专利名称：：光激化学发光免疫检测方法
技术领域：
：本发明涉及光激化学发光技术。
背景技术：
：光激化学发光技术是一种以高分子微粒为基础的化学发光技术，它可以通过感光微粒和发光微粒在一定距离范围内结合，产生离子氧能量传递，发出光信号，从而对待测样品进行检测。感光微粒是填充有感光化合物的高分子微粒，发光微粒是填充有发光化合物和镧系元素的高分子微粒。光激化学发光技术的核心原理是能量的近距离转移，转移的介质是高能态的离子氧。当红色激光照射感光微粒后，释放单线态氧离子(4ps)，其传播距离为200nm左右，只有当感光微粒和发光微粒的距离足够接近的情况下，感光微粒释放的单线态氧离子才能到达发光微粒，从而产生一系列化学反应，发射出520620nm高能级的光，由于反应体系中，微粒的浓度很低，碰撞几率非常小，因此本底信号微弱，只有感光微粒和发光微粒通过免疫反应结合以后，才会发射出明显的光，因此系统灵敏度很高。相对于传统的酶联免疫分析方法，它具有均相(免冲洗)、灵敏度高和操作简便等特点，并且易于实现自动化，因此其应用前景十分广阔。本发明正是针对以上技术原理进行了深入的研究，开发出了以上技术原理的应用条件，确定了激发光最优化激发功率及波长，发射光光源的最优化检测波长，发射光最优化检测延迟时间。
发明内容本发明的目的是提供一种光激化学发光免疫检测方法，从多方面对其检测条件进行优化。本发明公开了一种光激化学发光免疫检测方法，包括下列步骤-a.以620-700nm的激发光照射含有发光微粒及感光微粒的反应溶液；b.检测反应溶液的发射光量，发射光的检测波长为450-650nm。上述步骤a以激发光照射反应溶液到步骤b检测反应溶液发光量之间有一检测延迟时间，其范围为10ms-1000ms。上述步骤a以激发光照射反应溶液的时间为50ms-2000ms;优选200ms-1800ms,激发最佳为500-1000ms。较佳的，上述激发光的波长范围为640-680nm，优选660咖，发射光的检测波长范围为610-620nm，优选615nm。较佳的，激发光光源的功率范围为5-lOOmw，优选40-60mw。上述发光微粒及感光微粒包被有抗原或抗体。上述发光微粒是指填充有发光化合物和镧系元素化合物的高分子微粒。发光化合物可以是Dioxene(二氧杂环己烯)或thioxene(二甲基噻吩)的衍生物等，镧系元素化合物可以是Eu(TTA)3/T0P0或Eu(TTA),/Phen等，该微粒可由市场上购得。发光微粒的表面官能团可以是任何能联接蛋白质的基团，如羧基，醛基，胺基，环氧乙基或卤代烷基等各种已知的可连接蛋白质的官能团。上述感光微粒是填充有感光化合物的高分子微粒，在红色激光激发下，可以产生单线态氧离子。当其与发光微粒距离足够近的情况下，单线氧离子传递到发光微粒，与发光微粒中的发光化合物反应，产生紫外光，紫外光再进一步激发镧系元素化合物，产生一定波长的光子。感光化合物可以是酞菁染料等，该微粒也可由市场上购得。上述反应溶液的溶剂可以是常规的适合抗原抗体反应的溶剂体系，如HEPES缓冲体系或Tris缓冲体系。溶剂中还可添加起封闭和蛋白保护作用的物质如BSA以及防止微粒聚集的稳定试剂如Tween20，出于对试剂防腐以及长期储存的考虑还可在溶剂中添加防腐剂，如庆大霉素和Proclin300。本发明的关键在于，经过研究光激化学发光免疫检测方法中激发光、发射光、检测时间等选择条件，给出了相应参数合适检测的选择范围，及优选的参数范围，从而使得光激化学发光免疫检测方法的可控性更强，灵敏度及精确度得到进一步地提高。上述光激化学发光免疫检测方法可以有多种应用，如用于生物活性物质的定性或定量检测。在生物活性物质定性或定量检测中，可采用双抗体夹心法。即可将发光微粒包被抗原或抗体，而后将待测抗体或抗原，与标记蛋白(如生物素)标记的抗原或抗体一起进行孵育反应，再与包被有抗标记物(如亲和素)的感光微粒混合孵育获得反应液，所谓抗标记蛋白即为可与标记蛋白特异性结合的蛋白，而后采用前述条件进行激发光照射并检测发射光量，从而达到定性或定量检测目的。反之亦可，即将感光微粒包被抗原或抗体，而后待测抗体或抗原，与标记蛋白标记的抗原或抗体一起进行孵育反应，再与包被有抗标记蛋白的发光微粒混合孵育，而后采用前述条件进行激发光照射并检测发射光量。上述光激化学发光免疫检测方法还可以用于光激化学发光仪器的质控检验。