专利名称：一种基于大粒径胶乳的增强型胱抑素c检测试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明涉及生物技术，特别是涉及一种基于大粒径胶乳的增强型胱抑素C检测试剂盒。
背景技术：
胱抑素C基因属“看家基因”，能在几乎所有的有核细胞表达，无组织学特异性，故 机体胱抑素产生率相当恒定。因胱抑素C是一种低分子量蛋白质，可经肾小球自由滤过，在 近曲小管被重吸收并降解，肾脏是清除循环中胱抑素C的唯一器官，所以血清胱抑素C浓度 主要由决定，由此可见胱抑素C是一种理想的反映变化的内源性标志物。胶乳增强免疫透射比浊法样品中的胱抑素C与试剂盒中的胶乳颗粒增强的抗胱 抑素C抗体试剂发生抗原-抗体反应，使反应液浊度增加，并在一定范围内反应液浊度与所 加的抗原的量呈正相关，在M6nm波长处测定反应液吸光度变化，其变化程度与样本中的 胱抑素C的含量呈正比。

发明内容
本发明所要解决的问题是建立一种基于大粒径胶乳的增强型胱抑素C检测试剂 盒，包括下述步骤1)利用真核表达系统制备重组人胱抑素C作为标准品和免疫原。2)用 自制重组人胱抑素C蛋白免疫山羊得到多克隆抗体。3)使用不同粒径胶乳与抗体进行交联 制备胱抑素C胶乳增强试剂盒，并与国际知名企业相关产品进行试剂盒相关参数的比较。所谓重组人胱抑素C是利用真核表达载体通过分子生物学等方法经克隆、表达、 纯化获得的与天然人胱抑素C具有相同免疫原性的高纯度重组蛋白。所谓使用的多克隆抗体是采用山羊作为宿主以真核表达获得的重组胱抑素C作 为免疫原，经免疫、亲和层析纯化获得的免疫球蛋白。所谓不同粒径的胶乳，我们采用了在50nm-150nm范围内选择IOOnm的胶乳以及在 151-300nm范围内选择200nm胶乳进行抗体的交联，交联方法选择了化学交联。所谓参数比较，我们选择了反应线性、最低检出量、抗干扰度、精密度这几个参数。 结果为我们自制的以200nm胶乳为材料的试剂盒性能最佳，且分析灵敏度、抗干扰度、精密 度均优于其他以相对小粒径胶乳为材料的自制与某国际知名商品化试剂盒。


图1是纯化后重组胱抑素C的SDS-PAGE图。1为胱抑素C蛋白，2为蛋白质分子 量 Maker。图2是利用北京九强胱抑素C胶乳增强免疫比浊试剂盒所做的校准工作曲线。其 中X轴表示胱抑素C的含量，Y轴表示吸光度。图3是胱抑素C系列稀释后理论值与测定值比较图。
图4是使用本发明的IOOnm粒径胶乳胱抑素C胶乳增强免疫比浊法试剂盒工作曲线。
3其中X轴表示胱抑素C的含量(mg/mL)，Y轴表示吸光度。
图5是200nm粒径胶乳胱抑素C胶乳增强免疫比浊法试剂盒工作曲线。其中X轴表示 胱抑素C的含量(mg/mL)，Y轴表示吸光度。
图6是某国际知名公司胱抑素C胶乳增强免疫比浊法试剂盒工作曲线。其中X轴表示 胱抑素C的含量，Y轴表示吸光度。
具体实施例方式以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。实施例1胱抑素C真核表达载体的构建及其表达、纯化1)胱抑素C真核表达载体的构建。按照胱抑素C的序列设计引物，上游弓丨物ATCGGGATCCTCCAGTCCTGGCAAG下游弓丨物CGGAATTCTTAATGATGATGATGATGATGGGCGTCCTGACAGGT，其中在上游引物引入BamHI酶切位点，下游引入EcoRI酶切位点及6X组氨酸标签 (划线部分表示)。以56度为退火温度进行PCR扩增，胶回收后，进行酶切，与同样用BamHI、 EcoRI消化的pcDNA3. 1 (+)载体连接并转化大肠杆菌DH5a，经过PCR鉴定，选择阳性重组子 进行测序鉴定。2)胱抑素C在CHO细胞中的表达经过测序鉴定正确的克隆，大量制备质粒，使用IipofectAMINE试剂，依据说明书 进行转染，加入G418 (0. 8mg/ml)，进行阳性克隆的筛选，将培养体系增大到1L，经过72小时 的培养收集细胞，采用超声破碎法破碎细胞，离心后收集上清，使用M柱进行亲和层析。