专利名称：一种单细胞凝胶电泳试验检测水质遗传毒性的方法
技术领域：
本发明涉及一 种水质毒性的检测方法，具体涉及一种利用单细胞凝胶电泳试验使 水质遗传毒性可以定量检测的方法。
背景技术：
为了保障饮水安全，降低环境恶化给饮用水水质带来的威胁，人们常采用各种方 法对水质进行评价，以有效的掌握饮用水引起的健康风险。常用的检测水质毒性的方法有Ames试验法、微核试验法和单细胞凝胶电泳 (SCGE)试验法。SCGE试验法是近年来发展起来的用于检测单个哺乳动物细胞DNA链断裂 的新技术，具有敏感、简便、所需样品少等优点，得到了广泛的应用，其相对于Ames试验、微 核试验具有一定的优势。虽然SCGE试验法相对于Ames试验法和微核试验法早已作为规范 性方法，但单细胞凝胶电泳试验的试验方法和结果分析仍需进一步标准化，在分析结果时 仅是采用定性的方法判断毒性物质遗传毒性的大小，不同的人具有不同的判断标准，难于 统一，且实验时仅用空白样品作为对照，毒性反应不够直观，因此寻找一种直观、明确、结果 易于统一的方法对水质毒性进行检测是水质中毒性物质的定量化评价发展的需求。

发明内容
本发明针对现有水质遗传毒性检测方法的不足，提供了一种单细胞凝胶电泳试验 检测水质遗传毒性的方法，该方法将铬离子作为标准毒性物质，在评价水质遗传毒性时以 铬离子的浓度表示水质的遗传毒性，实现了水质毒性的定量化，而且检测结果更加直观、明 确，易于统一，为水质遗传毒性进行定量化评价提供了有力的支持。本发明是通过以下措施实现的
本发明选择六价铬离子作为标准毒性物质，六价铬离子是世界卫生组织致癌物名单中 的一种，在生活饮用水卫生标准中属于毒理指标，限值为0. 05mg/L，在地表水环境质量标准 中也有不同等级的限值，因此用铬离子浓度表示水质毒性结果易于统一，其操作为首先， 用小白鼠用不同浓度铬离子进行染毒，铬离子浓度范围应不引起小白鼠的死亡，能够引起 不同大小的olive尾距；然后通过单细胞凝胶电泳实验得到铬离子对olive尾距的标准曲 线，然后对待测水样进行单细胞电泳实验，将olive尾距代入标准曲线即可得到用铬离子 浓度表示的水样毒性，这种方法避免了其他实验因素所产生的影响，使水质毒性更加准确， 检测结果更易于统一。为了解决上述技术问题，本发明采用如下步骤
一种单细胞凝胶电泳试验检测水质遗传毒性的方法，其特征是至少包括以下步骤 (1)用不同浓度的Cr6+溶液对小老鼠分别进行染毒处理，然后将被不同浓度Cr6+染毒 的小白鼠脾脏的淋巴细胞分别进行单细胞凝胶电泳试验，经制备单细胞悬浮液、制作电泳 胶板、细胞裂解、DNA解旋、电泳、中和、染色、镜检与分析等步骤后，用CASP软件分析测量不 同浓度Cr6+染毒的DNA迁移的各种参数；(2)以Cr6+浓度为横坐标，olive尾距为纵坐标，绘制Cr6+对olive尾距的标准曲线；
(3)将小老鼠用浓缩富集的待测水样进行染毒处理，然后将小白鼠脾脏的淋巴细胞用 与步骤(1)同样的方法进行单细胞凝胶电泳试验，测量olive尾距；
(4)将待测水样所得的olive尾距代入Cr6+对olive尾距的标准曲线，即可得到Cr6+ 浓度表示的待测水样的水质毒性。上述方法中，其具体包括以下步骤
(1)以不同浓度的Cr6+溶液对小白鼠进行染毒处理；
(2)制备单细胞悬浮液按常规方法制取小鼠淋巴细胞，用PBS重新悬浮细胞，离心备
用；
(3)制作电泳胶板吸取150μL0. 8wt%的正常熔点琼脂糖滴到载玻片上，加盖玻片， 制成底层胶板；将90 μ L细胞悬浮液和90 μ L0. 7wt%的低熔点琼脂糖混和，迅速滴到底层 胶板上得第二层胶；将100 μ L0. 7wt %的低熔点琼脂糖滴到第二层胶上得三层胶，每层胶 均在3-5°C固化；
