专利名称：肌酸酐测定用试片的制作方法
技术领域：
本发明涉及在肌酸酐的测定中使用的试片。
背景技术：
在临床医疗领域中，由于肌酸酐作为肾功能的指标非常有用，所以对肌酸酐进行测定。
作为上述肌酸酐的测定方法，例如一般有化学法和酶法。作为上述化学法，例如采用利用在碱性条件下肌酸酐与苦味酸反应显橙红色的性质的Jaffe法(例如参照Bonsnes和Taussky，Journal of BiologicalChemistry(J.Biol.Chem)，1945年，158，p.581)，以及使用3，5-二硝基苯甲酸代替苦味酸的Benedict·Behre法(例如参照Benedict和Behre，Journal of Biological Chemistry(J.Biol.Chem)，1936年，113，p.515)等。另一方面，作为上述酶法，采用使酶作用于肌酸酐生成氨，用比色法测定其的肌酸酐脱氨酶法，以及通过肌酸酐酶将肌酸酐转变成肌酸，将此肌酸用肌氨酸氧化酶和过氧化物酶处理，用比色法测定的肌酸酐氨基水解酶法(肌酸酐酶法)(例如参照Tanganelli等人，Clinical Chemistry(Clin.Chem)，1982年，28，p.1461)等。

发明内容
上述Jaffe法和Benedict法由于利用化学缩合反应，所以使用的试剂成本非常低廉。但是，如果反应温度例如达不到35℃以上，该反应就难以发生，因此需在高温下进行长时间(例如10分钟以上)的反应。而且，由于在强碱条件(pH11以上)下反应，使用强碱试剂，因此测定需要特殊的装置和器具等，测定后的废液处理也是个大问题。
另一方面，上述酶法与上述化学法相比，例如在中性附近的温和条件下进行反应，对肌酸酐的特异性也高，解决了化学法的大部分缺点。但是，例如，使用的酶的价格非常高，还有，由于使用的酶的种类也多，因此试剂成本高，存在的状况是除能够微量测定的特殊设备以外难以进行测定。
特别是近年来，作为生活习惯病的糖尿病在世界范围内增长着，由此引起的糖尿病的并发症之一糖尿病性肾病，甚至严重的肾功能不全在增加。而且，问题是对于这种疾病，例如需要进行肾透析和肾移植。因此，为了早期防止这种肾病，特别是糖尿病性肾病，期待着安全且快速简便地测定作为肾功能指标的肌酸酐的新型测定方法。
因此，本发明的目的是提供在肌酸酐测定中使用的试片。
为了达成上述目的，本发明的肌酸酐测定用试片是含有下述式(1)表示的化合物的肌酸酐测定用试片， 上述式(1)中，R1为H、SO3X、COOX；R4和R6可以相同也可以不同，各自为OH、SO3X、COOX；R2、R3、R5和R7可以相同也可以不同，各自为H、OH、Cl、Br、I、NO2、NO、CH3；上述R1、R4和R6中的X可以相同也可以不同，各自为H、Na、K、NH4。
本发明人为了开发肌酸酐的新型测定方法，尝试在络合物生成剂与金属的显色络合物生成反应中，通过肌酸酐的共存，使发生竞争性络合物生成反应，利用上述显色络合物的退色测定肌酸酐的量。结果，本发明人首次发现，上述式表示的化合物，在不存在肌酸酐的情况下与过渡金属形成显色络合物，而当存在肌酸酐时，肌酸酐阻碍上述显色络合物的形成，肌酸酐与上述过渡金属形成非显色络合物。因此，使用含有这种化合物的本发明的肌酸酐测定用试片，例如，通过测定上述显色络合物有无形成及形成的程度，便可知道肌酸酐阻碍上述显色络合物形成的程度，由此可以求出试样中的肌酸酐的量。另外，使用本发明的测定用试片进行的测定，例如，由于可以在室温下进行反应，所以也不需要象以往的酶法那样将反应温度调节至酶的最佳温度，而且可以在短时间内进行反应。因此，可以快速且容易地进行测定。所以，本发明的测定用试片，作为肾功能指标的肌酸酐的测定方法，在临床医疗领域等特别有用。


