专利名称：精子结合抗体检测试剂及其制备方法
技术领域：
本发明涉及一种生物体外诊断试剂及其制备方法，特别是精子结合抗体检测试剂的制备方法。
背景技术：
免疫性不育是因抗原抗体反应干扰了受孕过程造成的不育，其中较多见的是精子抗体导致的不育。一些研究指出，大约5％～30％不明原因的不育夫妇和50％～70％的输精管结扎男子血清中可检出直接针对精子的精子抗体。大约6.8％～13％以及50％～75％的不育男子和输精管吻合男子精液中可检测出直接针对精子的精子结合抗体。血清中精子抗体达到一定水平时可引起精子凝集、制动，干扰精子运行，抑制精卵结合，致使受精障碍而影响生育力。
检测结合于精子表面的精子结合抗体，是诊断男性免疫性不育，以及男性在接受输精管复育术后，能否恢复生育能力的重要依据。而生殖道局部抗体由于可直接作为一种空间屏障直接干扰受精而影响生育力，因此比较筛选一种既可检测血清精子抗体，又可检测男性生殖道结合抗体的方法十分必要。近来有关精子抗体的临床重要性，影响生育的机制，以及检测精子抗体的方法比较，国内外均有较多的报道。目前应用的抗精子抗体检测方法有精子制动试验(SIT)；精子凝集试验(STAT)；酶联免疫吸附试验(ELISA)；间接免疫荧光试验(IIF)和混合凝集试验(MAR)。唯MAR方法可检测精子表面的结合抗体和体液中存在的抗精子抗体，该方法简便、敏感，且由于不必用预洗过的精子，能检测精子活率低、数目少的样品，出结果快，为WHO推荐用于男性精子抗体检测的首选方法。
目前国内仅有安徽安科生物工程(集团)股份有限公司生产的抗精子抗体检测试剂盒使用MAR法检测抗精子抗体，其产品的专利号为02112511。该试剂包括2-3％的敏化绵羊红细胞悬液，1∶28-1∶210兔抗人IgG，2-3％的敏化绵羊红细胞悬液的制备包括取绵羊血、洗涤、醛化处理、鞣化处理、敏化处理等；1∶28-1∶210的制备包括取家兔血、血清分离等。然而，该制备方法步骤多，并且由于该产品使用动物来源的血细胞，各批次难免有差异，也不能完全排除潜在动物来源病原物质的威胁。而国际生育技术有限公司出售的Sperm Mar TestKit检测精子结合抗体虽灵敏度高，但价格昂贵，不能满足国内需求。

发明内容
本发明的目的即在于克服现有技术的缺点，提供一种大大节约成本、制备方便、性能优良的精子结合抗体检测试剂及其制备方法。
本发明的目的通过以下技术方案来实现精子结合抗体检测试剂，该试剂是由敏化羧化胶乳液、羊抗人丙种球蛋白血清组成的液体型双试剂，敏化羧化胶乳液含有标记人丙种球蛋白的羧化胶乳。
所述敏化羧化胶乳液还包括辅料，辅料包括磷酸盐缓冲液a、磷酸盐缓冲液b、碳化二亚胺、甘氨酸、6-氨基己酸。
敏化羧化胶乳液包含按体积计8～20％的羧化胶乳，优选8～15％的羧化胶乳，更优选12％的羧化胶乳；按重量计0.15～0.25克％的人丙种球蛋白，优选0.20克％的人丙种球蛋白，更优选0.15克％的人丙种球蛋白；磷酸盐缓冲液a的含量为0.1～0.2M、PH值为6.5～8.0；优选为0.2M、PH值为7.2；磷酸盐缓冲液b的含量为0.05～0.15M、PH值为6.7～8.4；优选为0.1M、PH值为7.6；碳化二亚胺的含量为0.38～1.9毫克％；优选为0.96毫克％；6-氨基己酸的含量为0.1～0.66毫克％；优选为0.26毫克％；甘氨酸的含量为22.5～37.5毫克％；优选为30.0毫克。
