专利名称：使用磁性标记进行的肌钙蛋白i测定的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种用于测量样品中的肌钙蛋白I的方法、设备和药筒。本发明还涉及在诊断心肌梗死过程对这种方法、设备和药筒的使用。
背景技术：
在诊断心肌梗死中，测量血液中的肌钙蛋白I是重要的步骤。对肌钙蛋白I的最先进的生物分析是基于利用发光检测进行的实验室高灵敏度的非均相免疫测定。这涉及从化学反应发射光，或者发射标记的可视化。使用这种免疫测定得到pg/mL量级的免疫测定灵敏度。一般地，在针对高处理量测量而设计的大型自动检测系统上执行这些测定，并且这些测定并不适合于由非技术用户在中央实验室以外进行快速测试。在现有技术中已知将磁性标记用作检测标记的免疫测定。这种测定实现磁性致动并且减少测定时间。在这些测定中，磁性标记由于其的大尺寸而被空间位阻，并且不像分子标记(例如，放射性碘、酶标记等)那样容易地与具有分子受体的表面结合。另外，由于标记在测定期间被磁化，因此标记之间接触的持续时间增加，这提高了磁性标记不可逆地聚集以及丢失定量信息的概率。当使用更大的磁性粒子(> 200nm)时，这可能成为严重的问题，因为更大的磁性粒子更易于形成不可逆的群聚。

发明内容
本发明的目的在于提供用于测量样品中的肌钙蛋白I的灵敏且快速的方法。该目的是通过用于测量样品中的肌钙蛋白I的方法实现的，该方法至少包括以下步骤-提供样品-使样品接触与磁性标记耦合的抗肌钙蛋白I单克隆抗体-使样品接触与传感器表面耦合的抗肌钙蛋白I多克隆抗体，或者接触与传感器表面耦合的至少两种不同的抗肌钙蛋白I抗体-检测传感器表面上的磁性标记其中，步骤b和c能够以任意次序执行。下文中“抗肌钙蛋白I多克隆抗体”意在包括抗肌钙蛋白I多克隆抗体和至少两种不同抗肌钙蛋白I抗体这两者。“以任意次序”包括使样品同时接触抗肌钙蛋白I单克隆抗体和多克隆抗体。优选地，步骤b在步骤c之前。该步骤顺序改进了测定结合，因为与磁性标记耦合的抗肌钙蛋白I单克隆抗体相对于与传感器表面耦合的抗肌钙蛋白I多克隆抗体具有更多的自由度。该实施例使得测定时间减少。本发明提供针对肌钙蛋白I的快速免疫测定试验，其允许利用小的样品体积在5 分钟内进行对肌钙蛋白I的灵敏检测。由于附着到其相应表面的一抗和二抗的移动性降低导致相对大尺寸的标记与大块传感器表面的结合是具有挑战性的。
在溶液中工作良好并且由抗体供应商推荐的肌钙蛋白I的抗体不会在1步磁性标记测定中产生高信号。在不希望受到该理论的约束的情况下，造成这一点的原因可能是由于对于在磁性标记测定中使抗体为进行结合而最优地取向而言，需要更严格的条件。与供应商数据表针对肌钙蛋白I测定推荐的抗体耦合相比，与磁性标记耦合的抗肌钙蛋白I单克隆抗体和与传感器表面耦合的抗肌钙蛋白I多克隆抗体的组合给出改进的结果。在优选实施例中，磁性标记是包括无机材料，或者诸如聚合物基质中的氧化铁细粒的无机材料和有机材料的组合的粒子。使用磁性标记实现了磁性致动，加速测定的反应动力学。另外，使用磁性标记促进了通过磁场优选结合梯度移除未复合到传感器表面的与抗肌钙蛋白I单克隆抗体结合或未结合的任何标记。该实施例不再需要额外的冲洗步骤以识别针对背景结合的特定信号。在优选实施例中，所使用的磁性标记具有200至IOOOnm的尺寸。该尺寸范围下的粒子允许最优的测定条件和检测。在另一优选实施例中，所使用的抗肌钙蛋白I多克隆抗体是抗肌钙蛋白I山羊多克隆抗体。