专利名称：用于检查是否易患心血管疾病的方法
技术领域：
本发明涉及一种检查人体是否易患心血管疾病的新方法。
背景技术：
心血管疾病，特别是动脉和静脉血栓症，是工业化国家最贫乏的引起高死亡率的病症之一。
遗传和外界因素是导致血栓症的原因。血栓症的广泛流行以及已知环境的影响(例如，使用口服避孕药物)表明，许多基因导致人们易患这种疾病。
实际上，导致血栓症增加的某些遗传缺陷已经地区化以及特性化(Lane DA，Mannucci PM，Bauer KA，Bertina RM，Bochkov NP，Boulyjenkov V，Chandy M，Dahlback B，Ginter EK，Miletich JP，Rosendaal FR，Seligsohn U.遗传性血栓症倾向(InheritedThrombophilia)第1部分.Thromb Haemost 1996；76651-662)。
然而，一般说来，要得到与造成人们易患血栓症的遗传因素相关的重要信息是很难的。而且，把这些已知的发生率相对较低的变异作为造成血栓症的主要因素又是没有依据的。
最近，本发明的发明人将那些易患血栓症的遗传组成和相关表现类型定量化(Souto JC，Almasy L，Borrell M，Gari M，Marinez E，Mateo J，Stone WH，Blangero J，Fontcuberta J.在西班牙家庭中止血表现型的遗传决定因素(Genetic determinants of hemostasis phenotypes in SpanishFamilies)，Circulation，1011546-1551.2000；Souto JC，Almasy L，Borrell M，Blanco-Vaca F，Mateo J，Soria JM，Coll I，Felices R，Stone W，Fontcuberta J，Blangero J.遗传导致易患血栓症以及在生理危机因素方面的相互联系GAIT研究(Genetic susceptibility to thrombosis and itsrelationship to physiological risk factorsThe GAIT study)，Am J HumGenet 671452-1459，2000)，因此可以发现，因子XII的程度表明其中最高遗传率(67％)以及重要遗传正相关性(0.351)，这说明某些引起生理危机因素变化的基因也会影响血栓症危机。
另一方面，这种疾病的早期诊断非常重要，特别是在那些表现出某些遗传变化却没有患病，但属于高危的人群中，而作为与这些疾病有关的次级并发症是可以避免的。
然而，当利用合适的诊断辨认个体遗传危机引起心血管疾病，特别是血栓症时，现有的遗传学中却缺少引起血栓症危机的相关知识体系，因为，如上所述，这是一种多基因因素的疾病(其中某些基因是相互关联的)。
本发明的目的是通过提供一种方法解决在诊断心血管疾病中的问题。本方法允许在由标记D5S400和D5S408限定的染色体5位置辨认至少一个等位基因的变异，以确定哪些人因为遗传因素而呈现出易患心血管疾病的征兆。

发明内容
本发明的目的在于检查至少一个用于XII因子蛋白质编码的基因上的等位基因的变异，由于变异的等位基因的异质接合体或同质接合体个体是那些更易患心血管疾病的人，这对于遗传诊断非常有用。它表现出非常高的预见性，特别是在本发明所述的心血管疾病方面。
本发明涉及到一种用于监测人体中至少一个等位基因变异是否存在的方法，所述方法包括(i)从所述人体获取生物样品，(ii)鉴别生物样品的遗传材料中是否存在至少一在染色体5的位置的等位基因的变异，所述染色体5由标记D5S400和D5S408限定，所述等位基因变异的存在表明个体易患心血管疾病。
本发明针对个体的辨认，这些个体目前还没有引发疾病，但却因为在所述染色体位置存在至少一个等位基因变异而使其易患心血管疾病，成为高危人群。
在本发明的一个实施例中，从人体所获得的生物样品优选为血液。
本发明中，术语“遗传材料”是指从生物样本上提取的DNA序列。从生物样本上提取DNA可以利用本领域已知的任何方案实现(例如，在文献Miller SA，Dykes DD，Polesky HF(1988)中描述的一种样本盐析的方法用于从人体有核细胞提取DNA(A simple salting outprocedure for extracting DNA from human nucleated cells)。核酸资源(Nucleic Acid Res)161215)。
在优选的实施例中，在用于XII因子蛋白质编码的基因中，本发明的方法要求辨认至少一个等位基因的变异情况。
本发明中，术语“等位基因变异”是指在用于XII因子蛋白质编码的DNA序列中所发生的遗传变异，所述遗传变异包括病理上的变异，以及功能丧失或者功能获得。特别是影响哪些易患的心血管疾病的病理学上的所述遗传变异。