图1是显示本发明的实施例中肌酸酐浓度与反射率的关系的图。
图2是显示本发明的实施例中肌酸酐浓度与反射率的关系的图。
具体实施例方式
本发明的肌酸酐测定用试片，如上所述，是含有上述式(1)表示的化合物的试片。
作为上述化合物，例如，优选下述式(2)表示的化合物，更加优选下述式(3)表示的化合物，特别优选下述式(4)表示的化合物。由于这些化合物为水溶性的，例如，在测定液体试样等的肌酸酐时，易于反应，可以以更加优异的灵敏度进行测定。

上述式(2)中，R1为H、SO3X、COOX；R4和R6可以相同也可以不同，各自为OH、SO3RX、COOX；R2、R3、R5和R7可以相同也可以不同，各自为H、OH、Cl、Br、I、NO2、NO、CH3；上述R1、R4和R6中的X可以相同也可以不同，各自为H、Na、K、NH4。
上述式(3)中，R1为H、SO3X、COOX；R2和R3可以相同也可以不同，各自为H、OH、Cl、Br、I、NO2、NO、CH3；X可以相同也可以不同，各自为H、Na、K、NH4。
这些化合物中，优选下述式(4)～(7)表示的化合物。

再者，上述式(4)的化合物名为2，6-二氯-4′-羟基-3′，3″-二甲基-3-磺基品红酮-5′，5″-二羧酸三钠盐[以下称为铬天青S(Chromazurol S)]；上述式(5)的化合物名为2，6-二氯-4′-羟基-3′，3″-二甲基品红酮-5′，5″-二羧酸二钠盐[以下称为铬天青B(Chromazurol B)]；上述式(6)的化合物名为Chromoxane cyanine R[以下称为铬花青R(Eriochrome CyanineR)]；上述式(7)的化合物名为邻苯二酚磺酞[以下称为邻苯二酚紫(Pyrocatechol violet)]。
上述各化合物的制备方法没有特别限制，可以根据以往公知的合成方法制备。另外，作为上述化合物，可以使用市售品。上述铬天青S，例如有商品名为Chrome Azurol S(Nacalai公司生产)；上述铬天青B，例如有商品名为Chromazurol B(同仁化学公司生产)；上述铬花青R，例如有商品名为Eriochrome Cyanine R(Nacalai公司生产)；上述邻苯二酚紫，例如有商品名为Pyrocatechol violet(同仁化学公司生产)。
本发明的肌酸酐测定用试片，优选多孔材料含有上述化合物。
上述多孔材料的种类没有特别限制，例如可以使用滤纸、玻璃滤器、树脂制多孔膜等多孔材料。其中，从成本和操作性等理由看，优选滤纸。另外，作为上述树脂制多孔膜的材料，例如有聚砜、聚酯、尼龙、硝化纤维素、聚碳酸酯等。并且，此多孔材料的平均孔径，例如，只要能够浸透、保持液体试样即可，例如为3～10μm的范围。
本发明的肌酸酐测定用试片优选还含有与上述化合物形成显色络合物的金属或其盐(以下均称为“金属”)。
作为上述金属，例如优选过渡金属或它们的盐。作为上述过渡金属，例如有Cu(II)、Pd(II)、U(VI)、Zr(IV)、Ti(IV)、Mn(II)、Fe(III)、Co(II)、Ni(II)、Mo(VI)、Sn(IV)等或它们的盐。其中优选Cu(II)、Pd(II)，更加优选Pd(II)。另外，作为它们的盐，优选卤化物、硫酸盐这些水溶性高的物质。
作为上述化合物与金属的组合，例如有铬天青S与Pd(II)的组合、铬天青B与Pd(II)的组合、铬花青R与Cu(II)的组合、邻苯二酚紫与Cu(II)的组合等。其中优选铬天青S与Pd(II)的组合。