使用山羊多克隆抗体得到优化的测定结果。在另一实施例中，磁性标记以光学方式进行检测，优选通过受抑全内反射(FTIR) 进行检测。在又一实施例中，磁性标记以磁性方式进行检测。另外地或备选地，设想能够基于第二磁性标记或第二非磁性标记的存在而检测磁性标记。该第二标记能够直接附着于磁性标记，或者间接地通过分析物结合到该磁性标记。 非磁性标记能够经由无机或有机成份在磁性标记外部附着于磁性标记，或者能够并入到磁性标记中。在本发明背景下，合适的第二标记为在体外测定中典型使用的那些标记，例如但不限于发色基团、放射性标记、场致发光标记、化学发光标记、磷光标记、荧光标记或反射标记。本发明的目的还通过能够根据本发明的方法测量肌钙蛋白I的生物传感器设备实现。另外，本发明的目的通过在测定设备中使用的药筒实现，该药筒包括-与磁性标记结合的抗肌钙蛋白I单克隆抗体-在药筒内与传感器表面结合的抗肌钙蛋白I多克隆抗体-样品入口优选地，药筒中的磁性标记具有200至IOOOnm的尺寸。在药筒的优选实施例中，抗肌钙蛋白I多克隆抗体是山羊多克隆抗体。本发明将通过具体实施例并参考附图进行描述，但本发明不限于此。不应将权利要求中的附图标记解释为限制范围。所描述的附图仅为示意性的而非限制性的。在附图中， 出于图解说明的目的，某些元件的尺寸被放大，且并非按照比例绘制。在本说明书和权利要求中使用“包括” 一词处，不排除其他元件或步骤。当指代诸如“一”或“一个”、“该”的单数名词而使用的不定冠词或定冠词处，除非另有详细说明，否则其包括多个该名词。另外，在说明书和权利要求中的“第一”、“第二”、“第三”等术词用于区分相似元件，而并非必须用于描述顺序或时间次序。将理解的是，在适当情况下，如此使用的术语是可互换的，并且这里描述的本发明的实施例能够以这里描述或图解说明以外的其他顺序操作。提供以下术语或定义仅为了辅助理解本发明。不应这些定义解释为具有比本领域技术人员所理解的范围更小的范围。


图1为根据本发明的测定的示意性表示；图2为肌钙蛋白I的剂量响应曲线。
具体实施例方式本发明公开了一种用于通过免疫测定检测肌钙蛋白I，优选为哺乳动物肌钙蛋白 I，更优选为人类肌钙蛋白I的方法。测定使用两种不同的抗体，与磁性标记耦合的抗肌钙蛋白I单克隆抗体以及与传感器表面耦合的抗肌钙蛋白I多克隆抗体。图1示出了根据本发明的测定的示意性设置。 在图IA中，潜在包括肌钙蛋白I(I)的样品接触与磁性标记(3)耦合的抗肌钙蛋白I单克隆抗体O)。样品还接触与传感器表面( 耦合的抗肌钙蛋白I多克隆抗体G)。抗肌钙蛋白I单克隆和多克隆抗体被选择为使得感兴趣分析物，即在当前情况下的肌钙蛋白I，能够同时结合到抗肌钙蛋白I单克隆和多克隆抗体。如果样品中存在肌钙蛋白I，则在传感器表面上形成包括与传感器表面耦合的多克隆抗体、肌钙蛋白I和与磁性标记耦合的单克隆抗体的复合物(6)。这在图IB中示意性示出。优选地，在移除包括并非经由肌钙蛋白I特异性复合至所述表面的磁性标记或任何裸磁性标记的抗肌钙蛋白I单克隆抗体之后，确定在传感器表面上存在肌钙蛋白I的量。在以下部分中描述本发明的要素。^^根据本发明的单克隆抗体也包括来自单克隆抗体的Fab片段、适体、亲和体、scFv 片段以及本领域技术人员已知的任何其他单表位结合部分(moiety)。根据本发明的多克隆抗体也包括来自多克隆抗体的Fab片段以及本领域技术人员已知的具有可变结构的结合部分的任何组。