如可将发光微粒包被标记蛋白(如生物素)，感光微粒包被抗标记蛋白(如亲和素)，采用前述条件进行激发光照射并检测发射光量。通过保持一种微粒的浓度，调节另一种微粒的浓度、反应温度以及反应时间，来控制反应发射光子数的多少和信号强弱，而后通过对仪器检测数据的统计分析，进行质控检验。具体实施例方式下面结合实施例进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明，而非限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法及未说明配方的试剂均为按照常规条件或者制造商建议的条件进行或配置。实施例1_3为质控检验中的参数选定研究实施例h质控微粒的制备1.生物素标记的Y—球蛋白(BGG)的制备用0.1MNaHC03将BGG(购自Pel—FreezBiological)配制成lmg/ml溶液，采用DMS0(二甲基甲酰胺)配置Biotin-X-X-NHS(N-羟基琥珀酰亚胺修饰生物素,生产商SIGMA，产品号B3295)溶液至16.172mg/ml，取5.4ulBiotin-X-X-NHS至lmgBGG溶液中，混合均匀并在4'C下放置过夜。采用100mM磷酸缓冲液(pH7.0)透析纯化蛋白。2.采用上述标记蛋白包被醛基修饰的发光微粒在lmg醛基修饰的发光微粒(美国PentaTek公司)中加入12.5u11%Tween-20，0.05mg上述步骤1获得的透析纯化的蛋白以及10li1的NaC(25mg/ml)，加0.1Mp朋.0MES至总体积为200ul，37。C避光孵育48h。加入10u1的0.3MCM0溶液，37。C避光孵育lh。加190y1pH8.0的Tris溶液。4°C13000g离心30分钟。弃上清，用lmlpH8.0的Tris溶液再洗一次。用200u1PH8.0的Tris溶液悬浮(其终浓度为5mg/ml)。3.质控微粒工作液配制采用pH8.0的Tris溶液将(2)中悬液稀释到10ug/ml，分装保存。实施例2:亲和素包被的感光微粒试剂的制备感光微粒采用粒径为220土40nm的感光微粒(美国PentaTek公司)制备方法a、感光微粒混悬液处理吸取一定量的感光微粒于高速冷冻离心机中离心，弃去上清，加入一定量MES缓冲液，超声细胞破碎仪上超声至微粒重新悬浮，加入MES缓冲液调节感光微粒浓度至100mg/ml。b、亲和素溶液配制称量一定量Avidin，加MES缓冲液溶解至8mg/ml。c、混合将处理好的感光微粒混悬液、8mg/ml的Avidin以及MES缓冲液，以2:5:1的体积比进行混合，迅速混匀，得到反应液。d、反应MES缓冲液配制25mg/ml的NaBH3CN溶液，按照与反应液1:25的体积比加入，迅速混匀。37。C旋转反应48小时。e、封闭MES缓冲液配制75mg/ral的Gly溶液以及25mg/ml的NaBH3CN溶液，按照与反应液2:1:10的体积比加入上述溶液中，混匀，37'C旋转反应2小时。再加入200mg/ml的BSA溶液(MES缓冲液)，其与反应液体积比为5:8，迅速混匀，37"C旋转反应16小时。f、清洗向反应好的溶液中加入MES缓冲液，高速冷冻离心机离心，弃上清，加入新鲜MES缓冲液超声法重新悬浮，再次离心，如此清洗3次，最后用少量的感光试剂缓冲液进行悬浮，测定固含量，用感光试剂缓冲液调节浓度至10mg/ml。实施例3:检测的光学条件确定1.激发光的波长范围确定检测方法在反应孔中分别加入25W质控微粒(10ug/ml)，然后放入仪器一光激化学发光分析系统(博阳生物/上海北滨光子)，由仪器自动按以下步骤操作自动加入175W亲和素包被的感光微粒试剂(60ug/ml浓度)后37。C温育20分钟。仪器自动产生激光照射微孔计算每孔发光光子量。激发光波长范围确定激发光是指激光器所发射的激光。设定激发光光源功率为50nw，将激发光光源波长分别设定为600nm，620nm，640nm,660nm，680nra，700nm，激发光照射后1秒，进行发射光的检测，发射光检测波长设为620nm，按照上述检测方法每个波长检测质控微粒的光信号10孔，求质控微粒光信号均值及CV值。<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>根据上述结果选用620—800nm为激发光光源波长范围，640-680nm的效果更为理想，660nm效果最好。