本发明的肌酸酐测定用试片优选还含有缓冲剂。作为上述缓冲剂，例如可以使用磷酸盐、硼酸盐、乙酸盐、柠檬酸盐、琥珀酸盐、三羟甲基氨基甲烷等，优选磷酸盐、硼酸盐、乙酸盐，更加优选磷酸盐。
本发明的肌酸酐测定用试片，例如，从可以控制由上述式(1)表示的化合物与金属形成的显色络合物的稳定性的观点看，优选进一步含有表面活性剂。即，所说的通过表面活性剂的存在可以调节上述显色络合物的稳定性，是指当肌酸酐存在时，与金属和上述化合物形成显色络合物相比，金属与肌酸酐更易发生形成络合物的竞争反应，所以可以提高金属与肌酸酐的反应活性。因此，可以进行更高精度的肌酸酐测定。
作为上述表面活性剂，没有特别限制，例如，可以使用非离子型表面活性剂、阴离子型表面活性剂、阳离子型表面活性剂等，这些表面活性剂可以使用一种，也可以两种以上并用。
作为上述非离子型表面活性剂，例如，可以使用聚乙烯醇(PVA)、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、聚丙二醇、聚乙二醇、Triton类、Tween类、Brij类等，其中优选PVA、Triton-X 100、聚乙二醇，更加优选聚乙二醇。
作为上述阴离子型表面活性剂，例如，可以使用十二烷基硫酸钠(SDS)、十二烷基苯磺酸钠、胆酸钠、脱氧胆酸钠等，其中优选SDS、胆酸钠，更加优选SDS。
作为上述阳离子型表面活性剂，例如，可以使用苄基三甲基溴化铵、十六烷基三甲基溴化铵、苯扎氯铵、苄基二甲基十四烷基氯化铵(Zephiramine)等，其中优选苄基三甲基溴化铵、十六烷基三甲基溴化铵，更加优选苄基三甲基溴化铵。
上述表面活性剂可以使用任意一种，也可以两种以上并用。作为其组合，例如有非离子型与阴离子型的组合，具体有PVA与SDS的组合、聚乙二醇与胆酸钠的组合、Triton-X 100与SDS的组合等。另外，作为非离子型与阳离子型的组合，例如有聚乙二醇与苄基三甲基溴化铵的组合、PVP与十六烷基三甲基溴化铵的组合等。
另外，例如，如上所述，由于表面活性剂对由上述式(1)的化合物与金属形成的显色络合物的稳定性和显色性有影响，所以优选根据上述化合物及金属的种类来适当确定表面活性剂。
(实施方式1)下面是关于本发明在上述多孔材料中含有上述式(1)的化合物、上述金属和缓冲剂的试片的一个实例。
上述多孔材料中各种试剂的含量没有特别限制，可以根据试样的量等适当确定。作为具体的实例，例如，上述多孔材料每立方厘米体积，上述化合物为3×10-3～1.5μmol的范围，金属为6×10-3～0.9μmol的范围，缓冲剂为9～45μmol的范围。优选上述化合物为0.03～0.9μmol的范围，金属为0.06～0.45μmol的范围，缓冲剂为12～30μmol的范围。再者，每立方厘米上述多孔材料添加的试样的体积通常为20～40μl的范围。
上述化合物(A)和上述金属(B)的添加比例(摩尔比A∶B)例如为30∶1～1∶15，优选15∶1～1∶10，特别优选3∶1～1∶4。另外，化合物(A)和缓冲剂(C)的添加比例(摩尔比A∶C)例如为1∶10～1∶1000，优选1∶20～1∶500，特别优选1∶50～1∶200。
另外，当还含有表面活性剂时，例如，上述多孔材料每立方厘米体积，表面活性剂为3～600μg的范围，优选30～300μg的范围。化合物(A)和表面活性剂(D)的添加比例(摩尔比A∶D)例如为50∶1～3∶1，优选30∶1～4∶1，特别优选20∶1～5∶1。