在优选实施例中，根据本发明的抗体针对肌钙蛋白I分子的氨基酸序列30-110， 更优选地80-110。这是分子的稳定部分。优选地，所选择的表位不与用于肝素结合的已知区域重叠，肝素结合将导致来自肝素样品的干扰。优选地，从包括以下的组中选择抗肌钙蛋白I单克隆抗体克隆A34500(与肌钙蛋白I的氨基酸87-91结合)、8I-7(a34780，与肌钙蛋白I的氨基酸136-154结合)、 A34650(与肌钙蛋白I的氨基酸41-49结合)、267 (abl4530，与肌钙蛋白I的氨基酸169-184 结合)、16All(a24460，与肌钙蛋白I的氨基酸87-91结合)、19C7 (al9615，与肌钙蛋白I的氨基酸41-49结合)、560 (与cTnl的氨基酸83-93结合)或者其组合。使用这些克隆使得根据本发明的磁性免疫测定的灵敏度得以改善。涂覆程序对测定中使用的磁性标记是特异性的。能够使用本领域技术人员已知的 Ademtch协议。在该协议中，在存在EDC(1-乙基-3-(3-二甲氨基)-碳二亚胺)的情况下， 将例如20ug抗体/mg磁性标记浓度的单克隆抗体耦合至羧基磁性标记。根据本发明的传感器表面利用多克隆抗体而功能化。多克隆抗体是优选的，这是因为用于结合肌钙蛋白I的自由度，特别是当与具有磁性标记的抗肌钙蛋白I单克隆抗体结合时，是有限的。一个优势在于，由于不同类型的抗体多克隆导致在表面上固定的多克隆抗体的取向可变性这一结果。通过利用针对不同表位的多克隆抗体来增加合适的结合位点的量，从而使得测定结果得以优化，能够提出进一步的优势。由于有利的结果，更优选是对于肌钙蛋白I特异的山羊多克隆抗体。在又一实施例中，将对于肌钙蛋白I特异的额外抗体，或者对于肌钙蛋白I特异的若干抗体的混合物涂覆到传感器表面。优选地，所述额外抗体是单克隆抗体。在本发明的另一实施例中，表面涂覆有至少两种、甚至更优选地至少三种不同的抗肌钙蛋白I单克隆抗体或抗肌钙蛋白I单克隆抗体的混合物。由于存在针对一个以上表位的结合位点，这也导致受体上“多克隆”抗体表面。这种情况与涂覆多克隆抗体在功能上是相似的。例如，能够通过喷墨打印PBS中大约150ug/mL浓度的液滴(例如，2nL)而将抗体涂覆在传感器表面上。磁件标记在本发明中，抗肌钙蛋白I单克隆抗体被耦合至包括磁性元素的磁性标记，所述磁性元素允许经由磁体在测定设备中操纵所标记的抗体。在本发明背景下使用的磁性标记的性质并非至关重要。合适的磁性标记包括完全无机的标记以及为无机材料和有机材料(例如，聚合物)的混合物的标记。可以从例如Dynal，Estapor, Seradyn商业上获得磁性标记，并且将其广泛用于可以从若干诊断公司获得的生物分析中。能够利用本领域中描述的方法执行将根据本发明的抗肌钙蛋白I单克隆抗体附着到磁性标记的表面。例如，磁性标记可以携带诸如羟基、羰基、乙醛或氨基基团的一个或多个功能基团。一般地，可以通过处置未涂覆的单分散、超顺磁性标记来提供这些基团，从而提供携带有这种功能基团中的一个的聚合物的表面涂覆，例如，聚氨酯连同聚乙二醇以提供羟基基团，或者纤维素衍生物以提供羟基基团，丙烯酸或甲基丙烯酸的聚合物或共聚物以提供羧基基团，或者氨烷基化聚合物以提供氨基基团。美国专利46M267描述了引入许多这种表面涂覆。可以通过根据US4336173、US4459378以及US4654267修改标记来制备其他涂覆的磁性标记。例如，能够利用HNO3处置大网络多孔聚合物粒子以将-NO2基团引入到孔的表面处，所述大网络多孔聚合物粒子由苯乙烯-二乙烯苯制备并且具有3. 