羊抗人丙种球蛋白血清滴定效价为1∶50～1∶150，优选1∶100。
精子结合抗体检测试剂的制备方法，制备方法包括反应步骤、纯化步骤和保存步骤反应步骤取8～20ml的羧化胶乳，加入88ml的蒸馏水混匀，再加入0.15～0.25克的人丙种球蛋白；在20℃，以500转/min搅拌10小时终止反应；纯化步骤在4～8℃，以5000～6000转/min离心30min，弃上清，沉淀加蒸馏水100ml混匀，在4～8℃，以5000～6000转/min离心20min，弃上清，沉淀加入生理盐水至100ml；保存步骤加入庆大霉素1.0ml混匀，质量检测，分装，4～8℃保存。
精子结合抗体检测试剂的制备方法，反应步骤还可以为取羧化胶乳8～20ml，加入磷酸盐缓冲液a 88ml混匀，再加入碳化二亚胺0.38～1.9毫克％，6-氨基己酸0.1～0.66毫克％，在4～8℃以500转/min搅拌60～90min，在4～8℃，以8000～10000转/min离心20～30min，弃上清，沉淀用磷酸盐缓冲液b 100ml混匀；加入人丙种球蛋白0.15～0.25克％，加入碳化二亚胺0.38～1.9毫克％；在4～8℃，以500转/min搅拌250～300min，加入22.5～37.5毫克％甘氨酸终止反应；所用磷酸盐缓冲液a和磷酸盐缓冲液b分别由A液和B液配置而成，A液的制备方法为将分子量为178.05的磷酸氢二钠(Na2HPO4·2H2O)35.61克溶于1000ml蒸馏水中；该A液浓度为0.2M；B液的制备方法为将分子量为156.03磷酸二氢钠(NaH2PO4·2H2O)31.21克溶于1000ml蒸馏水中；该A液浓度为0.2M；磷酸盐缓冲液a的制备方法为取A液720ml，B液280ml混合即成；磷酸盐缓冲液b的制备方法为取A液435ml，B液65ml，蒸馏水500ml混合即成。
通过上面的叙述可以看出，本发明具有以下优点可满足国内各医院、计划生育部门研究与临床需要，为诊断男性免疫性不育，以及男性在接受输精管复育术后，能否恢复生育能力提供重要依据，具较大的经济价值，它操作简便，快速、敏感、特异。
具体实施例方式
下面结合实施例对本发明做进一步的描述实施例1精子结合抗体检测试剂，该试剂是由敏化羧化胶乳液、羊抗人丙种球蛋白血清组成的液体型双试剂，敏化羧化胶乳液含有标记人丙种球蛋白的羧化胶乳。敏化羧化胶乳液包含按体积计8％的羧化胶乳，按重量计0.25克％的人丙种球蛋白，羊抗人丙种球蛋白血清滴定效价为1∶50。
精子结合抗体检测试剂的制备方法，制备方法包括反应步骤、纯化步骤和保存步骤反应步骤取8ml的羧化胶乳，加入88ml的蒸馏水混匀，再加入0.25克的人丙种球蛋白；在20℃，以500转/min搅拌10小时终止反应；纯化步骤在4℃，以5000转/min离心30min，弃上清，沉淀加蒸馏水100ml混匀，在4℃，以5000转/min离心20min，弃上清，沉淀加入生理盐水至100ml；保存步骤加入庆大霉素1.0ml混匀，质量检测，分装，4℃保存。
实施例2精子结合抗体检测试剂，该试剂是由敏化羧化胶乳液、羊抗人丙种球蛋白血清组成的液体型双试剂，敏化羧化胶乳液含有标记人丙种球蛋白的羧化胶乳。
所述敏化羧化胶乳液还包括辅料，辅料包括磷酸盐缓冲液a、磷酸盐缓冲液b、碳化二亚胺、甘氨酸、6-氨基己酸。