(4)细胞裂解将步骤(3)中的盖玻片移开，将载玻片浸入0-4°C裂解液中，裂解 l-2h ；
(5)DNA解旋将不同浓度铬离子染毒的载玻片水平并列置于电泳槽阳极端，电泳槽中 的碱性电泳缓冲液覆过载玻片，放置30-40min ；
(6)电泳调整电泳仪的电压为25V，电泳15-20min；
(7)中和、染色电泳结束后，加入Tris-HCl缓冲液，将载玻片淹没15-20min，吸干 Tris-HCl，再缓缓加入无水乙醇，将载玻片浸埋l_2h，吸取乙醇，存好可用于镜检；
(8)镜检与分析将各载玻片加入EB染色剂染色后，用荧光显微镜观察，用随机软件 在自动曝光条件下拍照获取彗星图像后，用CASP软件分析测量DNA迁移的各种参数；
(9)以Cr6+浓度为横坐标，olive尾距为纵坐标，绘制Cr6+浓度对olive尾距的曲线；
(10)将待测水样进行浓缩富集后对小老鼠进行染毒处理，然后按步骤 (2)- (8)的方法对小白鼠进行单细胞凝胶电泳试验，测得olive尾距；
(11)将水样染毒的olive尾距代入Cr6+浓度对olive尾距的曲线，即可得 到Cr6+浓度表示的待测水样的水质毒性。上述步骤(1)中，用不同的Cr6+溶液对小白鼠进行5d的染毒处理。上述方法中，Tris-HCl缓冲液的浓度为0. 4mol/L，pH为7. 5。上述方法中，对水样进行浓缩富集的过程是取待测水样，以40mL/min的速度用 活化后的XAD-2树脂吸附，然后用乙酸乙酯洗脱，洗脱液在50°C下浓缩至所需体积。
本发明的有益效果是本发明的主要创新点是选择Cr6+为标准毒性物质，通过Cr6+对 olive尾距的曲线实现对水质毒性的定量化评价，本发明的方法能更加直观、准确的检测水 质的遗传毒性，结果易于统一，重现性好，能够对水质污染状况做出判断，为突发性水质污 染和水厂的水处理技术提供支持，降低由于饮用水暴露导致的人类致癌风险。


图1为实施例1中Cr6+浓度对olive尾距的标准曲线。
具体实施例方式下面通过具体实施例对本发明进行进一步阐述，应该明白的是，下述说明仅是为了解释本发明，并不对其内容进行限定。本发明所用的铬离子溶液均是采用重铬酸钾配制而成的。所用裂解液为2.5MNaCl, IOOmM Na2EDTA, IOmM Tris，1% 肌氨酸钠，1% Triton X-100，10% DMSO ；
所用的碱性电泳缓冲液配方组成为lmM Na2EDTA和300mM NaOH，调pH > 13，临用前将 两种溶液等体积混合。实施例1
取日常城市饮用自来水作为待测水样，对水样进行浓缩富集处理，过程为取100L水 样，以40mL/min的速度用活化后的XAD-2树脂进行吸附，吸附后，用乙酸乙酯洗脱，洗脱液 在50°C下浓缩至10mL。本具体实施例采用如下步骤
(1)选择小白鼠脾脏的淋巴细胞作为指示生物，在铬离子浓度0.025-0. 5mg/L的范 围内取6个浓度点分别对小白鼠进行5d的染毒处理，这六个浓度点的铬离子浓度分别为 0. 025mg/L、0. 05mg/L、0. Img/L、0. 15mg/L、0. 25mg/L、0. 5mg/L ；
(2)制备单细胞悬浮液剖出小白鼠的脾脏，用磷酸缓冲液漂洗，加ImL磷酸缓冲液，用 眼科剪刀剪碎后，吸取上清液，向上清液中加入淋巴细胞提取液，离心后，吸取淋巴细胞；