15μπι 的直径。然后使粒子分散在狗的水溶液中。！^2+被NO2基团氧化，这导致孔内部不溶性铁氧-羟基化合物的析出。加热之后，铁作为精细分割的磁性氧化铁细粒存在于整个多孔粒子的体积中。通过与狗的反应，NO2基团被还原成NH2基团。为了填充孔以及在表面处引入期望的功能基团，令不同的单体在孔中以及在表面处聚合。在优选类型的粒子的情况下， 表面携带通过(CH2CH2O)8,链接与聚合物骨架连接的OH基团。其他优选粒子携带通过甲基丙烯酸的聚合而获得的-COOH基团。例如，最初在粒子中出现的冊2基团可以与双环氧按照 US4654267中描述地进行反应，随后与甲基丙烯酸反应以提供末端乙烯基。与甲基丙烯酸的溶液共聚产生携带末端羧基的聚合物涂层。相似地，能够通过使具有以上与双环氧反应的产物再与二氨反应来引入氨基基团，而与诸如氨基甘油的羟胺的反应引入羟基。生物活性分子与粒子的耦合可能是不可逆的，但通过使用链接分子在标记与生物活性分子之间进行交联，该耦合也可能是可逆的。这种链接的例子包括具有某种蛋白识别位点的缩氨酸、具有某种限制性内切酶的识别位点的寡核苷酸、诸如抗生蛋白链菌素/生物素的结合配偶体或者诸如那些包括可还原二硫化物基团的化学可逆交联基团。能够从Pierce Biotechnology 公司(Rockford，IL，USA)获得各种可逆交联基团。商业上可获得的磁性标记具有从纳米到微米范围的各种尺寸。当考虑在高灵敏度测定中采用的磁性标记尺寸时，加重对反效应(counteracting effect)是重要的。标记越大，每次结合事件的信号越大。另外，大的磁体标记暗示着更多的磁性内容，这继而允许针对给定的磁场施加大的磁力。这允许以更大的速度收集标记，并且以更大的速度使标记移动通过溶液。另一方面，大的磁性标记具有不可逆聚集的趋势，并且当它们结合到表面时，更容易被空间位阻。另外，大标记降低动态范围以及测定的数量， 这是因为对于较大的标记在传感器表面上的标记的包数量是有限的。针对高灵敏度和高速度，我们发现最优的磁性标记尺寸介于200至IOOOnm之间。根据本发明，利用500nm的磁性标记，我们能够以5分钟测定获得IpM L0D。腿这里使用的术语“传感器表面”指的是抗体能够与之耦合的表面，并且允许在其附近检测标记的表面。通常，检测表面是固体均勻表面。检测表面能够是传感器表面，即检测所涉及的表面。或者，传感器能够位于附近，例如，检测表面以下，从而允许检测靠近检测表面出现的标记。图解说明了利用不同检测技术检测样品中肌钙蛋白I浓度，但本发明不限于此。在本发明的方法所使用的设备中，抗肌钙蛋白I多克隆抗体所结合的检测表面通常是特殊衍生表面，分子，更具体地抗体或其功能片段能够结合于该表面。合适的表面例子包括玻璃、金属、塑料、有机晶体或无机晶体(例如，硅)、无定形有机材料或无定形无机材料(例如，氮化硅、氧化硅、氮氧化硅、氧化铝)。合适的表面材料及链接化学对于本领域技术人员而言是已知的，并且例如在以下中进行了描述A. M. Usmani 禾口 N. Akmal 的"Diagnostic Biosensor Polymers，，，American Chemical Society, 1994symposium Book Series 556, Washington DC，USA，1994 ；由 Y. Lvov 禾口 H. Mhwald 编辑的"Protein