2.激发光的功率范围确定检测方法在反应孔中分别加入25W质控微粒(10ug/ml)，然后放入仪器(光激化学发光分析系统)，由仪器自动按以下步骤操作自动加入175W亲和素包被的感光微粒试剂(60ug/ml浓度)后37'C温育20分钟。仪器自动产生激光照射微孔计算每孔发光光子量。激发光功率范围确定设定激发光光源波长为660nm，将激发光功率分别设定为5nw，10mw，25nw，40mw，60mw，80mw，100raw;按照1的方法，激发光照射1秒，每个功率做10孔重复测定，分别检测质控微粒的光信号，求均值及CV值。<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>根据上述实验结果，优先选择激发光功率范围为40-60nw。3.激发光照射时间范围确定检测方法在反应孔中分别加入25W质控微粒(10ug/ml)，然后放入仪器(光激化学发光分析系统)，由仪器自动按以下步骤操作自动加入175W亲和素包被的感光微粒试剂(60ug/ml浓度)后37'C温育20分钟。仪器自动产生激光照射微孔计算每孔发光光子量。激发光照射时间范围确定设定激发光光源波长为660nm,将激发光功率设定为50mw，分别设定照射时间为50ms，100ms，200ms，400ms，500ms，800ms，1000ms，1200ms，1500ms,1800ms，2000ms;按照1的方法，每个照射时间做10孔重复测定，分别检测质控微粒的光信号，求均值及CV值。<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>根据上述实验结果，选择50ms-2000ms为激发光照射时间范围；优选200ms-1800ms为激发光照射时间范围，激发光最佳照射范围为500-1000ras。4.发射光的波长范围确定检测方法在反应孔中分别加入质控微粒(10ug/ral)，然后放入仪器(光激化学发光分析系统)，由仪器自动按以下步骤操作自动加入175W亲和素包被的感光微粒试剂(60ug/ml浓度)后37。C温育20分钟。仪器自动产生激光照射微孔计算每孔发光光子量。发射光波长范围确定发射光波长范围是指光子计数器索采集的光信号波长范围。设定激发光光源波长为660rnn，将激发光功率设定为50iw;采用滤波片，激发光照射后1秒，分别检测波长为580nm，600nm，610皿,615nm，620nm,630nm，650nm的发射光产生的光子数；质控微粒的光子计数方法按照上述方法检测，每个波长检测质控微粒的光信号10孔，求质控微粒光信号均值及CV值。<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>根据上述实验结果，确定用于检测计数的发射光波长范围为450-650nm，优先选用610-620nm。5.发射光的检测延迟时间范围确定检测方法-在反应孔中分别加入质控微粒(10ug/ml)，然后放入仪器(光激化学发光分析系统)，由仪器自动按以下步骤操作自动加入175H1亲和素包被的感光微粒试剂(按实施例3的方法制备，60ug/ml浓度)后37'C温育20分钟。仪器自动产生激光照射微孔计算每孔发光光子量。发射光的检测延迟时间范围确定检测延迟时间，是指在激光器照射后，到光子计数器开始采集光信号的时间。设定激发光光源波长为660nm，将激发光功率设定为50mw;检测发射光波长为615nm，检测延迟时间分别为50ms，75ms，100ms，200ms，600ms，800ms，1000ms，1200ms,1500ms;根据上述检测方法检测光信号。<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>根据实验结果，综合考虑，选择100-1000ras作为延迟时间范围。实施例4一6为双抗体夹心法检测中参数选定研究实施例4抗-HBe抗体包被的发光微粒的制备制备方法1)发光微粒混悬液处理吸取一定量的发光微粒于高速冷冻离心机中离心，弃去上清，加入一定量MES缓冲液，超声破碎至微粒重新悬浮，加入MES缓冲液调节发光微粒浓度至100mg/ml。2)抗体处理抗一HBe(厦门波生生物有限责任公司)于0.05MpH6.0的MES缓冲液(以下简称MES缓冲液)透析，透析完成后测定浓度，并调节浓度至8mg/ml。