敏化羧化胶乳液包含按体积计20％的羧化胶乳，0.20克％的人丙种球蛋白，磷酸盐缓冲液a的含量为0.1M、PH值为6.5；磷酸盐缓冲液b的含量为0.05M、PH值为6.7；碳化二亚胺的含量为0.38毫克％；6-氨基己酸的含量为0.1；甘氨酸的含量为22.5毫克％；羊抗人丙种球蛋白血清滴定效价为1∶150。
精子结合抗体检测试剂的制备方法，制备方法包括反应步骤、纯化步骤和保存步骤反应步骤取羧化胶乳20ml，加入磷酸盐缓冲液a 88ml混匀，再加入碳化二亚胺1.9毫克％，6-氨基己酸0.66毫克％，在8℃以500转/min搅拌90min，在8℃，以10000转/min离心30min，弃上清，沉淀用磷酸盐缓冲液b 100ml混匀；加入人丙种球蛋白0.25克％，加入碳化二亚胺1.9毫克％；在8℃，以500转/min搅拌300min，加入37.5毫克％甘氨酸终止反应；纯化步骤在8℃，以5000转/min离心30min，弃上清，沉淀加蒸馏水100ml混匀，在8℃，以6000转/min离心20min，弃上清，沉淀加入生理盐水至100ml；保存步骤加入庆大霉素1.0ml混匀，质量检测，分装，8℃保存。
所用磷酸盐缓冲液a和磷酸盐缓冲液b分别由A液和B液配置而成，A液的制备方法为将分子量为178.05的磷酸氢二钠(Na2HPO4·2H2O)35.61克溶于1000ml蒸馏水中；该A液浓度为0.2M；B液的制备方法为将分子量为156.03磷酸二氢钠(NaH2PO4·2H2O)31.21克溶于1000ml蒸馏水中；该A液浓度为0.2M；磷酸盐缓冲液a的制备方法为取A液720ml，B液280ml混合即成；磷酸盐缓冲液b的制备方法为取A液435ml，B液65ml，蒸馏水500ml混合即成。
实施例3精子结合抗体检测试剂，该试剂是由敏化羧化胶乳液、羊抗人丙种球蛋白血清组成的液体型双试剂，敏化羧化胶乳液含有标记人丙种球蛋白的羧化胶乳。
敏化羧化胶乳液还包括辅料，辅料包括磷酸盐缓冲液a、磷酸盐缓冲液b、碳化二亚胺、甘氨酸、6-氨基己酸。
敏化羧化胶乳液包含按体积计12％的羧化胶乳，按重量计0.15克％的人丙种球蛋白；磷酸盐缓冲液a的含量为0.2M、PH值为7.2；磷酸盐缓冲液b的含量为0.1M、PH值为7.6；碳化二亚胺含量为0.96毫克％；6-氨基己酸的含量为0.26毫克％，甘氨酸的含量为30.0毫克。
羊抗人丙种球蛋白血清滴定效价为1∶100。
精子结合抗体检测试剂的制备方法，制备方法包括反应步骤、纯化步骤和保存步骤反应步骤为取羧化胶乳12ml，加入磷酸盐缓冲液a 88ml混匀，再加入碳化二亚胺0.96毫克％，6-氨基己酸0.26毫克％，在4℃以500转/min搅拌60min，在4℃，以8000转/min离心30min，弃上清，沉淀用磷酸盐缓冲液b 100ml混匀；加入人丙种球蛋白0.15克％，加入碳化二亚胺0.96毫克％；在4℃，以500转/min搅拌250min，加入30.0毫克％甘氨酸终止反应；纯化步骤在4℃，以5000转/min离心30min，弃上清，沉淀加蒸馏水100ml混匀，在4℃，以5000转/min离心20min，弃上清，沉淀加入生理盐水至100ml；保存步骤加入庆大霉素1.0ml混匀，质量检测，分装，4℃保存。