Architecture, Interfacing Molecular Assemblies and Immobilization Biotechnology，，(Marcel Dekker, New York, 2000) ；David Wild 的"The Immunoassay Handbook” (Nature Publishing Group, London,2001, ISBN 1-56159-270-6)或者 Kress-Rogers 的“Handbook of Biosensor and Electronic Noses. Medicine, Food and Environment" (ISBN 0-8493-8905—4)。 $ Angenendt ·入(2002 ；Anal Biochem. 309, 253-260)中公开了用于将蛋白质耦合到涂覆和非涂覆塑料的载体(support)以及玻璃载体。适合在本发明的方法、系统和设备中使用的检测装置为能够检测诸如但不限于磁信号、磁致电阻、霍尔效应、光学信号(反射、吸收、散射、荧光、化学发光、RAMAN，FIlR等) 的相关信号的检测装置。这种光学标记是本领域技术人员已知的，并且包括荧光染料，例如5-(和6_)羧基-4'，5' -二氯-2'，7' -二甲氧基荧光素；5-羧基-2'，4'，5'， 7'-四氯荧光素和5-羧基荧光素；罗丹明染料，例如5-(和6_)羧基罗丹明、6-羧甲基罗丹明和6-羧基罗丹明X ；酞菁，例如甲基酞菁、亚硝酰基酞菁、磺酰基酞菁以及氨基酞菁；偶氮染料；甲亚胺；青色素及黄嘌呤，例如甲基衍生物、硝基衍生物、磺酰基衍生物及氨基衍生物；以及琥珀酰荧光素。其他合适的标记为来自包括菁二聚体和单体的组的荧光团，例如 Τ0Τ0、YOYO、TO-PRO, Cy3、Cy5、Cy5. 5、Cy7等，或者诸如LCRed 705的染料可以用作荧光染料。在具体实施例中，检测装置能够检测声学信号(石英晶体微天平OiCM)、表面声波 (SAW)或者体声波(BAW)等)。这种声学信号可以由诸如脂质体、胶束或气泡的囊泡生成。 这种囊泡可以填充有液体、气体、气态前体和/或固体或溶质材料。根据待检测信号的性质，检测表面可以是检测装置的整体的一部分(传感器表面)，或者能够允许检测其表面上存在的磁性标记。在一个例子中，将诸如发光或荧光标记的放射性标记嵌入或附着到所使用的标记中。能够使用辐射源完成对荧光标记的激励，例如经由聚焦激光束或经由渐逝场激励，以实现对这种标记的光学检测。检测能够以任何合适的方式进行，例如使用共焦检测或者使用高NA透镜。使用荧光标记使得能够通过利用不同荧光团而进行复用，所述荧光团在激励和 /发射波长上是不同的。也能够通过表面增强共振拉曼光谱(SERRQ完成光学检测。SERRS是一种通过吸收被光学标记有诸如银粒子的胶质标记的分子或核素检测分子或核素的超灵敏方法。光学标记是当胶质粒子以受控方式群集时引起等离子体和染料共振的合适的染料分子(例如罗丹明)。例如，已知磁性标记与金属涂覆共存。例如，若抗原(靶标，即抗体与之结合)与这种银涂覆磁性标记耦合，同时抗原也与合适的染料耦合，则抗原特异性抗体将导致染料与银涂覆磁性标记的链接。磁性致动将导致群集/柱形物的形成，这将导致染料共振。能够在渐逝场中致动至非结合传感器表面之后检测到SERRS。在这种设置中，能够在单腔室中完成抗体检测而省略流体冲洗步骤，因为检测是表面特异性的，并且不受到来自溶质中未结合染料的干扰。