人体上用于蛋白质XII因子编码的基因序列在许多数据库中都有记载，例如OMIM数据库，其中，用于蛋白质XII因子编码的基因序列的访问编号为234000.004。
遗传标记D5S400和D5S408在某些数据库中也有记载，例如基因组数据库(Genome DataBank)或人类基因数据库(the Data Bank ofHuman Genome)。所述标记是染色体5位置168.576.667bp(D5S400)和180.015.997(D5S408)(从染色体5的起始处开始计数的碱基础对(bp)的数目)。
在本发明的另一个优选实施例中，在生物样本的遗传材料中对至少一个等位基因变异情况的辨认操作包括以下步骤(iia)辨识用于XII因子蛋白质编码位置的染色体组，(iib)检测放大片断上是否存在至少一个等位基因变异。
所述用于XII因子蛋白质编码位置的放大通过本领域的已知技术实现，如聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction，PCR)。
可以利用本领域已知的方案实现在放大的染色体片断中检测至少一个等位基因变异的情况，例如对那些在任何限制酶中通过PCR得到的DNA片断进行分类的方法，限制酶是用于生成正常人体、异质接合体的载体以及同质接合体的载体上的电泳组段的微分模型。
本发明还包括对包括由标记D5S400和D5S408限定的染色体5位置中发生的等位基因变异(46C/T)的易患病生物样本的使用方法，以用于判定是否易患表现为血栓症的心血管疾病。
这里存在大量的不同类型的表现为血栓症的心血管疾病，例如急性心肌梗塞、缺血性脑血管意外、深度静脉血栓症、肺栓塞等。
本发明一个有益效果在于，本发明不需要特殊或者复杂的技术；实际上，使用的技术通常是熟悉本领域人员所知道的。本发明关键在于，在由标记D5S400和D5S408限定的染色体5位置处检测至少一个等位基因变异，以用于判定那些未发病的人群是否易患心血管疾病。
而且，利用本发明的方法，可以辨认那些对心血管疾病分子角度进行有益理解的遗传因子，特别是那些与血栓症相关的，这一点有利于设计更有效的疾病预防和治疗方法。
而且，在用于XII因子蛋白质编码的基因序列中辨认一个或多个等位基因的变异具有保健作用，因为如果一个人被检查认为其用于XII因子蛋白质编码的基因中有一个或多个等位基因发生变异，而他仍然没有发病，就此可以对其设计预防或治疗的方案。
本发明因此允许辨认那些影响易患血栓症的基因位以及它们的中间表现型。本发明的有益效果还在于，通过允许在疾病的前期阶段进行诊断，因此降低了因血栓症引起的死亡率。
分子遗传领域的研究者目前广泛关注于所有导致心血管疾病的遗传因子列表的生成。理想中，这个列表将有助于在不同环境下成形的血栓症知识体系的完善，还有助于针对个人的遗传概况设计治疗和预防的方法(Holtzman NA，Marteau TM.遗产学将革新药物体系？(Will genetics revolutionize medicine？)。N Engl J Med 2000 Julio 13；343(2)141-4)。本发明构成了诊断和预防心血管疾病之前的重要步骤。
以下，将以非限定的说明，描述本发明的一实施例。
具体实施例方式
下文所附的实施例中描述了在用于蛋白质XII因子的基因中判定等位基因的变异情况。
1.在用于蛋白质XII因子编码的基因中等位基因变异的辨认首先，从调节目标(250个健康个体)和病人(250个易被诊断的个体)身上采集血液样本。一旦已经采集血液样本，利用任何已知标准方法都可提取其DNA(Miller SA，Dykes DD，Polesky HF(1988)一种对采样样本盐析以用于提取人体核细胞中DNA的方法.NucleicAcid Res 161215)。利用PCR技术，在标准条件下，可以获得用于分析的具体染色体片断。
其次，在所获得染色体片断中至少一个等位基因的变异可以被辨认。可以利用本领域已知的任何方法实现此目的，例如放大片断的引导序列，利用限制酶(如上文所述)或通过具体的荧光标记配种探测方法进行分类。
特别地，举例说明，在用于蛋白质XII因子编码的基因中一个等位基因的变异可以被辨认出，例如已知的46C/T，因为它的位置与转录的起始位置相关。
诊断依赖于通过对一个包括369对碱基的染色体片断进行PCR放大实现DNA分子的分析，所述碱基包括核苷46C/T。上述诊断还利用用于辨认变异序列的限制酶SfaNI进行分类。变异等位基因的放大片断利用SfaNI在片断247和122pb进行分类(Kanaji T，OkamuraT，Osaki K，Kuroiwa M，Shimoda K，Hamasaki N，Niho Y(1998)与在血浆因子XII标准处低转译效率和降低相关的在凝结因子XII基因的第五个未转译区存在的普通遗传多态现象(46C由T取代)(Acommon genetic polymorphism(46 C to T substitution)in the5’-untranslated region of the coagulation factor XII gene is associatedwith low translation efficiency and decrease in plasma factor XII level)。Blood 912010-2014)。