(3)电泳胶板的制作吸取150μ L 0.8 正常熔点琼脂糖，加盖玻片，在4°C左右固 化IOmin左右，制成底层胶板，吸取90 μ L细胞悬浮液与90 μ L0. 7wt %的低熔点琼脂糖混 和，迅速将细胞混合液滴到第一层胶上，在4°C左右固化IOmin左右，制成第二层胶，再滴加 100 μ L 0. 7wt%的低熔点琼脂糖，在4°C左右固化IOmin左右，制成第三层胶；
(4)细胞裂解移开盖玻片，将载玻片浸入新配制的4°C裂解液中，在0-4°C下裂解 l-2h ；
(5)DNA解旋将载玻片水平并列置于电泳槽阳极端，电泳槽中盛有新配制的碱性电泳 缓冲液，碱性电泳缓冲液约覆过载玻片2. 5mm，放置30-40min ；
(6)电泳调整电泳仪的电压为25V(恒压)，电泳15-20min ；
(7)中和、染色电泳结束后，加入0.4mol/L Tris-HCl (pH=7. 5)缓冲液，将载玻片淹 没15-20min，吸干Tris-HCl，再缓缓加入无水乙醇，将载玻片浸埋l_2h，吸取乙醇，存好可 用于镜检；
(8)镜检与分析各组载玻片加入EB染色剂(溴化乙锭染色剂)染色后，用荧光显微镜 观察，用随机软件在自动曝光条件下拍照获取彗星图像后，用CASP软件分析测量DNA迁移 的各种参数，铬离子浓度从小到大所得的olive尾距分别为25、32. 5,30,52. 5,45,62. 5 ；
(9)以Cr6+浓度为横坐标，olive尾距为纵坐标，绘制Cr6+对olive尾距的标准曲线， 见图1。(10)将浓缩富集后的水样对小白鼠染毒处理，后续同(1)- (9)，所得待测水样的 olive尾距为65. 5，将实验结果代入Cr6+对olive尾距的曲线，得该水样的水质毒性相当于 0. 767mg/LCr6+ 的毒性。实施例2
取日常城市水厂的进厂水作为待测水样，对水样进行浓缩富集处理，过程为取40L水 样，以40mL/min的速度用活化后的XAD-2树脂进行吸附，吸附后，用乙酸乙酯洗脱，洗脱液在50°C下浓缩至10mL。采用与实施例1的方法绘制Cr6+对olive尾距的标准曲线，该曲线与图1基本一 致，然后将浓缩富集后的水样对小白鼠染毒处理，步骤与实施例1相同，所得待测水样的 olive尾距为50. 1，将实验结果代入Cr6+对olive尾距的标准曲线，得该水样的水质毒性相 当于0. 225mg/LCr6+的毒性。实施例3
取日常城市水厂的生产性试验工艺出水作为待测水样，对水样进行浓缩富集处理，过 程为取20L水样，以40mL/min的速度用活化后的XAD-2树脂进行吸附，吸附后，用乙酸乙 酯洗脱，洗脱液在50°C下浓缩至10mL。采用与实施例1的方法绘制Cr6+对olive尾距的标准曲线，该曲线与图1基本一 致，然后将浓缩富集后的水样对小白鼠染毒处理，步骤与实施例1相同，所得待测水样的 olive尾距为40. 1，将实验结果代入Cr6+对olive尾距的标准曲线，得该水样的水质毒性相 当于0. 102mg/LCr6+的毒性。
权利要求
1.一种单细胞凝胶电泳试验检测水质遗传毒性的方法，其特征是至少包括以下步骤(1)用不同浓度的Cr6+溶液对小老鼠分别进行染毒处理，然后将被不同浓度Cr6+染毒 的小白鼠脾脏的淋巴细胞分别进行单细胞凝胶电泳试验，经制备单细胞悬浮液、制作电泳 胶板、细胞裂解、DNA解旋、电泳、中和、染色、镜检与分析等步骤后，用CASP软件分析测量不 同浓度Cr6+染毒的DNA迁移的各种参数；(2)以Cr6+浓度为横坐标，olive尾距为纵坐标，绘制Cr6+对olive尾距的标准曲线；(3)将小老鼠用浓缩富集的待测水样进行染毒处理，然后将小白鼠脾脏的淋巴细胞用 与步骤(1)同样的方法进行单细胞凝胶电泳试验，测量olive尾距；(4)将待测水样所得的olive尾距代入Cr6+对olive尾距的标准曲线，即可得到Cr6+ 浓度表示的待测水样的水质毒性。