在另一例子中，可以使用例如霍尔传感器、诸如GMR、TMR或AMR传感器的磁致电阻传感器的磁性传感器。在具体例子中，磁性感测可以利用针对所施加的AC磁场可以使用特定频率这一事实。在低频率段中，即在例如低于IOOHz的频率下，磁性传感器元件的Ι/f噪声占主导。Ι/f噪声由电流点到点的波动引起，并且与频率的逆成比例。在磁致电阻传感器中，Ι/f噪声起源于自由层中的磁性波动。当所生成的AC磁场的频率为IOOHz或以上时，与现有技术相比，主导的Ι/f噪声显著降低，从而使得信噪比(SNR)得以改善。AC磁场的频率进一步增加到热白(Nyquist)噪声水平超越Ι/f噪声水平而变成主导的值是有利的。如在TO 2005/010542中提及地，在某一角频率f。 50kHz以上，GMR传感器的热白噪声变成主导。白噪声水平制约了理论上可达到的检测极限。如上提及地，能够利用本领域中已知的任何直接或间接方法在检测表面对磁性标记进行检测。具体检测方法基于诸如GMR的标记的磁性属性，或者基于磁性标记的光学属性，例如，利用受抑全内反射(FTIR)进行的检测。在Nellissen等人Q007)于proceedings of the 15th European Microelectronics and Packaging Conference 第 210—204 页中描述的，或De Boer等人Q007)于Biosens. Bioelectron. 22，9_10中描述的集成到一次性流动池(flow-cell)药筒中的小型化GMR传感器芯片适合于执行本发明的方法，并且能够检测1500 μ m2芯片表面上三个300nm标记的标记密度。
药筒在本发明的实施例中，在药筒内存在结合至磁性标记的抗肌钙蛋白I单克隆抗体和结合至传感器表面的抗肌钙蛋白I多克隆抗体。由于在药筒内已经存在用于测定的试剂，因此用户仅需要经由样品入口添加样品流体，这使试剂和标记重新分散以产生预期的缓冲情况。干燥的试剂优选地包括对于测定必需的缓冲成份以及具有抗肌钙蛋白I单克隆抗体的磁性标记。干燥试剂的成份能够分别在药筒中的不同位置处或在相同位置处一起沉积且烘干。试剂能够经由包括冻干法的若干干燥技术进行沉积。冻干法防止晶体的形成， 并且允许试剂干燥成在添加流体时容易被重新分散的非晶质玻璃态。药筒优选地适合于对磁性标记进行光学检测。牛物传感器设备根据本发明的实施例，通过利用生物传感器设备来确定样品中肌钙蛋白I的存在或浓度。生物传感器设备应该包括反应室，该反应室用于使样品接触与磁性标记耦合的抗肌钙蛋白I单克隆抗体以及与传感器表面耦合的抗肌钙蛋白I多克隆抗体。在该腔室中， 应该促进肌钙蛋白I同与磁性标记耦合的抗肌钙蛋白I单克隆抗体及与传感器表面耦合的抗肌钙蛋白I多克隆抗体两者的结合。反应室优选地是药筒的一部分，以促进生物传感器设备的方便使用。在本发明所述方法的具体实施例中，通过磁性致动实现抗原-抗体相互作用的优化；在测定期间向携带第一抗肌钙蛋白I抗体的磁性标记施加朝检测表面指向的磁场和/ 或脉冲致动力，以确保与检测表面的优化接触。能够以多种方式操纵磁性标记以优化与固定抗体的接触。在具体实施例中，如下执行测定中的磁性致动。在第一步中，具有单克隆抗体的标记在“收集”步骤中被快速吸引到传感器表面。 通过在传感器表面方向上施加磁场而确保这一步。在具体实施例中，磁场确保磁性标记已经到达传感器表面，例如达到该表面上至少50%、75%或90%的单层膜形成，优选100%的单层膜形成。