所用磷酸盐缓冲液a和磷酸盐缓冲液b分别由A液和B液配置而成，A液的制备方法为将分子量为178.05的磷酸氢二钠(Na2HPO4·2H2O)35.61克溶于1000ml蒸馏水中；该A液浓度为0.2M；B液的制备方法为将分子量为156.03磷酸二氢钠(NaH2PO4·2H2O)31.21克溶于1000ml蒸馏水中；该A液浓度为0.2M；磷酸盐缓冲液a的制备方法为取A液720ml，B液280ml混合即成；磷酸盐缓冲液b的制备方法为取A液435ml，B液65ml，蒸馏水500ml混合即成。
实施例3为本发明的最佳实施例，按实施例3配制的试剂，用于检测。
检测方法如下一、直接法适用于检测精液中精子结合抗体。取10μl待检人新鲜精液和10μl敏化羧化胶乳液于载玻片上混合，再取10μl羊抗人IgG血清充分混匀后盖上盖玻片，置37℃孵育3～5分钟，在200X显微镜下观察结果，一般观察5个视野，计算活动精子结合胶乳颗粒的百分率。
10％～25％的活动精子粘附了胶乳颗粒判为(+)；
25％～50％的活动精子粘附了胶乳颗粒判为(++)；50％～75％的活动精子粘附了胶乳颗粒判为(+++)；＞75％的活动精子粘附了胶乳颗粒判为(++++)；粘附胶乳颗粒的活动精子＜10％判为阴性。
应用直接法检测不育男子(妻子经妇科双合诊，输卵管碘油造影，基础体温测定未发现不育原因)，接受输精管吻合术后1～12月随访到的男子，输精管栓堵不完全和堵后再通男子，禁欲3～7天，取精液作精子结合抗体测定，并与进口Sperm MarTest试剂作了比较，获得满意结果(见表1)。
表1 两种胶乳试剂对不育及输精管吻合后男子精液中结合抗体的检测结果比较(％)

二、间接法适用检测男、女血清和女性生殖道分泌物中的精子抗体。
1.待检血清或生殖道分泌液56℃，30分钟灭活；2.己灭活待检血清或生殖道分泌液用培养液4倍稀释(10uL∶30uL)于小试管中；3.加新鲜液化正常人精液40uL于(B)小试管中，(37℃)保温1小时，以下按直接法进行4.取上述保温后混合物10μl于载玻片上；5.加10μl敏化羧化胶乳液(LatexAg)，并用盖玻片充分混匀；6.加10μl羊抗人IgG抗血清(Latex Ab)亦用盖玻片充分混匀，盖上盖玻片，置(37℃)3～5分钟，在200X显微镜下观察结果。
我们用精子结合抗体检测药盒使用间接法对经精子微量凝集试验(MTAT)和精子制动试验(SIT)检测定为阳性和阴性的部份血清(接受输精管吻合术后患者和不育患者血清)作测定，其比较结果列于表2
表2 间接法检测血清与MTAT，SIT的结果比较

权利要求
1.精子结合抗体检测试剂，其特征在于该试剂是由敏化羧化胶乳液、羊抗人丙种球蛋白血清组成的液体型双试剂，敏化羧化胶乳液含有标记人丙种球蛋白的羧化胶乳。
2.如权利要求1所述的精子结合抗体检测试剂，其特征在于所述敏化羧化胶乳液还包括辅料。
3.如权利要求2所述的精子结合抗体检测试剂，其特征在于，所述辅料包括磷酸盐缓冲液a、磷酸盐缓冲液b、碳化二亚胺、甘氨酸、6-氨基己酸。
4.如权利要求1、2或3所述的精子结合抗体检测试剂，其特征在于，敏化羧化胶乳液包含按体积计8～20％的羧化胶乳；按重量计0.15克％～0.25克％的人丙种球蛋白；磷酸盐缓冲液a的含量为0.1～0.2M、PH值为6.5～8.0；磷酸盐缓冲液b的含量为0.05～0.15M、PH值为6.7～8.4；碳化二亚胺的含量为0.38～1.9毫克％；6-氨基己酸的含量为0.1～0.66毫克％；甘氨酸的含量为22.5～37.5毫克％。