3)MES缓冲液、100mg/ml的发光微粒混悬液(MES缓冲液)和8mg/ml的抗一HBe(MES缓冲液)以及，以l:2:5的体积比进行混合，迅速混匀，得到反应液。4)用MES缓冲液配制25mg/ml的NaBH3CN溶液，按照与反应液1:25的体积比加入，迅速混匀，37°C旋转反应48小时。5)MES缓冲液配制75mg/ml的Gly溶液以及25mg/ml的NaBH3CN溶液，按照与反应液2:1:10的体积比加入上述溶液中，混匀，37'C旋转反应2小时。再加入200mg/ml的BSA溶液(MES缓冲液)，其与反应液体积比为5:8，迅速混匀，37'C旋转反应16小时。6)用MES缓冲液离心清洗三次，最后用发光试剂缓冲液进行悬浮，测定粒径和固含量，调节浓度至10mg/ml。实施例5生物素标记抗体的制备制备方法1)抗体处理将抗-HBe透析于0.1MNaHCO3溶液，测定抗体浓度并调节至lmg/ml。2)用DMSO配制16.17mg/ml的Biotin溶液。3)标记取处理好的lmg/ml抗-HBe标记抗体与配制好的Biotin溶液，二者按照10000:54的体积比进行混合，迅速混匀。28'C静置反应1216小时。4)透析将反应好的生物素标记抗体透析于生物素标记透析缓冲液(pH8.00)。5)将透析好的生物素化抗体吸出转移至干净离心管中，取样测定抗体浓度。将质检合格的生物素标记抗体浓度调节至0.5mg/ml。实施例6检测的光学条件确定研究中涉及的各个参数的检测方法如下l.光信号检测方法在反应孔中分别加入25WHBeAg浓度为5.0PEIU/ml的样品(使用Paul-Ehrlich-Institute(Virologicalstandards10/2001)出品的乙型肝炎e抗原定量参考品以新生牛血清为稀释液配制浓度为5.0PEIU/ml的溶液)，再依次加入25W发光试剂(实施例4制备，浓度调节为50ug/ml)和25W生物素化抗体试剂(实施例5制备，浓度调节为4ug/ml)。然后放入仪器(光激化学发光分析系统)，由仪器自动按以下步骤操作振动，37'C温育20分钟，再自动加入175ri亲和素包被的感光微粒试剂(实施例2制备，浓度调节为60ug/ml)后37'C温育15分钟。仪器自动产生激光照射微孔计算每孔发光光子量。2.激发光的波长范围确定设定激发光光源功率为50nw，(激发光照射后1秒检测波长为620咖的发射光)将激发光光源波长分别设定为600nm，620nm，640nra，660nm，680nm，700nm，每种实验条件做10孔重复测定，按照1的检测方法检测QcH的光信号均值和CV。<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>*QcH:HBeAg浓度为5.OPEIU/ml的样品根据上述结果选用620—700nm作为激发光光源波长范围，640-680nm效果更好，660nm效果最佳。3.激发光的功率范围确定设定激发光光源波长为660nm，(激发光照射后1秒检测波长为620nm的发射光)将激发光功率分别设定为5mw，10mw，25mw，40mw，60mw，80mw，100mw;每种实验条件做10孔重复测定，按照1的检测方法检测QcH的光信号均值和CV。<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>根据上述实验结果，优先选择激发光功率范围为40-60mw。4.激发光照射时间范围确定设定激发光光源波长为660nm，将激发光功率设定为50mw，分别设定照射时间为50ms，100ms，200ms，400ms，500ms，800ms，1000ms，1200ms，1500ms,1800ms,2000ms;按照1的方法，每个照射时间做10孔重复测定，分别检测QcH的光信号，求均值及CV值。<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>根据上述实验结果，选择50ms-2000ms为激发光照射时间范围；优选200ms-1800ms为激发光照射时间范围，激发光最佳照射范围为500-1000ms。5.发射光的波长范围确定设定激发光光源波长为660nm，将激发光功率设定为50mw;(激发光照射后1秒检测)采用滤波片，分别检测波长为580nm，600nm，610nm,615nm，620nm，630nm，650nm的发射光产生的光子数，做10孔重复测定；QcH的光子计数方法按照l的方法检测。