在第二步中，移除磁力，并且允许标记以基本无障碍的平移自由度及旋转自由度移动通过表面。一段时间后，发生扩散，并且在具体实施例中，设想到再次施加第一步的定向磁场。能够重复若干次这些步骤，以确保具有结合至单克隆抗体的肌钙蛋白I的所有磁性标记结合至检测表面上的多克隆抗体。通过磁场开/关的交替，获得脉冲致动。在这里设想的磁致动情况的备选实施例中，在检测表面处的旋转和平移不仅仅是在缺少磁场情况下的被动扩散的结果，而通过施加一个或多个磁场而被主动地确保，这种磁场施加确保磁性标记在检测表面上的移动。在具体实施例中，通过标记的脉冲致动确保磁力能够使磁性标记在检测表面上运动。这可能涉及例如交变与检测表面垂直的磁场方向或与检测表面平行的磁场方向或具有不同取向的不同场的组合。在WO 2007129275中描述了这种方法。基于标记尺寸设计每个脉冲的时间和持续时间，以便最优地允许标记在结合表面上经历绕其轴进行至少一次完全旋转。在具体实施例中，致动力基本与表面垂直，因为与传感器表面平行的强力能够移除特异性结合的磁性标记。在这里描述的方法中，任选地设想在通过磁性致动使磁性标记与检测表面接触之后，施加将标记远离检测表面引导的磁力，以确保移除未结合标记。以这种方式，不再需要用于移除磁性标记的额外的冲洗步骤。已经发现，涉及交替有磁性标记在检测表面上的平移和旋转移动的脉冲致动的方法比仅涉及将标记吸引到检测表面的恒定磁力的方法显著地更加有效。脉冲致动也降低了标记不可逆地聚集的概率，因为标记彼此接触的时间量也减少了。优选的致动方案包括样品与药筒及磁性标记大约1分钟的培育，其后是利用顶部线圈的大约4分钟的脉冲致动和大约10秒的标记移除。MM这里广义上使用“样品” 一词，并且旨在包括广范围的生物材料以及从这种生物中获得或提取的合成物。样品可以是其中有待检测的靶标肌钙蛋白I的任何合适的制备品，优选血液。样品可以包括例如身体组织或流体，例如但不限于血液(包括血浆及其他成分)、脊髓液、粘液、痰、唾液、精液、粪便或尿液或其任何部分。示范性例子包括全血、红血细胞、白血细胞、血沉棕黄层、头发、指甲和表皮材料、包括颊粘膜拭子、咽拭子、阴道拭子、尿道拭子、宫颈拭子、直肠拭子、病变拭子、脓肿拭子、鼻咽拭子、鼻拭子等的拭子、淋巴液、羊水、脑脊液、腹腔积液、胸腔积液、来自囊肿的流体、滑液、玻璃状液、水样液、囊液、洗眼液、 眼分泌物、血浆、血清、肺灌洗、肺积水、身体中任何组织的活检材料。技术人员将意识到从任何以上示范性生物样品中获得的溶解产物、提取物或材料也可被视为样品。包括外植材料、原发细胞、次生细胞系等的组织培养细胞，以及从任何细胞、组织或器官获得的溶解产物、提取物、上清液或材料也在这里所使用的生物样品一词的含义内。这里列举并非旨在是穷举的。在本发明的具体实施例中，对样品进行预处置以促进利用检测方法对样品的检测。例如，设想通常对样品进行预处置以得到半分离或分离的靶标肌钙蛋白I。许多用于预处置各种类型样品的方法和工具是可获得的。在本发明的具体实施例所涉及的方法中，用于优化肌钙蛋白I的检测的一个或多个不同情况可以进行组合。在另一具体实施例中，改善肌钙蛋白I的检测的所有上述情况可以进行组合。体现本发明的设备、药筒及方法的其他布置对于本领域技术人员是显而易见的。将理解的是，尽管这里已经针对根据本发明的设备和药筒讨论了优选实施例、特定构造和配置以及材料，但是可以在形式和细节上做出各种变化或修改而不脱离本发明的范围和精神。