例如，准备混合上述各种试剂的溶液，使上述多孔材料浸渍上述溶液，通过干燥可以调制这样的试片。再者，上述混合溶液的pH可以通过上述缓冲剂的种类等进行调制，例如，优选pH5～9的范围，更加优选pH6～8的范围。这样，由于可以设定到中性附近，例如，与含有碱性物质或酸性物质的试片不同，可以防止多孔材料受到损伤。因此，成为稳定性也优良的试片。
上述混合溶液中的各种试剂的浓度，例如，可以根据保持在上述多孔材料中的上述各种试剂的设定量来确定。例如，上述化合物为0.1～50mmol/L的范围，金属为0.2～30mmol/L的范围，缓冲剂为0.3～1.5mol/L的范围。优选上述化合物为1～30mmol/L的范围，金属为2～15mmol/L的范围，缓冲剂为0.4～1mol/L的范围。另外，当还含有表面活性剂时，例如，表面活性剂为0.01～2重量％的范围，优选0.1～1重量％的范围。再者，对于上述多孔材料在上述混合溶液中的浸渍和干燥可以反复进行，也可以调节保持量。
作为上述混合溶液的溶媒，没有特别限制，可以使用水、缓冲液等。如上所述，由于作为试剂包括缓冲剂，所以优选含有上述缓冲剂的缓冲液作为溶媒。另外，例如，也优选含有乙醇、甲醇、丙酮等有机溶剂。
再者，预先混合上述化合物和金属时，上述两者反应形成显色络合物，即使使上述混合溶液浸渍在多孔材料中，通过添加含肌酸酐的试样，肌酸酐与金属形成络合物也没有问题。推测其原因是肌酸酐不仅阻碍上述两者形成显色络合物，即使已经形成显色络合物，也具有从此显色络合物夺取上述金属，与上述金属形成络合物的能力。
如上所述，在上述混合溶液中，即使上述化合物和金属形成显色络合物，也不影响肌酸酐与金属形成络合物。但是，在预先抑制显色络合物形成的场合，例如，分别配制含有上述化合物的溶液以及含有金属和缓冲剂的溶液，上述多孔材料在各溶液中的浸渍和干燥可以分别进行。具体地说，例如，将肌酸酐测定用化合物溶解于金属难以溶解的有机溶剂中，另一方面，将金属和缓冲剂溶解于水中，配制水溶液。然后，浸渍上述水溶液，干燥后，再浸渍上述有机溶剂的肌酸酐测定用化合物溶液。这样，上述化合物与金属没有发生反应，可以保持在多孔材料中。作为上述金属难以溶解的有机溶剂，例如有丙酮、甲苯、乙醇等。
另外，从操作性优良方面考虑，也可以将含有各种试剂的上述多孔材料层压在支持体上。这种场合下，上述支持体的材料没有特别限制，例如，优选透明树脂等。
下面说明使用上述试片测定液体试样的肌酸酐量的一个实例。
首先，在上述试片中滴加上述液体试样，反应一定时间。上述液体试样浸透到上述多孔材料内部，由此，上述多孔材料中的上述化合物与金属接触，形成显色络合物。另一方面，当上述液体试样中含有肌酸酐时，上述肌酸酐阻碍上述显色络合物的形成。这样，由于根据上述液体试样中肌酸酐的有无以及含量，多孔膜内部的上述显色络合物的形成量不同，所以此显色络合物的形成的程度即表示肌酸酐的有无或含量。
上述反应条件没有特别限制，例如，反应温度优选10～40℃的范围，更加优选20～35℃的范围；反应时间优选30秒～5分钟的范围，更加优选1～3分钟的范围。再者，当于室温以上的温度下反应时，优选在测定前将试样再放置于室温下。
进行上述反应后，测定上述显色络合物的形成的程度，即通过肌酸酐阻碍上述显色络合物的形成的程度。这可以例如通过光学测定上述试片来进行。另一方面，预先用本发明的试片对已知浓度的肌酸酐标准溶液同样进行光学测定，依据上述测定值和肌酸酐浓度绘制标准曲线。然后，通过将上述液体试样的测定值代入上述标准曲线，可以求出试样的肌酸酐浓度。
作为上述试片的光学测定方法，例如有反射率的测定和吸光度的测定。