<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>根据上述实验结果，确定用于检测计数的发射光波长范围为600-630nm，优先选用610-620nm，最佳为615nm。6.发射光的检测延迟时间范围确定设定激发光光源波长为660nm，将激发光功率设定为50mw;检测发射光波长为615nm，检测延迟时间分别为50ms，75ms，100ms，200ms，600ms，800ms，1000ms，1200ms，1500ms;做10孔重复测定，根据上述1的检测方法检测光信号。<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>根据实验结果，综合考虑，选择100-1000ms作为延迟时间范围。光激化学发光法的原理是利用感光微粒是填充有感光化合物的'高分子微粒，发光微粒是填充有发光化合物和镧系元素的高分子微粒。其核心原理是能量的近距离转移，转移的介质是高能态的离子氧。当红色激光照射感光微粒后，释放单线态氧离子(4ps)，其传播距离为200nm左右，只有当感光微粒和发光微粒的距离足够接近的情况下，感光微粒释放的单线态氧离子才能到达发光微粒，从而产生一系列化学反应。根据以上原理认为，感光和发光是由于微粒本身引起的。因此无论感光微粒上包被有何种基团或者抗体，它们对于激发光的波长和功率，应当有共同的反应趋势，而该反应趋势与微粒上所包被的基团或者抗体的种类和类别无关；同样，无论发光微粒上包被有何种基团或者抗体，它们的发射光波长和延迟时间也应具有同样的光谱或者趋势，而与发光微粒上所包被的基团或者抗体的种类和类别无关。根据以上的原理分析和实施例3及实施例6的数据基本吻合，因此认为，所选的光激化学发光实验条件是具备通用性的。权利要求1.一种光激化学发光免疫检测方法，包括下列步骤a、以620-700nm的激发光照射含有发光微粒及感光微粒的反应溶液；b、检测反应溶液的发射光量，发射光的检测波长选自450-650nm。2.如权利要求1所述光激化学发光免疫检测方法，其特征在于，所述步骤a以激发光照射反应溶液到步骤2检测反应溶液发光量之间有一检测延迟时间，其范围为10ms-1000ms。3.如权利要求1所述光激化学发光免疫检测方法，其特征在于，所述步骤a以激发光照射反应溶液的时间为50ms-2000ms。4.如权利要求3所述光激化学发光免疫检测方法，其特征在于，所述步骤a以激发光照射反应溶液的时间为200ms-1800ms。5.权利要求4所述光激化学发光免疫检测方法，其特征在于，所述步骤a以激发光照射反应溶液的时间为500-1000ms。6.如权利要求l一5中任一权利要求所述光激化学发光免疫检测方法，其特征在于，所述激发光的波长范围为640-680nm。7.如权利要求6所述光激化学发光免疫检测方法，其特征在于，所述激发光的波长为660nm。8.如权利要求1—5中任一权利要求所述光激化学发光免疫检测方法，其特征在于，所述发射光的检测波长范围为610-620nm。9.如权利要求8所述光激化学发光免疫检测方法，其特征在于，所述发射光的检测波长为615nra。10.如权利要求1_5中任一权利要求所述光激化学发光免疫检测方法，其特征在于，所述激发光光源的功率范围为5-100tmv。11.如权利要求10所述光激化学发光免疫检测方法，其特征在于，所述激发光光源的功率为40-60mw。12.如权利要求l一5中任一权利要求所述光激化学发光免疫检测方法，其特征在于，所述发光微粒及感光微粒包被有抗原或抗体。全文摘要本发明涉及光激化学发光技术，公开了一种光激化学发光免疫检测方法，包括下列步骤以620-700nm的激发光照射含有发光微粒及感光微粒的反应溶液；检测反应溶液的发射光量，发射光的检测波长为450-650nm。本发明经过研究光激化学发光免疫检测方法中激发光、发射光、检测时间等选择条件，给出了相应参数合适检测的选择范围，及优选的参数范围，从而使得光激化学发光免疫检测方法的可控性更强，灵敏度及精确度得到进一步地提高。文档编号G01N21/76GK101281137SQ20081003659公开日2008年10月8日申请日期2008年4月24日优先权日2008年4月24日发明者王海蛟,赵卫国申请人:博阳生物科技(上海)有限公司