经 过SDS-PAGE分析，蛋白大小为13KD左右与理论值相同，产量为;3mg/L。根据SDS-PAGE的条 带灰度估算蛋白浓度后，将蛋白浓缩到3mg/ml。实施例2使用北京九强公司胱抑素C检测试剂盒对纯化蛋白进行测定(1)先用迈瑞BS300全自动生化仪按照试剂盒说明书所说的方法步骤进行校准， 其工作曲线见附图二。(2)将纯化后的蛋白用蛋白保护液稀释到约8. 50 μ g/ml，用以上曲线测定三次， 结果均值为7. 80 μ g/ml。(3)用蛋白保护液将上面测定的蛋白倍比稀释成一系列值(包括原浓度和0浓 度的蛋白保护液)，即 7. 80 μ g/ml，7. 02 μ g/ml ,6. 24 μ g/ml，5. 46 μ g/ml，4. 68 μ g/ml， 3. 90 μ g/ml ,3. 12 μ g/ml，2· 34 μ g/ml，1· 56 μ g/ml，0· 78 μ g/ml，0 μ g/ml。(4)然后用生化仪对以上各浓度值测定三次取平均值，相关系数R > 0. 99，理论稀 释值与测定值比较图见附图三。实施例3胶乳自制试剂盒制备及不同粒径胶乳材料的试剂盒参数比较。1)胶乳的连接采用化学交联法，步骤如下 EDC 和硫代 NHS 活化 15min (PB Buffer)，振荡——20000rpm 离心 30min——弃上 清后用PB复溶，加抗体室温振荡反应2小时一加等量0. IM PH = 8. 0的甘氨酸缓冲液和10% BSA使终浓度为1%，反应半小时-—20000rpm离心30min——用R2稀释液复溶。R2稀释液为IOOmM Tris缓冲液2)试剂盒的测定试剂盒测定使用迈瑞BS300全自动生化仪，检测主波长为546nm，副波长为 670nm ；样品试剂比S Rl R2 = 3 200 50 ；终点法，即加入R2后半分钟开始读点，5min后再次读点，然后吸光度算差值。工作曲线测定工作曲线制备标准曲线选择5点校准，分别为0. 5 μ g/ml，1 μ g/ml，2 μ g/ml， 4yg/ml,8yg/mL·工作曲线结果见图4、图5、图6。可见使用200nm胶乳试剂盒的曲线相 关系数最高。精密度测定批内精密度测定随机抽取一个正常血清样本和肾病病人血清样本连续进行20次测定，按照 CV(% ) = SD/MeanX 100 进行计算。批间精密度测定用低值质控品和高值质控品选择3批试剂盒重复3次测定。按 照cv(%)=(均值最大值-均值最小值)/总均值X 100进行计算。精密性结果如表一、表二、表三、表四、表五、表六所示。结果显示使用200nm粒径胶乳为材料的试剂盒比同等条件下IOOnm粒径胶乳试剂 盒与某国际知名试剂盒具有精密度更高的特点。表一 IOOnm胶乳批内精密度结果
权利要求
1.一种基于大粒径胶乳的增强型胱抑素C检测试剂盒
2.根据权利要求1所述的胱抑素C检测试剂盒，其特征在于，它是基于免疫比浊法定量 检测样本中胱抑素C含量的试剂盒。
3.根据权利要求1所述的大粒径胶乳，其特征在于，试剂盒涉及的胶乳粒径在大于 150nm和小于300nm的范围内。
4.根据权利要求1所述的增强型，其特征在于该试剂盒性能比国际上知名的使用小粒 径胶乳的市售试剂盒性能较优。
5.根据权利要求4所述的性能，其特征在于包括不限于试剂盒的分析灵敏度、精密度、 抗干扰能力等。
全文摘要
本发明公开一种基于大粒径胶乳的增强型胱抑素C检测试剂盒。目前胱抑素C已经作为肾病早期检测的成熟指标。市场上已有市售的胶乳增强免疫比浊法试剂盒，但多为来源于国外的产品。胶乳与抗体的连接是该类试剂盒开发的最重要环节，不恰当地选择材料或者交联的方法会严重的影响试剂盒的质量。本发明使用大粒径的胶乳制备的胱抑素C检测试剂盒与选择小粒径胶乳的试剂盒相比具有反应性更好、精密度好、分析灵敏度高、抗干扰能力强的优点。
文档编号G01N33/68GK102095872SQ201010536358
公开日2011年6月15日 申请日期2010年11月8日 优先权日2010年11月8日
发明者华权高, 沈鹤霄, 许可 申请人:武汉生之源生物科技有限公司