由于上述反射率和吸光度的测定波长根据由上述化合物和金属形成的显色络合物的种类而不同，所以，例如可以根据使用的化合物和金属的组合适当确定。例如，在铬天青S与Pd(II)的组合、铬天青B与Pd(II)的组合、铬花青R与Cu(II)的组合或邻苯二酚紫与Cu(II)的组合的场合，测定波长优选560～700nm的范围，更加优选600～670nm的范围，特别优选620～650nm的范围。
(实施例)下面对实施例与比较例一起进行说明。
(实施例1～3)配制下述组成1的混合液50mL、组成2的混合液50mL以及组成3的混合液50mL，在各混合液中浸渍滤纸(厚340mm，商品名为Whatman 3MM ChrWhatman公司生产)。将浸渍后的上述滤纸于50℃下干燥约10分钟后，切成长5mm×宽5mm大小，用双面胶带粘贴在PET薄膜上，将其作为试片。将浸渍组成1的混合液的试片作为实施例1，将浸渍组成2的混合液的试片作为实施例2，将浸渍组成3的混合液的试片作为实施例3。再者，作为上述化合物，使用上述式(6)表示的商品名Eriochrome Cyanine R(Nacalai公司生产)、上述式(4)表示的商品名Chrome Azurol S(Nacalai公司生产)、上述式(5)表示的商品名Chromazurol B(同仁化学公司生产)。
(混合液组成1)硼酸缓冲液(pH9.0)0.5M硫酸铜(II) 3.0mMEriochrome Cyanine R 6.0mM(混合液组成2)柠檬酸缓冲液(pH7.0) 0.5M氯化钯 8mMChromazurol S 15mM聚乙二醇 0.5重量％(混合液组成3)硼酸缓冲液(pH9.0)0.5M氯化铜(II) 3.0mMChromazurol B3.0mM聚乙二醇 0.1重量％(肌酸酐的测定)准备生理盐水、在生理盐水中溶解肌酸酐(Nacalai公司生产)的肌酸酐溶液(50、100和200mg/100mL)，分别作为测定试样。然后，将制作的实施例1～3的上述试片在上述各测定试样中分别浸渍约2秒钟后，取出，于室温下放置1分钟。然后，使用色差计(商品名∑90；村上色彩技术研究所生产)测定这些试片在630nm处的反射率(单位％)。其结果如下述表1和图1所示。图1是显示肌酸酐浓度与反射率的相关关系的图。
(表1)

如上述表1和图1所示，各实施例中的肌酸酐浓度与反射率的相关式为，实施例1“y＝0.107x+25(相关系数r＝0.986)”，实施例2“y＝0.157x+8.6(相关系数r＝0.998)”，实施例3“y＝0.108x+43(相关系数r＝0.999)”。由此可以确认，肌酸酐浓度与根据实施例的试验得到的反射率有良好的相关关系。
(实施例4)准备20个尿样品作为测定试样，预先使用Jaffe法的定量试剂(商品名Creatinine-HA Testwako；和光纯药公司生产)和商品名为日立7070型自动分析装置(日立制作所生产)测定肌酸酐浓度。然后，将实施例2的上述试片在上述测定试样中浸渍约2秒钟后，取出，于室温下放置1分钟。然后，使用色差计(商品名∑90；村上色彩技术研究所生产)测定这些试片在630nm处的反射率(单位％)。
根据上述Jaffe法测定的上述各测定试样的肌酸酐浓度的结果和使用实施例2的上述试片测定的反射率的结果如下述表2和图2所示。图2中，x轴表示用上述自动分析装置测定的各测定试样的肌酸酐浓度(mg/100mL)，y轴表示用实施例2的上述试片测定的各测定试样的反射率(％)。
(表2)