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征是具体包括以下步骤(1)以不同浓度的Cr6+溶液对小白鼠进行染毒处理；(2)制备单细胞悬浮液按常规方法制取小鼠淋巴细胞，用PBS重新悬浮细胞，离心备用；(3)制作电泳胶板吸取150yL0.8wt%的正常熔点琼脂糖滴到载玻片上，加盖玻片， 制成底层胶板；将90 μ L细胞悬浮液和90 μ L0. 7wt%的低熔点琼脂糖混和，迅速滴到底层 胶板上得第二层胶；将100 μ L0. 7wt%的低熔点琼脂糖滴到第二层胶上得三层胶，每层胶 均在3-5°C固化；(4)细胞裂解将步骤(3)中的盖玻片移开，将载玻片浸入0-4°C裂解液中，裂解1- ；(5)DNA解旋将不同浓度铬离子染毒的载玻片水平并列置于电泳槽阳极端，电泳槽中 的碱性电泳缓冲液覆过载玻片，放置30-40min ；(6)电泳调整电泳仪的电压为25V，电泳15-20min；(7)中和、染色电泳结束后，加入Tris-HCl缓冲液，将载玻片淹没15-20min，吸干 Tris-HCl，再缓缓加入无水乙醇，将载玻片浸埋1-池，吸取乙醇，存好可用于镜检；(8 )镜检与分析将各载玻片加入EB染色剂染色后，用荧光显微镜观察，用随机软件在 自动曝光条件下拍照获取彗星图像后，用CASP软件分析测量DNA迁移的各种参数；(9)以Cr6+浓度为横坐标，olive尾距为纵坐标，绘制Cr6+对olive尾距的曲线；(10)将待测水样进行浓缩富集后对小老鼠进行染毒处理，然后按步骤(2)-(8)的方 法对小白鼠进行单细胞凝胶电泳试验，测得olive尾距；(11)将水样染毒的olive尾距代入Cr6+对olive尾距的曲线，即可得到Cr6+浓度表示 的待测水样的水质毒性。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征是步骤(1)中，用不同的Cr6+溶液对小白鼠进 行5d的染毒处理。
4.根据权利要求2所述的方法，其特征是Tris-HCl缓冲液的浓度为0.4mol/L，pH为7. 5。
5.根据权利要求2所述的方法，其特征是对水样进行浓缩富集的过程是取待测水样， 以40mL/min的速度用活化后的XAD-2树脂吸附，然后用乙酸乙酯洗脱，洗脱液在50°C下浓 缩至所需体积。
全文摘要
本发明提供了一种单细胞凝胶电泳试验检测水质遗传毒性的方法，步骤为采用不同浓度的Cr6+溶液对老鼠进行染毒处理，然后将染毒后的小白鼠脾脏的淋巴细胞分别进行单细胞凝胶电泳试验，测得不同浓度Cr6+染毒的olive尾距，绘制Cr6+对olive尾距的标准曲线，将小老鼠用浓缩富集的待测水样进行染毒处理，然后采用同样的方法测得水样处理的olive尾距，带入标准曲线得到Cr6+浓度表示的待测水样的水质毒性；本发明选择Cr6+为标准毒性物质，通过Cr6+对olive尾距的曲线实现对水质毒性的定量化评价，本发明的方法能更加直观、准确的检测水质的遗传毒性，结果易于统一，重现性好，能够对水质污染状况做出判断。
文档编号G01N27/447GK102128872SQ20101058082
公开日2011年7月20日 申请日期2010年12月9日 优先权日2010年12月9日
发明者孙韶华, 宋艳, 张诺, 贾瑞宝 申请人:济南市供排水监测中心