述试剂盒，其特征在于TaqMan探针1和TaqMan探针2的核苷酸序列5’端都标记有荧光报告基团FAM，3’端都标记有荧光淬灭基团TAMRA。
6.权利要求1至5的任意一项所述的试剂盒在检测SARS-Cov病毒中的应用。
全文摘要
本发明公开了一种检测SARS－Cov病毒的荧光定量PCR试剂盒。本发明的试剂盒含有以下成分RNA抽提试剂，逆转录酶，Taq DNA聚合酶，SARS－Cov病毒特异性引物和探针，标准阳性DNA模板。利用该试剂盒可以快速定量检测SARS－Cov病毒，在SARS－Cov病毒疫苗研制及非典型肺炎病例的辅助诊断中有重要作用。
文档编号G01N33/569GK1618982SQ20031011502
公开日2005年5月25日 申请日期2003年11月20日 优先权日2003年11月20日
发明者朱旭东, 黄培堂 申请人:中国人民解放军军事医学科学院生物工程研究所