5.如权利要求4所述的精子结合抗体检测试剂，其特征在于，所述的敏化羧化胶乳液包含按体积计12％的羧化胶乳；按重量计0.15克％的人丙种球蛋白；磷酸盐缓冲液a的含量为0.2M、PH值为7.2；磷酸盐缓冲液b的含量为0.1M、PH值为7.6；碳化二亚胺的含量为0.96毫克％；6-氨基己酸的含量为0.26毫克％；甘氨酸的含量为30.0毫克％。
6.如权利要求1所述精子结合抗体检测试剂，其特征在于，羊抗人丙种球蛋白血清滴定效价为1∶50～1∶150。
7.如权利要求1所述精子结合抗体检测试剂，其特征在于，羊抗人丙种球蛋白血清滴定效价为1∶100。
8.权利要求1所述精子结合抗体检测试剂的制备方法，其特征在于，制备方法包括反应步骤、纯化步骤和保存步骤反应步骤取8～20ml的羧化胶乳，加入88ml的蒸馏水混匀，再加入0.15～0.25克的人丙种球蛋白；在20℃，以500转/min搅拌10小时终止反应；纯化步骤在4～8℃，以5000～6000转/min离心30min，弃上清，沉淀加蒸馏水100ml混匀，在4～8℃，以5000～6000转/min离心20min，弃上清，沉淀加入生理盐水至100ml；保存步骤加入庆大霉素1.0ml混匀，质量检测，分装，4～8℃保存。
9.如权利要求8所述精子结合抗体检测试剂的制备方法，其特征在于，反应步骤还可以为取羧化胶乳8～20ml，加入磷酸盐缓冲液a 88ml混匀，再加入碳化二亚胺0.38～1.9毫克％，6-氨基己酸0.1～0.66毫克％，在4～8℃以500转/min搅拌60～90min，在4～8℃，以8000～10000转/min离心20～30min，弃上清，沉淀用磷酸盐缓冲液b 100ml混匀；加入人丙种球蛋白0.15～0.25克％，加入碳化二亚胺0.38～1.9毫克％；在4～8℃，以500转/min搅拌250～300min，加入22.5～37.5毫克％甘氨酸终止反应。
10.如权利要求9所述精子结合抗体检测试剂的制备方法，其特征在于所用磷酸盐缓冲液a和磷酸盐缓冲液b分别由A液和B液配置而成，A液的制备方法为将分子量为178.05的磷酸氢二钠(Na2HPO4·2H2O)35.61克溶于1000ml蒸馏水中；该A液浓度为0.2M；B液的制备方法为将分子量为156.03磷酸二氢钠(NaH2PO4·2H2O)31.21克溶于1000ml蒸馏水中；该A液浓度为0.2M；磷酸盐缓冲液a的制备方法为取A液720ml，B液280ml混合即成；磷酸盐缓冲液b的制备方法为取A液435ml，B液65ml，蒸馏水500ml混合即成。
全文摘要
本发明公开了精子结合抗体检测试剂，其特征在于该试剂是由敏化羧化胶乳液、羊抗人丙种球蛋白血清组成的液体型双试剂，敏化羧化胶乳液含有标记人丙种球蛋白的羧化胶乳。精子结合抗体检测试剂的制备方法，制备方法包括反应步骤、纯化步骤和保存步骤。本发明具有以下优点可满足国内各医院、计划生育部门研究与临床需要，为诊断男性免疫性不育，以及男性在接受输精管复育术后，能否恢复生育能力提供重要依据，具较大的经济价值，它操作简便，快速、敏感、特异。
文档编号G01N33/531GK1790022SQ20051002232
公开日2006年6月21日 申请日期2005年12月19日 优先权日2005年12月19日
发明者张国芬, 孟衍建, 马天根 申请人:孟衍建