利用PCR放大369pb片断具体核苷酸序列核苷酸1SEQ.ID NO1核苷酸2SEQ.ID NO2PCR MIX(连接酶master mix ref.M7502)Master mix12.5μl
核苷酸12.5μl核苷酸22.5μlDNA4μl水 3.5μl最终体积 25μlPCR程序应用生物体系PCR 97005′95℃1′95℃1′55℃x 30周期1′72℃10′72℃检测利用酶SfaNI类首先，将依靠限制酶SfaNI产生分类所必需的反应物解冻。在试管中加入如下试剂5μl of PCR生成物(去油)*0.1μl SfaNI**5μl NEBuffer0.5μl BSAH2Oc.s.p.50μl
*从病人、正常异质接合体和同质接合体的调节体获取**酶总必须总是处于良好的溶液中将混合物摇匀，以14000rpm离心分离5秒种，将其置于37℃炉灶上放置一夜。
最后，在4℃的情况下反应停止，然后用14000rpm离心分离5秒种结果-结构的说明获得369pb放大的片断。
通过比较Phi标记组段的模式，对正常等位基因以及携带等位基因变异46C/T(变异等位基因)酶SfaNI对分类的组段识别。
组段测量正常等位基因 C 369(1段)变异等位基因 T 247/122(2段)-等位基因变异46C/T结果的解释只观察到仅一个包括369对碱基的组段的个体是用于正常等位基因的同型结合体，也就是说他们是两个C等位基因的携带者(分别定位于两个染色体5上，染色体5的基因用于XII因子蛋白质编码)。
观察到369对碱基的一个组段以及247/122对碱基的另两个组段的个体分别是正常和变异等位基因的异质接合体，也就是他们是在其中之一染色体5上C等位基因(正常)的携带者和另一个染色体5上等位基因T(变异)的携带者。
仅观察到两个组段的个体，其中一个247碱基对另一个122对碱基(缺少369对碱基的组段)，是变异等位基因的同质接合体，也就是，他们是两个T等位基因(变异)的携带者，分别处于染色体5上的T等位基因，染色体5上的基因用于XII因子蛋白质编码。
序列表<110>圣达克鲁斯和圣保罗医院研究所和私人基金会<120>用于检查是否易患心血管疾病的方法<130>A155816<140>
<141>
<150>ES 200200308<151>2001-01-31<160>2<170>3.1版专利<210>1<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列说明SEQ.ID NO1<400>1ccagtcccac tatctagaaa a 21<210>2<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列说明SEQ.ID NO2<400>2atggctcatg gctgtgatag 20
权利要求
1.用于检测人体是否存在至少一个等位基因变异的方法，其特征在于，所述方法包括(i)从人体获取生物样本；(ii)鉴别生物样品的遗传材料中是否存在至少一在染色体5的位置的等位基因的变异，所述染色体5由标记D5S400和D5S408限定，所述等位基因变异的存在表明个体易患心血管疾病。
2.权利要求1所述方法，其特征在于，所述生物样本为血液。
3.权利要求1所述方法，其特征在于，所述等位基因变异在用于XII因子蛋白质编码的基因上。
4.权利要求1或3所述方法，其特征在于，还包括(iia)辨识用于XII因子蛋白质编码位置的染色体组，(iib)检测放大片断上是否存在至少一个等位基因变异。
5.使用易染病生物样本，该样本包括由标记D5S400和D5S408限定的染色体5上至少一等位基因变异，从而确定是否易患表现为血栓的心血管疾病。
全文摘要
包括以下步骤(i)从人体获取生物样本；(ii)鉴别生物样品的遗传材料中是否存在至少一在染色体5的位置的等位基因的变异，所述染色体5由标记D5S400和D5S408限定，所述等位基因变异的存在表明个体易患心血管疾病。所述方法中，使用易染病生物样本，该样本包括由标记D5S400和D5S408限定的染色体5上至少一等位基因变异，从而确定是否易患表现为血栓的心血管疾病。本方法允许对人体测试其是否易患心血管疾病，也因此可以设计合理的预防和治疗计划。
文档编号G01N33/48GK1738907SQ03802895
公开日2006年2月22日 申请日期2003年1月30日 优先权日2002年1月31日
发明者约地·方克伯特伯杰, 约塞·曼约·索弗拿得 申请人:圣达克鲁斯和圣保罗医院研究所和私人基金会