如上述表2和图2所示，确认用上述Jaffe法测定的各测定试样的肌酸酐浓度与由实施例2的上述试片得到的反射率的关系为由相关式“y＝0.201x+7.4(相关系数r＝0.938)”表示的良好的相关关系。
产业上的可利用性如上所述，本发明的肌酸酐测定用试片为使用上述肌酸酐测定用化合物的新型试片，利用肌酸酐阻碍显色络合物的形成，可以容易地测定肌酸酐量。因此，本发明在上述临床医疗等中，对测定作为肾功能指标的肌酸酐有用。
权利要求
1.含有下述式(1)表示的化合物的肌酸酐测定用试片， 上述式(1)中，R1为H、SO3X、COOX；R4和R6可以相同也可以不同，各自为OH、SO3X、COOX；R2、R3、R5和R7可以相同也可以不同，各自为H、OH、Cl、Br、I、NO2、NO、CH3；上述R1、R4和R6中的X可以相同也可以不同，各自为H、Na、K、NH4。
2.根据权利要求1所述的肌酸酐测定用试片，其中上述化合物为下述式(2)表示的化合物， 上述式(2)中，R1为H、SO3X、COOX；R4和R6可以相同也可以不同，各自为OH、SO3X、COOX；R2、R3、R5和R7可以相同也可以不同，各自为H、OH、Cl、Br、I、NO2、NO、CH3；上述R1、R4和R6中的X可以相同也可以不同，各自为H、Na、K、NH4。
3.根据权利要求2所述的肌酸酐测定用试片，其中上述化合物为下述式(3)表示的化合物， 上述式(3)中，R1为H、SO3X、COOX；R2和R3可以相同也可以不同，各自为H、OH、Cl、Br、I、NO2、NO、CH3；上述X可以相同也可以不同，各自为H、Na、K、NH4。
4.根据权利要求1所述的肌酸酐测定用试片，其中上述化合物为下述式(4)表示的化合物，
5.根据权利要求1所述的肌酸酐测定用试片，其中上述化合物为下述式(5)表示的化合物，
6.根据权利要求1所述的肌酸酐测定用试片，其中上述化合物为下述式(6)表示的化合物，
7.根据权利要求1所述的肌酸酐测定用试片，其中上述化合物为下述式(7)表示的化合物，
8.根据权利要求1所述的肌酸酐测定用试片，其中上述化合物含在多孔材料中。
9.根据权利要求1所述的肌酸酐测定用试片，其还含有与上述化合物形成显色络合物的金属或其盐。
10.根据权利要求9所述的肌酸酐测定用试片，其中上述金属为过渡金属。
11.根据权利要求10所述的肌酸酐测定用试片，其中上述过渡金属为Cu(II)和Pd(II)中的至少一种。
12.根据权利要求9所述的肌酸酐测定用试片，其中上述化合物(A)和上述金属或其盐(B)的添加比例(摩尔比A∶B)为30∶1～1∶15。
13.根据权利要求1所述的肌酸酐测定用试片，其还含有缓冲剂。
14.根据权利要求13所述的肌酸酐测定用试片，其中上述化合物(A)和缓冲剂(C)的添加比例(摩尔比A∶C)为1∶10～1∶1000。
15.根据权利要求1所述的肌酸酐测定用试片，其还含有表面活性剂。
16.根据权利要求15所述的肌酸酐测定用试片，其中上述化合物(A)和表面活性剂(D)的添加比例(摩尔比A∶D)为50∶1～3∶1。
全文摘要
本发明提供新型肌酸酐测定用试片。在多孔材料中含有下述式(1)的化合物、与上述化合物形成显色络合物的金属以及缓冲剂，光学测定由上述化合物与上述金属形成的显色络合物，通过测定肌酸酐阻碍上述显色络合物形成的程度来测定肌酸酐的量。下述式(1)中，R
文档编号G01N33/70GK1705883SQ20038010139
公开日2005年12月7日 申请日期2003年10月15日 优先权日2002年10月15日
发明者小坂秀子 申请人:爱科来株式会社