例子通过利用根据本发明的方法针对肌钙蛋白I确定剂量响应曲线。在图3中示出了结果。在药筒中使用的抗肌钙蛋白I多克隆抗体是山羊多克隆抗体，其已经以PBS中150ug/ mL抗体浓度被喷墨打印到聚合物传感器表面上。500nm COOH磁性标记为具有来自Ademtech SA的粒子涂覆的氧化铁粒子，被20ugA34780 (359P)，克隆81-7抗体/mg磁性粒子的溶液功能化，并且在PBS中的5% BSA稀释。肌钙蛋白I标准(Hytest 8T62)被稀释到40%人血清的PBS中。磁性标记和肌钙蛋白I溶液以1 :1稀释，并且IuL被曝露于传感器表面。使用包括利用顶部线圈的4分钟脉冲致动及IOs标记移除的致动协议。
权利要求
1.一种用于测量样品中的肌钙蛋白I的方法，其至少包括以下步骤a.提供样品b.使所述样品接触与磁性标记耦合的抗肌钙蛋白I单克隆抗体c.使所述样品接触与传感器表面耦合的抗肌钙蛋白I多克隆抗体，或者接触与传感器表面耦合的至少两种不同的抗肌钙蛋白I抗体d.检测所述传感器表面上的所述磁性标记， 其中，能够以任意次序执行步骤b和C。
2.如权利要求1所述的方法，其中，步骤b在步骤c之前。
3.如权利要求1或2所述的方法，其中，所述磁性标记是包括无机材料或者无机材料和有机材料的粒子。
4.如权利要求1至3中的任一项所述的方法，其中，所述磁性标记具有200至IOOOnm 的尺寸。
5.如权利要求1至4中的任一项所述的方法，其中，通过利用磁场和磁场梯度，从所述传感器表面移除与未复合到所述传感器表面的磁性标记结合的抗肌钙蛋白I抗体。
6.如权利要求1至5中的任一项所述的方法，其中，所使用的抗肌钙蛋白I多克隆抗体是山羊多克隆抗体。
7.如权利要求1至6中的任一项所述的方法，其中，所述磁性标记以光学方式进行检测。
8.如权利要求1至7中的任一项所述的方法，其中，所述磁性标记以磁性方式进行检测。
9.一种能够根据如权利要求1至8中的任一项所述的方法测量肌钙蛋白I的生物传感器设备。
10.一种在测定设备中使用的药筒，其包括a.与磁性标记结合的抗肌钙蛋白I单克隆抗体b.与传感器表面耦合的抗肌钙蛋白I多克隆抗体，或者与传感器表面耦合的至少两种不同的抗肌钙蛋白I抗体，以及c.样品入口。
11.如权利要求10所述的药筒，其中，所述磁性标记为包括无机材料或者无机材料和有机材料的粒子。
12.如权利要求10或11所述的药筒，其中，所述磁性标记具有200至IOOOnm的尺寸。
13.如权利要求10至12中的任一项所述的药筒，其中，所述抗肌钙蛋白I多克隆抗体是山羊多克隆抗体。
14.如权利要求1至8中的任一项所述的方法、如权利要求9所述的设备或如权利要求 10至13所述的药筒在诊断心肌梗死过程中的用途。
全文摘要
本发明涉及一种用于测量样品中的肌钙蛋白I的方法，包括步骤提供样品；使样品接触与磁性标记耦合的抗肌钙蛋白I单克隆抗体；使样品接触与传感器表面耦合的抗肌钙蛋白I多克隆抗体；以及检测传感器表面上的磁性标记。本发明还涉及一种用于测量样品中的肌钙蛋白I的设备及药筒。
文档编号G01N33/68GK102257391SQ200980151675
公开日2011年11月23日 申请日期2009年12月15日 优先权日2008年12月22日
发明者D·W·C·德克斯, J·L·M·维瑟斯, M·F·W·C·马滕斯, P·德基维特, R·坎普斯, T·H·埃弗斯, W·U·迪特默 申请人:皇家飞利浦电子股份有限公司